竹荪(Dictyophora indusiata)为鬼笔科竹荪属名贵食用菌,具有较高经济价值。研究表明,其提取物对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、霉菌和酵母菌等均有抑菌作用[1-4];王博阳等[5]对比4种溶剂提取效果,发现乙酸乙酯提取物抑菌效果最优。该提取物成熟子实体分菌盖、菌体(菌裙和菌柄)、菌托,菌盖约占鲜重的20%。生产中商品竹荪仅加工菌体,菌盖、菌托等副产物被丢弃,不仅造成资源浪费,而且会引发环境污染[6]。从化学成分的角度分析,竹荪菌盖与菌体之间既存在成分同源性,又具有显著的差异性。这种兼具共性与特性的成分特征,为从菌盖中挖掘新型活性物质提供了重要的理论依据,同时也凸显了开展菌盖相关专项研究的必要性[7]。
腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)为革兰氏阴性菌,广泛分布于淡水、海水及沉积物等环境中,不仅是水产品领域典型的特异性腐败菌[8-9],更是冷藏后期大黄鱼的优势腐败菌株[10],对水产品保鲜品质构成严重威胁。针对该菌的防控,生物抑菌剂因其安全、高效的特性成为极具应用潜力的技术策略,其中天然植物源抑菌成分兼具天然性、环境友好性与食用安全性,既能有效抑制腐败菌增殖扩散,又不会对水产品食用安全性产生显著负面影响,具备突出的开发与应用价值[11-12]。孙晓红等[13]研究发现,棘托竹荪提取物可通过破坏菌体细胞膜完整性、调控特征基因表达干扰代谢的路径抑制副溶血性弧菌,但目前尚未见针对竹荪菌盖部位,以靶向腐败希瓦氏菌为主的水产品优势腐败菌的相关研究报道,这进一步凸显了本研究开展竹荪菌盖提取物对该特定腐败菌抑菌机制探究的必要性与创新性。
本研究系统探究竹荪菌盖乙酸乙酯提取物对S.putrefaciens的抑菌活性及作用机制,采用硅胶柱层析法分离纯化提取物,以各组分对该菌的抑菌效果为指标筛选最优活性组分,并结合LC-MS分析其核心化学成分,旨在为竹荪资源的高值化利用及天然食品防腐剂的研发提供理论支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
竹荪(Dictyophora indusiata)菌盖干品,福建省邵武市绿农食用菌有限公司;腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens),上海保藏微生物技术中心;乙酸乙酯、甲醇、石油醚、丙酮、乙醇(分析纯);200～300目硅胶粉,青岛海洋化工有限公司;营养琼脂(nutrient agar,NA),常德比克曼生物科技有限公司;胰酪大豆胨液体培养基(tryptic soy broth,TSB),青岛海博生物科技有限公司;超微量Na+-K+-ATP酶试剂盒,南京建成生物工程研究所;PBS,北京兰杰柯科技有限公司。
1.2 仪器与设备
N-1100旋转蒸发仪,上海爱朗仪器有限公司;OptiCLean1300洁净工作台,力康生物医疗科技控股有限公司;BPC-250F生化培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;Feyond-A300酶联免疫分析仪,杭州奥盛仪器有限公司;722N可见分光光度计,上海佑科仪器仪表有限公司;DDS-307A电导率仪,上海仪电科学仪器股份有限公司;Pro4055E冻干机,南京金实仪器设备有限公司;F-7100荧光分光光度计,日立高新技术公司。
1.3 实验方法
1.3.1 提取物成分分析
1.3.1.1 提取物的制备
竹荪菌盖(50±1) ℃烘干至恒重,粉碎过80目筛,以乙酸乙酯为提取剂,于恒温磁力水浴搅拌锅中冷凝回流提取,料液比1∶26.7(g∶mL)、73.2 ℃提取2.6 h(本课题组前期优化的提取条件),离心(8 000 r/min,20 min),上清液真空抽滤,滤液旋蒸浓缩至黄褐色膏状物,提取物用正己烷萃取除杂,离心(8 000 r/min,10 min),取沉淀即为竹荪菌盖提取物。
1.3.1.2 硅胶柱层析分离提取物
干法装柱,称取35 g硅胶粉加入至层析柱中,用石油醚∶乙酸乙酯=9∶1(体积比)装柱,并用加压球将硅胶压实。干法上样,取3 g提取物溶于甲醇溶液,加入10 g硅胶粉,混合搅拌均匀静置,待甲醇挥发完毕,加入至层析柱中。用石油醚∶乙酸乙酯=9∶1、7∶3、5∶5、3∶7、1∶9(体积比),分别淋洗2～3个柱体积,控制流速为1 mL/min,每管(15±2) mL,每个柱体积90 mL,最后用甲醇冲柱。以石油醚∶乙酸乙酯=1∶1(体积比)为展开剂,TLC展开后挥干溶剂,迅速竖直放入碘缸,不与缸底滤纸、碘结晶直接接触,密封显色1～5 min至出现清晰黄棕色斑点,取出后立即用铅笔标记斑点位置,用紫光灯观察,将相似组分合并。
