表面活性素(surfactin)也被称为抗菌脂肽,主要由芽孢杆菌产生,具有良好的抗细菌、抗真菌[1]、抗肿瘤[2]、抗支原体[3]和抗病毒活性[4],在石油开采[5]、农业[6]、食品[7]、化妆品[8]等方面应用广泛。但由于天然菌株的产量低,surfactin的应用严重受限。

目前,采用基因工程改造和发酵条件优化提高surfactin产量成为研究热点。在基因工程改造方面,大致可分为启动子工程、脂肪酸链合成酶系强化以及竞争途径基因敲除这3类方法。在surfactin合成过程中,调控srfA合成酶的启动子PsrfA转录活性较弱,可通过替换PsrfA启动子来提升surfactin产量。如SUN等[9]利用天然强诱导型启动子Pspac替换PsrfA,将surfactin产量提升到3.86 g/L;WILLENBACHER等[10]将Bacillus subtilis 3A38中的原始启动子替换为Pveg启动子,将surfactin产量从0.07 g/L提升到0.26 g/L。surfactin以脂肪酸及氨基酸为前体物质进行合成[11],因此前体物质的合成将直接影响其产量。此外在surfactin合成过程中存在多个竞争途径,例如芽孢、生物膜(biofilm)以及聚酮合酶合成途径等,这些途径均可与surfactin合成竞争前体物质、ATP、NADPH等,致使其合成受阻甚至不能合成[12],因此可通过阻断这些竞争途径来促进surfactin产生。发酵条件也是影响surfactin合成的关键因素,对surfactin产量的提升较为显著,王军强等[13]对枯草芽孢杆菌B006发酵培养基组分进行了优化,较优化前提高了近75%,姬杨等[14]对短小芽孢杆菌BA06发酵培养基进行优化,surfactin产量提高了3.53倍。李萍等[15]通过Box-Behnken实验设计优化表面活性素的发酵工艺,发酵36 h后发酵液中生物表面活性素的溶血圈直径达到1.70 cm,比优化前提高了17.24%。

作为目前已被发现的最强生物表面活性剂,surfactin在各项领域应用前景极为广阔。但是,天然菌株的生产能力普遍较低,难以适应工业生产。因此,本研究以Bacillus subtilis ATCC 21332为出发菌株,利用基因重组技术和CRISPR-Cas9技术进行基因工程改造,构建了高产surfactin菌株,随后对工程菌株的发酵条件进行优化,以进一步提升surfactin产量,为surfactin的合成机制提供理论支持,为其工业化生产及应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒和引物序列

基因克隆宿主Escherichia coli JM109、出发菌株Bacillus subtilis ATCC 21332、pKSVT质粒,实验室保藏;pJOE8999质粒,北京百欧博伟生物技术有限公司,所用引物序列见表1。

1.2 主要仪器及试剂

S1000 PCR基因扩增仪,美国Bio-Rad公司;5910R高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司;LDZX-75KBS全自动高压灭菌锅,上海申安医疗器械厂;DYY-6C电泳仪,北京六一生物科技有限公司;1260InfinityIII高效液相色谱仪,安捷伦科技(上海)有限公司。

PrimeSTARMax DNA聚合酶、限制性内切酶(QuickCutTM Xba I、QuickCutTMSma I、QuickCutTM Bsa I、QuickCutTM Sfi I等),TaKaRa宝生物工程有限公司;Basic Mix无缝克隆酶,全式金有限公司;卡那霉素(kanamycin),生工生物工程(上海)股份有限公司;胰蛋白胨Tryptone、酵母粉Yeast Extract、酸水解酪蛋白,OXOID公司;EGTA,Solarbio公司;表面活性素标准品,上海源叶生物科技有限公司;小量DNA纯化试剂盒、小量DNA胶回收试剂盒、小量质粒DNA提取试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒,OMEGA公司。

LB(Luria-Bertani)培养基(g/L):胰蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10,于121 ℃、20 min高温高压灭菌。

SP(Spizizen salts母液)溶液(g/L):K2HPO4·3H2O 18.34、KH2PO4 6、(NH4)2SO4 2、柠檬酸钠1、MgSO4·7H2O 0.2。

SP Ⅰ培养基:195.2 mL SP溶液,800 μL 5%(质量分数)酪蛋白水解物,2 mL 10%(质量分数)酵母汁,2 mL 50%(质量分数)葡萄糖。

SP Ⅱ培养基:292.8 mL SP溶液,1.2 mL 5%(质量分数)酪蛋白水解物,3 mL 10%(质量分数)酵母汁,3 mL 50%(质量分数)葡萄糖。吸出3 mL后加入1.5 mL 100 mmol/L CaCl2和1.5 mL 500 mmol/L MgCl2,除葡萄糖溶液外其他培养基均121 ℃、20 min高温高压灭菌。