1.3.1.3 LC-MS分析
色谱条件为Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(1.8 μm,2.1 mm×100 mm),流动相为含0.1%(体积分数)甲酸的超纯水(A)与乙腈(B),经梯度洗脱(0～10 min内A由95%降至1%再回升至95%);仪器柱温40 ℃,流速0.40 mL/min,进样量4 μL。质谱采用ESI±模式,离子化电压3 500/3 200 V,鞘气、辅助气均为30/5Arb,离子传输管与雾化温度320/300 ℃;MS1/MS2扫描84～1 250 Da,分辨率35 000/17 500,碰撞电压30/40/50 V等,候选离子数10,动态排除3 s。
1.3.2 抑菌实验
1.3.2.1 样品预处理及菌株活化
用无菌水将各组分提取物配制成100 mg/mL的抑菌液,并过0.22 μm无菌滤膜除菌。配制NA和TSB,121 ℃灭菌15 min。将S.putrefaciens接入NA培养基,置于恒温培养箱中30 ℃培养24 h,传代1次。用接种环挑取菌株于无菌水中,成倍稀释制成菌悬液,并将菌悬液浓度调整为107～108 CFU/mL。
1.3.2.2 抑菌圈直径及最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)、最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)的测定
采用平板打孔法[14],取菌悬液0.1 mL,均匀涂布于NA平板制成含菌板。用7 mm打孔器在含菌板上打孔,每孔加入0.1 mL抑菌液,将各含菌板30 ℃恒温培养24 h,采用十字交叉法测量抑菌圈直径,以0.1 mL无菌水作为对照。
MIC的测定采用倍比稀释法[15],在96孔板中向每个孔中加入0.1 mL TSB,取0.1 mL 100 mg/mL抑菌液加入第1孔,混匀后重取0.1 mL至第2孔,依次连续稀释至第8孔,弃去第8孔中0.1 mL溶液,分别向8个孔中加入0.1 mL菌悬液。第9孔加TSB和菌悬液为阴性对照;第10孔加TSB、无菌水和菌悬液为溶剂对照;第11孔只加TSB为空白对照。30 ℃培养12 h,用酶标仪测定其在600 nm处的OD值。
MBC的测定采用连续稀释法[16]。首先配制质量浓度为25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 3 mg/mL的系列梯度抑菌液,取0.1 mL腐败希瓦氏菌菌悬液与等量各浓度抑菌液充分混匀;同时设置2组对照,以0.1 mL菌悬液与0.1 mL无菌水的混合液作为阴性对照,以0.1 mL抑菌液与0.1 mL无菌水的混合液作为空白对照。将所有样品组与对照组的混合液30 ℃培养12 h后分别均匀涂布于NA平板,置于30 ℃恒温培养24 h后,观察并记录平板上的菌落生长情况。
1.3.2.3 扫描电镜
将S. putrefaciens于TSB肉汤培养基中培养至对数生长期,于4 ℃、5 500 r/min离心10 min,吸去上清液,重悬于PBS中,菌悬液重复离心洗涤3次。加入竹荪菌盖提取物,然后置于30 ℃、150 r/min恒温摇床中进行培养摇床中培养8 h。分别吸取上述培养好的菌液2 mL于离心管中4 ℃、5 500 r/min离心10 min,弃上清液。所得到的菌体用PBS重悬洗涤后,再以4 ℃、5 500 r/min离心10 min,后弃上清液。加入体积分数为2.5%的戊二醛溶液固定3 h,依次用体积分数为30%、50%、70%、90%、100%的乙醇溶液梯度洗脱,每次30 min,使用冷冻干燥机冻干。最后,将样品表面喷金后用扫描电镜观察表面腐败希瓦氏菌细胞的形态[17]。
1.3.2.4 二乙酸荧光素(fluorescein diacetate, FDA)染色实验[18]
前期操作同1.3.2.3节,在恒温摇床中培养8 h。取培养后的菌悬液于4 ℃、5 500 r/min离心10 min,弃上清液,所得到的菌体用PBS重悬,菌悬液重复离心洗涤3次,后吸出上清液,加入250 μL溶于丙酮的FDA(2 mg/mL),在常温下静置20 min,用PBS重悬洗涤3次,离心弃上清液,菌体重悬于7 mL PBS中。使用荧光分光光度计测定平均荧光强度,激发狭缝与发射狭缝为5 nm,FDA激发波长为297 nm,发射波长为527 nm。
1.3.2.5 电导率测定
前期操作同1.3.2.3节,各组分别在0、3、6、9、12 h时取样,通过电导率仪测定悬浮液中菌体细胞外的电导率。
1.3.2.6 超微量Na+-K+-ATP酶活力测定
前期操作同1.3.2.3节,各组分别在0、6、12时取样,4 ℃、5 500 r/min下离心5 min弃上清收集菌体,加入PBS重悬3次,菌悬液用超声细胞破碎仪在冰水浴中功率400 W破碎菌体,每次超声波时间为5 s,间隔5 s,破碎时间共5 min,破碎后的菌悬液于4 ℃、10 000 r/min条件下离心15 min,取上清液。采用超微量Na+-K+-ATP酶试剂盒检测上清液中该酶活力。
1.3.2.7 生长曲线测定
将S.putrefaciens和不同质量浓度的竹荪菌盖提取液,加入到TSB肉汤培养基中,并使其终质量浓度分别为CK、M1、M2、M3、M4。将其置于30 ℃、150 r/min恒温摇床中进行培养,从0 h开始,每隔2 h取一次样,在波长为600 nm处测定OD值。
1.4 数据分析
单项实验重复3次,结果以“平均值±标准差”表示。方差分析和多重比较采用SPSS 25,绘图使用Origin 2025。
2 结果与分析
2.1 硅胶柱层析结果及各组分抑菌活性
硅胶柱分离共收集79个馏分,以石油醚∶乙酸乙酯=1∶1(体积比)为展开剂,经薄层层析检测后,用碘缸显色,紫光灯观察,将相似组分合并。馏分1～15检测到1个斑点,其比移值(retardation factor,Rf)为0.81,将其合并后编号为Fr-1;16～43检测到3个斑点,其Rf值分别为0.68、0.46、0.35,将其合并后编号为Fr-2;44～72检测到1个斑点,其Rf值为0.15,将其合并后编号为Fr-3;73～79检测到1个斑点,其Rf值为0.01,将其合并后编号为Fr-4,初步分离得到4个混合物组分,如表1所示。
表1 各分离组分
Table 1 Each separated component
组分Fr-1Fr-2Fr-3Fr-4质量/g0.026 50.088 80.286 81.157 1得率/%1.3254.4414.3457.85
抑菌活性实验结果如图1所示,经过分离后的提取物4个组分中,Fr-1和Fr-4抑菌活性较弱,Fr-2和Fr-3具有较强的抑菌活性,且显著高于粗提物Fr-0(P<0.05),说明竹荪菌盖乙酸乙酯提取物的抑菌活性物质主要分布在中等极性范围内,且通过分离可富集提取物的抑菌有效成分。将具有较强的抑菌活性的组分Fr-2和Fr-3进行混合进行后续实验。
图1 各分离组分抑菌圈直径
Fig.1 Inhibition zone diameter of each separated component
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.2 LC-MS分析
结合多级质谱的碎片离子、碎片种类和碎片相对丰度对目标成分进行鉴定,并与自建的二级质谱数据库进行匹配,以此实现竹荪菌盖提取物中化学成分的定性和定量分析。非靶向液相色谱-飞行时间质谱技术检测过程中,体系会产生大量碎片信息,其中未能匹配到对应标准物质的碎片离子占据总离子流图峰面积的一定比例,进而导致最终鉴定出的目标化合物相对含量普遍偏低。如图2～图3所示,在正离子检测模式下,从总离子流图中筛选出匹配可靠度>0.9且相对占比>0.01%的化合物共24种;在负离子检测模式下,满足上述相同筛选条件的化合物为8种。上述32种化合物的详细信息均按相对含量由高到低的顺序整理于表2中。分析可知2-甲基苄醇相对含量最高,属于芳香族醇类化合物。
图2 正离子模式TIC图
Fig.2 Total ion chromatogram in positive ion mode
图3 负离子模式TIC图
Fig.3 Total ion chromatogram in negative ion mode
表2 Fr-2和Fr-3化学成分分析结果
Table 2 Fr-2, Fr-3 chemical composition analysis results
物质名称物质一级分类保留时间/min质荷比相对含量/%物质名称物质一级分类保留时间/min质荷比相对含量/%2-甲基苄醇苯及其衍生物1.921 8105.069 94.644,6-二氨基-5-甲酰氨基嘧啶杂环化合物1.102 4136.061 62.10N-甲基苄胺生物碱1.930 2122.096 61.6(S)-3-氨基-2-甲基丙酸氨基酸及其衍生物2.21586.060 50.613-羟基戊酸有机酸2.824 2117.054 80.492-酮基-L-古龙酸有机酸1.218 1175.024 10.453-羟基壬酸有机酸4.997 3173.117 50.25反式,反式-1,3-丁二烯-1,4-二羧酸有机酸2.722 5143.033 60.244-乙炔基苯胺苯及其衍生物4.886 2118.065 20.223-甲基二氧吲哚生物碱2.778 9146.059 90.213-羟基-2-甲基吡啶杂环化合物1.051 1110.060 20.10间苯二酚酚酸类3.288109.028 90.09