1.3 同源重组法替换PsrfA启动子

采用同源重组技术将出发菌株中的原始启动子PsrfA替换为其他3种强启动子:P43、Pveg、PamyE[10,16-17]。首先根据B.subtilis ATCC 21332基因组序列设计引物扩增靶基因上下游同源臂片段,利用表1中的引物对pKSVT-P-UF、UR,pKSVT-P-DF、DR,pKSVT-Promoter-F、R将上游同源臂(500 bp)、目的片段、下游同源臂(500 bp)融合获得修复片段,以限制性内切酶Xba I和Sma I对pKSVT载体进行双酶切,连接线性化载体与修复片段,将其化转至E. coli JM109,以sq-pKSVT-F、R进行菌落PCR验证及测序验证,验证成功后得到重组质粒pKSVT-P43、pKSVT-Pveg、pKSVT-PamyE。

通过化学转化法将以上重组质粒质粒导入B.subtilis ATCC 21332,参照BISWAS等[18]的方法对目标重组菌株进行筛选和验证,验证成功后采用引物Target-VF/VR对单克隆菌落进行菌落PCR验证,提取验证成功的菌株基因组交由苏州GENEWIZ公司测序验证。

1.4 CRISPR-Cas9基因编辑系统的构建

采用CRISPR-Cas9基因编辑技术分别敲除以下基因:phoP、codY、sinI、spoIIIE、spoIVB、sipW、tasA,得到7种基因缺陷型重组枯草芽孢杆菌。根据sgRNA的设计网站http://chopchop.cbu.uib.no/获得敲除靶点对应的sgRNA,经PCR扩增后,切胶回收得到含有20 bp的sgRNA基因片段。利用引物对pJOE-Target-UF、UR,pJOE-Target-DF、DR经融合PCR后获得修复片段:上游同源臂(500 bp)-下游同源臂(500 bp)。提取pJOE8999载体,将sgRNA片段连接至敲除载体pJOE8999的限制性位点Bsa I处,修复片段连接至限制性位点Sfi I处,经2次E.coli JM109的化学化转操作获得重组质粒pJOE-Target,所用引物见表1。

以sq-pJOE-F、R引物对重组质粒pJOE-Target进行PCR验证,将重组质粒导入B.subtilis ATCC 21332,参照ALTENBUCHNER[19]的方法对目标重组菌株进行筛选。

1.5 Surfactin含量测定

使用配制有全波长紫外检测器的高效液相色谱仪检测发酵上清液中的surfactin含量[20]。色谱条件:色谱柱为COSMOSIL 5C18-AR-II(4.6 mm×250 mm),进样量20 μL,流速0.8 mL/min,柱温35 ℃,检测波长210 nm,流动相A:乙腈[含0.1% (体积分数)三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)],流动相B:0.1%(体积分数)TFA的超纯水,梯度变化为:0～9 min,A 60%～93%,B 40%～7%;9～20 min,A 93%,B 7%;样品处理:将发酵液12 000 r/min,离心5 min,收集上清液,0.2 μm滤膜过滤待测。标准品制备及标准曲线测定:取2 mg surfactin标准品溶于1 mL甲醇中,0.2 μm滤膜过滤,上样测定,其代表性色谱图如图1所示,可见4个明显的吸收峰,由于surfactin存在多种同系物,将其不同同系物峰面积加和计算其总吸收峰的峰面积;配制系列浓度的surfactin标准品溶液,以总吸收峰的峰面积对surfactin浓度绘制标准曲线(y=110.45x+17.07,R2=0.991 2),并对样品中的surfactin浓度进行定量分析。

1.6 发酵条件优化

在基础培养基条件下,设置发酵的温度分别为16、25、30、37、45 ℃,装液量50 mL,接种量2%,初始pH 7.0,培养48 h,测定surfactin浓度;设置培养基pH值梯度为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,接种量2%,培养温度37 ℃,装液量为50 mL,培养48 h后测定surfactin浓度;设置接种量为1%、2%、4%、6%、8%(体积分数),初始pH 7.0,培养温度37 ℃,装液量50 mL(250 mL三角瓶),培养48 h后测定发酵上清液中的surfactin浓度;设置250 mL三角瓶中的装液量为:20、30、50、80、100 mL,接种量2%,初始pH 7.0,培养温度37 ℃,培养48 h,测定surfactin浓度;在基础LB培养基中添加2 g/L的前体氨基酸:亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu),在接种量2%,培养温度37 ℃,装液量为30 mL的条件下,培养48 h后,测定surfactin浓度。