续表2
物质名称物质一级分类保留时间/min质荷比相对含量/%物质名称物质一级分类保留时间/min质荷比相对含量/%L-酪氨酰-L-谷氨酸氨基酸及其衍生物2.429 310.114 70.08苯甲醇苯及其衍生物1.223 591.054 30.071-乙酰基哌啶杂环化合物3.716128.1070.071,2,4-苯三醇酚酸类3.428 1127.0390.05对乙酰氨基酚生物碱2.383 6152.070 50.054-甲氧基苄醇苯及其衍生物4.170 7180.101 90.05N-乙酰-D-半乳糖胺其它类1.720 9186.076 10.053-羟基癸酸有机酸3.490 8247.155 80.04苯乙酮其它类4.558121.065 10.04水杨醇;邻羟基苄醇酚酸类4.619 7107.049 10.044-羟基吲哚生物碱2.565 9134.060 10.032-氨基-2-甲基丁酸有机酸2.665 8118.086 50.03异麦芽酚杂环化合物2.093 6127.038 70.02酮脱氧壬酸有机酸0.827249.061 10.021-哌啶甲醛杂环化合物2.779114.091 30.02L-赖氨酸乙烯缩醛氨基酸及其衍生物3.015 4377.192 70.02间甲苯甲酸苯及其衍生物4.877 5151.075 20.02邻甲酚酚酸类2.715 4153.055 50.02苯丙氨酸亮氨酸氨基酸及其衍生物3.576 9279.170 50.014-异丙基-3-甲基苯酚苯及其衍生物5.736 6151.111 50.01
2.3 MIC和MBC结果分析
由图4-a可知,竹荪菌盖提取物对S.putrefaciens的生长具有较强的抑制作用,较低浓度即可抑制其生长,并且随着质量浓度的升高,抑制作用显著增加(P<0.05)。经12 h培养后,Fr-2、Fr-3和Fr-0分别在0.781 3和3.125 mg/mL浓度处差异显著(P<0.05),由此可知Fr-2,3和Fr-0的MIC分别是0.781 3和3.125 mg/mL。MBC是评价抗菌药物杀菌效果的关键指标,指能够杀灭培养基中99.9%以上测试菌的最低药物浓度[19]。竹荪菌盖乙酸乙酯提取物对S.putrefaciens的MBC测定效果如图4-b～图4-c所示,结果见表3,以刚好无菌落生长的含菌板所对应的竹荪菌盖提取物浓度作为MBC。图4-b中1～4对应的提取物浓度分别为Fr-2,3 6.25、3.125、1.562 5、0.781 3 mg/mL;图4-c中1～4对应的提取物浓度分别为Fr-0 25、12.5、6.25、3.125 mg/mL。由此可知Fr-2、Fr-3和Fr-0的MBC分别是6.25、25 mg/mL。综上,结合2.1节抑菌圈实验可知经过分离后的竹荪菌盖提取物比原竹荪菌盖提取物的抑菌效果更为显著。
a-MIC;b、c-MBC
图4 竹荪菌盖提取物对S.putrefaciens的抑菌效果图
Fig.4 Antibacterial activity of D.indusiata pileus extract against S.putrefaciens
表3 MBC结果
Table 3 MBC results
提取物提取物浓度/(mg/mL)2512.56.253.1251.562 50.781 3Fr-2和Fr-3---+++++Fr-0-+++++++++++
注：“+”代表有菌落生长,“+”越多代表菌落数量越多;“-”代表无菌落生长。
2.4 细胞形态测定结果
通过扫描电镜可观察竹荪菌盖提取物对腐败希瓦氏菌菌体损伤情况,结果如图5所示。处于对数生长期的对照组的S.putrefaciens呈现清晰的椭圆状结构,菌体饱满,表面平滑,细胞形态完整;在M1和M3处理条件下菌体开始出现轻微皱缩、变形,部分细胞表面光泽度下降,但整体轮廓仍较完整;在M2和M4处理条件下菌体的皱缩、凹陷更显著,部分细胞出现“坍塌”状变形,甚至可见菌体表面的破损、裂解迹象,细胞膜、细胞壁结构被破坏,细胞完整性丧失。结果表明,竹荪菌盖提取物可能破坏S.putrefaciens细胞膜完整性,破坏程度随着提取物浓度增大而增强,细胞内容物外泄,从而导致细菌死亡。
图5 竹荪菌盖提取物对S.putrefaciens菌体形态的影响
Fig.5 Effect of D.indusiata pileus extract on the cell morphology of S.putrefaciens
注:CK为空白对照组;M1(Fr-0-MIC)、M2(Fr-0-MBC)、M3(Fr-2+Fr-3-MIC)、M4(Fr-2+Fr-3-MBC)(下同)。
2.5 二乙酸荧光素(fluorescein diacetate,FDA)染色实验
FDA穿透细胞膜进入细胞后,可被胞内非特异性脂酶水解,生成具有黄绿色荧光的荧光素。该产物在激发波长488 nm、发射波长530 nm的条件下可被精准检测。当细胞膜结构完整时,荧光素无法自由穿透细胞膜,会滞留于胞内,此时可检测到显著的胞内荧光信号;而当细胞膜受损、通透性增加时,胞内荧光素会快速外流,导致胞内荧光强度显著下降。基于此原理,通过测定FDA水解产物的荧光强度,可直观反映细胞膜的通透性与结构完整性[18]。如图6所示,经竹荪菌盖提取物处理的S.putrefaciens菌株培养8 h后,处理组与空白组在500～520 nm波长内荧光强度呈现明显差异,且随着提取物浓度的升高,荧光强度的下降幅度呈逐渐增大的趋势。上述实验结果表明,竹荪菌盖提取物可破坏S.putrefaciens的细胞膜通透性与结构完整性,造成胞内荧光素外渗,最终表现为荧光强度的降低。
图6 竹荪菌盖提取物对S.putrefaciens荧光素强度的影响
Fig.6 Effect of D.indusiata pileus extract on fluorescein intensity of S.putrefaciens
2.6 电导率测定结果
细菌细胞膜对稳定胞内离子稳态具有关键作用,一旦细胞膜完整性遭到破坏,胞内K+、Ca2+、H+等阳离子会发生外泄,进而引起菌液电导率改变[20]。由图7可知,对照组的电导率仅呈轻微上升趋势,该现象可能与细菌自身的生理性自溶及自然死亡有关;而处理组M1、M2、M3、M4在12 h内的电导率持续升高,并显著高于对照组(P<0.05)。上述结果表明,体系电导率与提取物浓度呈正相关,这一变化规律与细胞膜通透性的改变直接相关。推测竹荪菌盖提取物作用于S.putrefaciens细胞膜后,其通透屏障功能受损,胞内Na+、K+等电解质大量渗漏,进而导致电导率显著上升。从细胞生理层面分析,竹荪菌盖提取物可对S.putrefaciens细胞膜形成显著损伤,不仅会造成细胞质外渗、驱动电解质渗出量持续增加,还会引发细胞膜流动性与通透性的异常改变,最终打破细胞内环境的稳态平衡,使细胞丧失正常生理状态的维持能力。
图7 竹荪菌盖提取物对S.putrefaciens电导率的影响
Fig.7 Effect of D.indusiata pileus extract on the conductivity of S.putrefaciens
2.7 超微量Na+-K+-ATP酶活力测定结果
Na+-K+-ATP酶(又称Na+-K+泵)是一种镶嵌于细胞质磷脂双分子层的跨膜载体蛋白,主要介导离子的跨膜转运过程。该酶的核心功能在于维持细胞内外离子浓度梯度稳态,保障胞内高K+、胞外高Na+的离子分布特征。同时,Na+-K+-ATP酶兼具催化活力,可通过水解腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)释放能量,为细胞生命活动供能,且在细胞凋亡进程调控中发挥关键作用[21]。由图8可知,对照组在12 h内Na+-K+-ATP酶未发生显著变化,而处理组M1～M4在12 h内的Na+-K+-ATP酶活力均随培养时间的延长呈持续性下降趋势,且不同处理组间存在明显浓度依赖性,其中M4组对S.putrefaciens菌株Na+-K+-ATP酶的抑制效果最为显著(P<0.05)。进一步分析其作用机制可知,竹荪菌盖提取物可靶向作用于S.putrefaciens细胞膜上的Na+-K+-ATP酶,通过抑制该酶的活力,阻断胞内ATP的水解供能途径。这一过程不仅会破坏细胞内外的离子平衡,还会直接干扰胞内蛋白质合成及新陈代谢等关键生理过程,最终诱导细胞凋亡。
图8 竹荪菌盖提取物对S.putrefaciens Na+-K+-ATP酶活力的影响
Fig.8 Effect of D.indusiata pileus extract on Na+-K+-ATPase activity of S.putrefaciens
注:大写字母不同表示不同处理组间差异显著(P<0.05);小写字母不同表示不同处理组内差异显著(P<0.05)。
2.8 生长曲线测定结果