1.7 数据处理与分析

以上实验均重复3次,结果表示为“平均值±标准差”,统计学差异通过单因素方差分析(analysis of variance,ANOVA)方法进行检验,使用SPSS软件进行显著性差异分析,Origin 2024软件进行数据处理和绘图。

2 结果与分析

2.1 不同启动子重组菌株的构建

利用同源重组方法将surfactin合成途径中操控srfA合成酶表达的启动子PsrfA分别替换为其他3种强启动子:P43、Pveg、PamyE,具体构建过程如图2-a所示。利用质粒提取试剂盒提取pKSVT-Promoter重组质粒,通过pKSVT测序引物sq-pKSVT-F、R(表1)进行菌落PCR,利用1%(质量分数)琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳分析,结果如图2-b所示,质粒pKSVT-Promoter的PCR产物在1 500 bp左右可见有明显的特异性条带,并且与目的片段的大小位置相符,表明质粒构建成功。经单、双交换后所得工程菌株于LB培养基37 ℃过夜培养,提取重组枯草芽孢杆菌基因组,以工程菌株基因组为实验组,WT基因组为对照组,使用引物对sq-ATCC-P-F、R(表1)进行PCR,得到敲除目的基因后的片段,WT与工程菌株PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果如图2-c所示。凝胶电泳图显示清晰的枯草芽孢杆菌原始基因组条带以及启动子替换后基因组条带,且在1 700、1 500 bp左右位置,片段大小与理论值相符,测序结果比对正确,表明重组菌株启动子替换成功。

2.2 基因缺陷型菌株的构建

利用单质粒CRISPR/Cas9基因组编辑系统,实现对B.subtilis ATCC 21332基因组的高效编辑。其具体构建过程如图3所示。

为探究srfA合成酶的表达及其他竞争途径对surfactin合成的影响,利用CRISPR-Cas9技术对B.subtilis ATCC 21332菌株中的phoP、codY、sinI、spoIIIE、spoIVB、sipW、tasA进行敲除。提取质粒pJOE-Target,通过测序引物sq-pJOE-F、R(表1)进行菌落PCR,利用1%(质量分数)琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳分析,结果如图4-a所示,在1 000 bp左右可见有明显的特异性条带,并且与目的片段的大小位置相符,表明含有sgRNA和修复片段的重组质粒构建成功。利用细菌基因组提取试剂盒提取重组枯草芽孢杆菌基因组,以B.subtilis ATCC 21332基因组为模板,经PCR得到敲除目的基因后的片段,以WT基因组为对照,得到WT与工程菌株PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果,见图4-b、图4-c:WT-codY (2 180 bp)、WT-phoP (2 123 bp)、WT-tasA (2 186 bp)、WT-spoIVB (2 681 bp)、WT-sinI (1 574 bp)、WT-sipW (1 973 bp)、WT-spoIIIE (3 764 bp);条带大小理论值与琼脂糖凝胶电泳结果相符,表明菌株敲除成功。

2.3 重组菌株surfactin产量分析

将所得的重组枯草芽孢杆菌ATCC-P43、Pveg、PamyE及7个基因缺陷型菌株进行摇瓶发酵。结果表明启动子替换后的重组菌株产量均有提升,其中启动子Pveg产量较高为3.59 g/L,较野生型菌株提高了28.2%(图5),说明这3种启动子的替换有效增强了srfA合成酶的转录水平,组成型启动子Pveg的转录能力更强。

基因缺陷型菌株中,phoP基因缺失型菌株产量为4.17 g/L,较野生型菌株提高了49%,PhoR/PhoP双组份系统是枯草芽胞杆菌中普遍存在的一种调控系统,相关研究表明,细胞壁形成相关的基因、磷酸转运蛋白相关基因以及surfactin合成相关基因srfAA等均与该基因的调控相关[21]。codY基因缺失型菌株产量为3.35 g/L,较野生型菌株提高了19.8%,说明作为srfA合成酶负调控因子codY确实对surfactin的合成起负反馈调节作用,这与GUO等[22]报道相符;sin I基因缺失型菌株产量为2.98 g/L,较野生型菌株提高了6.4%。

芽孢杆菌孢子形成关键基因中spoIVB基因的敲除有效提升了surfactin产量,而spoIIIE基因的敲除对surfactin产量的提升效果不明显,spoIVB基因缺陷型菌株产量为3.38 g/L,提高20.8%,基因spoIVB编码肽酶S55,在芽孢合成第4阶段催化皮层形成,该基因的缺失成功地阻止了成熟孢子的形成。spoIIIE基因缺陷型菌株产量为2.95 g/L,提高5.5%,基因spoIIIE编码孢子DNA移位酶,在芽孢合成的第2阶段中使母体细胞不对称分裂形成芽孢前体,敲除后可能导致孢子的形成受到抑制[23]。以上结果表明敲除孢子形成相关的基因后,可使营养物质和能量更多的用于surfactin的合成,从而使surfactin产量显著提升。