细菌在培养基中增殖时,其菌悬液吸光度随菌浓度变化,在一定范围内,二者呈线性相关,故可通过吸光度表征菌浓度[22]。由图9可知,CK、M1及M3中的S.putrefaciens菌株,均在培养4～10 h进入对数生长期,14 h后其OD600值基本趋于稳定;且培养10 h后,M1与M3组的 OD600值显著低于CK组(P<0.05),表明低浓度提取物即可对S.putrefaciens生长产生抑制作用。从对数生长期启动时间分析,M2组S.putrefaciens对数生长期延迟至8～12 h,而M4组进一步延迟至10～14 h。结合各组抑制效果差异可知,竹荪菌盖提取物对S.putrefaciens的生长抑制作用随浓度升高而显著增强(P<0.05),且高浓度提取物能明显延缓S.putrefaciens对数生长期的启动。
图9 竹荪菌盖提取物对S.putrefaciens生长曲线的影响
Fig.9 Effect of D.indusiata pileus extract on the growth curve of S.putrefaciens
此外,M2与M4组在培养14 h后,S.putrefaciens的OD600值呈现明显下降趋势。鉴于这2组的处理浓度达到MBC,该现象表明,在MBC条件下,竹荪菌盖提取物不仅能够抑制S.putrefaciens生长,还可加速其进入衰亡期,进而促进细菌数量减少。
3 结论与讨论
本研究表明,竹荪菌盖提取物对S.putrefaciens具有显著抑菌活性,其MIC为3.125 mg/mL,MBC为25 mg/mL;经一次硅胶柱层析分离纯化后,其抑菌活性显著增强(P<0.05),MIC降至0.781 3 mg/mL,MBC降至6.25 mg/mL。通过LC-MS分析可知,分离纯化后提取物中相对含量最高的化合物为2-甲基苄醇。陈炳智等[23]对竹荪乙酸乙酯提取物进行分离纯化,得到抗菌活性较强的单体化合物间苯三酚,该化合物与本研究鉴定出的2-甲基苄醇同属芳香族含氧化合物,这一结果进一步佐证了竹荪菌盖乙酸乙酯提取物具有优异的抑菌活性。
结合细胞形态观察、胞内荧光强度分析、电导率、超微量Na+-K+-ATP酶活力及细菌生长曲线测定的结果,可明确竹荪菌盖提取物对S.putrefaciens的抑菌作用遵循“破坏膜结构-干扰能量代谢-抑制菌体增殖”的动态作用路径:提取物首先作用于菌体细胞膜,通过细胞形态可直接观察到菌体出现皱缩、变形甚至裂解的现象;胞内荧光强度的显著下降与菌悬液电导率的上升,则进一步证实细胞膜完整性被破坏、通透性增大,导致胞内电解质及大分子物质外泄;细胞膜结构的损伤会直接影响膜结合酶Na+-K+-ATP酶的活力,该酶是维持菌体离子平衡与能量代谢的核心功能酶,其活性受抑会阻断细胞能量供应,干扰菌体正常新陈代谢;最终,细菌生长曲线呈现明显的停滞甚至下降趋势,表明菌体的生长繁殖被有效抑制甚至死亡。这一作用机制与徐宇辰[18]报道的阿魏酸甲酯对S.putrefaciens的抑菌路径高度一致,后者同样观察到处理后菌悬液电导率升高,Na+-K+-ATP酶活力及胞内荧光强度降低的现象;张君霞等[17]关于石榴皮提取物通过降低芽孢杆菌Na+-K+-ATP酶活力发挥抑菌作用的研究结论也与此相符,共同证实干扰细胞膜功能与能量代谢途径是植物源抗菌物质抑制食源性致病菌的共性作用机制。
综上,本研究证实竹荪菌盖乙酸乙酯提取物对水产品优势腐败菌——S.putrefaciens具有显著的浓度依赖性抑菌活性,且提取物抑菌效果随浓度升高呈显著增强趋势(P<0.05)。当前竹荪抑菌活性的相关研究多聚焦于子实体部位,针对加工副产物菌盖的抑菌潜力挖掘与机制解析尚属空白。已有研究中,刘畅等[2]采用4种溶剂浸提竹荪子实体,证实其对大肠杆菌、沙门氏菌等常见食源性致病菌具有抑制作用,张永杰等[24]也发现长裙竹荪提取物对果蔬致腐菌具备防控效果,但均未涉及菌盖这一“废弃物”资源。本研究首次靶向竹荪菌盖,系统阐明其乙酸乙酯提取物对S.putrefaciens的抑菌活性,不仅填补了竹荪不同部位抑菌研究的空白,更为将菌盖这一加工副产物开发为天然、安全的水产品保鲜剂提供了直接实验依据,同时也为推动竹荪全产业链高值化利用、实现“变废为宝”的产业升级目标奠定了理论基础。
[1] 刘文波, 赵勇, 孙晓红, 等.竹荪提取物对食源性细菌的抑菌特性研究[J].微生物学杂志, 2013, 33(4):50-54.LIU W B, ZHAO Y, SUN X H, et al.Inhibition effects of Zhusun (Dictyophora spp.) extract on foodborne pathogens[J].Journal of Microbiology, 2013, 33(4):50-54.
[2] 刘畅, 周舟, 周枫.竹荪不同溶剂浸提液的抑菌及防腐效果研究[J].安徽农学通报, 2024, 30(17):89-92.LIU C, ZHOU Z, ZHOU F.Antibacterial and preservative effects of different solvents in the extract of Dictyophora indusiata[J].Anhui Agricultural Science Bulletin, 2024, 30(17):89-92.
[3] 郑旋, 杨玲, 王万坤, 等.不同提取方法对竹荪菌托多糖结构及抑菌性保湿性的影响[J].食品科技, 2024, 49(1):201-208.ZHENG X, YANG L, WANG W K, et al.Effects of different extraction methods on the structure and antibacterial and moisturizing properties of polysaccharides from the Volva of Dictyophora rubrovolvata[J].Food Science and Technology, 2024, 49(1):201-208.
[4] 林陈强, 林戎斌, 陈济琛, 等.棘托竹荪菌托抑菌物质提取、分离及活性组分[J].天然产物研究与开发, 2015, 27(11):1910-1916.LIN C Q, LIN R B, CHEN J C, et al.Extraction, separation and composition analysis of the antibacterial components from Volva of Dictyophora echinovolvata[J].Natural Product Research and Development, 2015, 27(11):1910-1916.
[5] 王博阳, 张宁宁, 陈丽燕, 等.不同提取剂对竹荪提取物抑菌效果影响[J].宁德师范学院学报(自然科学版), 2024, 36(1):77-82.WANG B Y, ZHANG N N, CHEN L Y, et al.Study on the bacteriostatic effect of Dictyophora indusiata extracts with different extractants[J].Journal of Ningde Teachers College (Natural Science), 2024, 36(1):77-82.
[6] 林陈强, 曹萌, 陈济琛, 等.棘托竹荪菌盖营养成分分析与评价[J].热带作物学报, 2016, 37(11):2089-2093.LIN C Q, CAO M, CHEN J C, et al.Analysis and evaluation of nutritional components of Dictyophora echinovolvata pileus[J].Chinese Journal of Tropical Crops, 2016, 37(11):2089-2093.
[7] 黎璐, 吕昱, 汤洪敏.长裙竹荪3部分石油醚提取物的对比[J].食品科学, 2014, 35(6):73-77.LI L, LYU Y, TANG H M.Comparisons of petroleum ether extracts of three parts of Dictyophora indusiata[J].Food Science, 2014, 35(6):73-77.
[8] 杨晋一, 耿珑瑶, 杨乔越, 等.苯乳酸-肉桂醛联用对腐败希瓦氏菌的协同抑菌效果及作用机制[J].食品与发酵工业, 2025, 51(15):80-87.YANG J Y, GENG L Y, YANG Q Y, et al.Synergistic bacteriostatic effect and mechanism of combination of phenyl lactic acid and cinnamaldehyde against Shewanella putrefaciens[J].Food and Fermentation Industries, 2025, 51(15):80-87.
[9] ZHU W X, CHENG Y H, ZHANG Y K, et al.Antibiofilm efficacies and mechanism of perillaldehyde against Shewanella putrefaciens[J].Food Microbiology, 2025, 128:104699.
[10] 林娇芬, 林旭吟, 卓泽晟, 等.冷藏大黄鱼腐败希瓦氏菌的鉴定与抑菌剂筛选[J].闽南师范大学学报(自然科学版), 2023, 36(2):110-119.LIN J F, LIN X Y, ZHUO Z S, et al.The identification and bacteriostat screening of the Shewanella putrefaciens in refrigerated Larimichthys crocea[J].Journal of Minnan Normal University (Natural Science), 2023, 36(2):110-119.
[11] 于淑池, 白家瑜, 吴慧, 等.仙人掌果皮提取物对腐败希瓦氏菌的抑制作用[J].海南热带海洋学院学报, 2025, 32(5):68-75.YU S C, BAI J Y, WU H, et al.Inhibitory effect of Cactus pericarp extract on Shewanella putrefaciens[J].Journal of Hainan Tropical Ocean University, 2025, 32(5):68-75.
[12] NIU L Y, LUO X Q, GU X Y, et al.Cinnamon essential oil as an antibacterial agent against Shewanella putrefaciens:Cell membrane disruption and metabolic dysfunction[J].Food Bioscience, 2025, 73:107546.
[13] 孙晓红, 赵宏强, 蓝蔚青, 等.棘托竹荪提取物对副溶血性弧菌的抑菌作用机制[J].中国食品学报, 2017, 17(3):260-267.SUN X H, ZHAO H Q, LAN W Q, et al.Antimicrobial mechanism of active substances from Dictyophora echinovolvata against Vibrio parahaemolyticus[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2017, 17(3):260-267.
[14] 贺秋桦, 刘梦龙, 郭启新, 等.雪地茶内生真菌Apiospora malaysiana体外抑菌活性及稳定性研究[J].食品工业科技, 2023, 44(21):146-153.HE Q H, LIU M L, GUO Q X, et al.Study on antimicrobial activity and stability of endophytic fungus Apiospora malaysiana from Thamnolia subuliformis in vitro[J].Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(21):146-153.
[15] MIGHRI H, HAJLAOUI H, AKROUT A, et al.Antimicrobial and antioxidant activities of Artemisia herba-alba essential oil cultivated in Tunisian arid zone[J].Comptes Rendus Chimie, 2010, 13(3):380-386.
[16] 司梦雅, 赵宏晶, 郝俊, 等.石榴皮提取物对副溶血弧菌的抑制效应与机制研究[J].水产学杂志, 2024, 37(2):70-76.SI M Y, ZHAO H J, HAO J, et al.Inhibitory effect and mechanism of pomegranate peel aqueous extract on Vibrio parahaemolyticus[J].Chinese Journal of Fisheries, 2024, 37(2):70-76.
[17] 张君霞, 于芳, 王倩宁, 等.石榴皮提取物对食源性芽孢杆菌膜脂过氧化过程的抑菌机理研究[J/OL].食品与发酵工业, 1-11[2025-12-16].ZHANG J X, YU F, WANG Q N, et al.Antibacterial mechanism of pomegranate peel extract on membrane lipid peroxidation of foodborne Bacillus[J/OL].Food and Fermentation Industries:1-11[2025-12-16].
[18] 徐宇辰. 阿魏酸甲酯对腐败希瓦氏菌的抑菌机制及其同轴静电纺丝膜的制备与保鲜应用[D].锦州:渤海大学, 2021.XU Y C.Antibacterial mechanism of methyl ferulate against Shewanella putrefaciens and preparation and preservation application of its coaxial electrospinning membrane[D].Jinzhou:Bohai University, 2021.
[19] 朱晓萍, 庄智威, 叶泽铭, 等.黄连等中草药对常见病原菌体外抑菌效果的研究[J].饲料研究, 2021, 44(7):98-101.ZHU X P, ZHUANG Z W, YE Z M, et al.Study on in vitro bacteriostatic effect of Chinese herbal medicines such as Coptis chinensis on common pathogens[J].Feed Research, 2021, 44(7):98-101.
[20] 杨胜平, 章缜, 程颖, 等.牛至精油对荧光假单胞菌的抑制作用及其对冷藏三文鱼品质的影响[J].食品科学, 2020, 41(1):215-222.YANG S P, ZHANG Z, CHENG Y, et al.Inhibitory effect of oregano essential oil against spoilage microorganism Pseudomonas fluorescens and its influence on quality changes during chilled storage of salmon[J].Food Science, 2020, 41(1):215-222.
[21] DIAO M M, QI D P, XU M M, et al.Antibacterial activity and mechanism of monolauroyl-galactosylglycerol against Bacillus cereus[J].Food Control, 2018, 85:339-344.
[22] 张军宁. 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)复合保鲜剂的研制及其抑菌机理初步研究[D].青岛:中国海洋大学, 2012.ZHANG J N.Development of a composite preservative for Litopenaeus vannamei and preliminary study on its antibacterial mechanism[D].Qingdao:Ocean University of China, 2012.
[23] 陈炳智, 杨立志, 郑丽珠, 等.长裙竹荪抑菌活性物质的分离纯化及其抑菌效果[J].菌物学报, 2020, 39(8):1568-1579.CHEN B Z, YANG L Z, ZHENG L Z, et al.Separation and purification of antibacterial component from Dictyophora indusiata and determination of its antibacterial effects[J].Mycosystema, 2020, 39(8):1568-1579.
[24] 张永杰, 江丽慧, 潘明, 等.超声波辅助提取长裙竹荪抑菌物质工艺优化及其抑菌活性研究[J].中国调味品, 2021, 46(4):50-54;60.ZHANG Y J, JIANG L H, PAN M, et al.Study on the technology optimization and antibacterial activity of ultrasonic-assisted extraction of antimicrobial substances of Dictyophora indusiata[J].China Condiment, 2021, 46(4):50-54;60.