生物膜形成基因sipW、tasA的敲除显著提升了surfactin的产量。其中,sipW基因缺陷型菌株的产量为3.72 g/L,较野生型提高33%,tasA基因缺陷型菌株产量为3.44 g/L,提高22.8%,二者是生物膜形成的关键基因,与胞外脂蛋白与脂多糖合成有关,会与surfactin合成竞争前体骨架物质和能量,对surfactin的合成起负反馈调节作用,而胞外基质一旦合成,B.subtilis细胞将不再感应ComX群集效应信号,终止surfactin合成,因此,将其敲除可以显著提升surfactin产量[24]。

2.4 发酵条件优化

2.4.1 发酵温度对surfactin产量的影响

培养温度显著影响目标产物的合成,研究了发酵温度对surfactin产量的影响,结果如图6-a所示,当培养温度为25～37 ℃时,surfactin的产量随温度升高而增加,其中在37 ℃时相对产量最高,可达到2.8 g/L,而当培养温度为16 ℃和45 ℃时,未检测到surfactin。可能是温度对菌体中surfactin合成相关的酶活性影响较大,在较高/较低温度下,合成surfactin过程中的关键酶活性受到影响,从而影响surfactin的表达量。

2.4.2 发酵培养基pH对surfactin产量的影响

pH可能通过影响枯草芽孢杆菌中的其他蛋白活性而影响surfactin的合成,surfactin合成最佳pH值为7(图6-b)。pH值为6和8时,产物合成与最佳条件相比明显下降。pH值低于5时,完全无产物合成,因此在培养过程中应严格控制培养pH值在7左右,这可能是由于酸性环境抑制了膜蛋白Spo0K的活性,而Spo0K在surfactin合成过程中起重要作用,致使其合成受到强烈抑制[25]。

2.4.3 菌株接种量对surfactin产量的影响

接种量决定了菌体的生长速度,接种量过低菌体生长缓慢,发酵周期延长,代谢效率降低;接种量过高营养物质消耗过快,且溶氧量不足会使菌体生长代谢受到抑制[26]。本研究探究了菌株接种量对surfactin产量的影响,结果如图6-c所示。在接种量为1%～4%时,surfactin产量随着接种量的增加而增加,当接种量为4%时,surfactin的产量最高;其后随着接种量继续升高,产量反而降低,这可能是因为菌体接种量过大,导致培养基中的营养成分不足,主要用于合成生物量而使产物的合成受到影响。因此后续的实验中,采用4%作为最佳接种量。

2.4.4 培养基装液量对surfactin产量的影响

如图6-d所示,在装液量为20～100 mL/250 mL的范围内,surfactin产量随装液量的增加呈现先增加后降低的趋势,在装液量50 mL/250 mL时,surfactin产量达到最高的2.81 g/L。这是由于随着装液量的增加,摇瓶内溶氧量降低,不利于菌株生长,抑制了次级代谢产物surfactin产生。另外,由于30 mL/250 mL与50 mL/250 mL 装液量情况下,surfactin产量相差不大,后续实验将选择30 mL/250 mL作为发酵最佳装液量。

2.4.5 氨基酸种类对surfactin产量的影响

以基础LB培养基为基础,在其中添加4种surfactin合成途径的前体氨基酸(Glu、Asp、Val、Leu),探究不同的前体氨基酸对surfactin产量的影响,结果如图6-e所示。4种前体氨基酸中缬氨酸Val和天冬氨酸Asp对surfactin的合成无促进作用,亮氨酸Leu对surfactin的合成具有明显的抑制作用。可能是不同的氨基酸影响菌株对培养基中碳源及氮源的代谢及利用,在添加Leu和Val两种氨基酸后,菌株对培养基中营养物质的利用减弱,从而导致surfactin产量的降低。而谷氨酸Glu对surfactin的生长有明显的促进作用,这可能是因为谷氨酸水溶性更好,在发酵过程中更利于细菌利用;另外,Glu还可以转化为天冬氨酸Asp,两者共同促进surfactin产生,使其产量明显提高[27]。综上,在接种量为4%,装液量30 mL/250 mL,温度37 ℃,pH值为7,添加2 g/L谷氨酸的条件下,菌株发酵后surfactin产量最高。

2.4.6 最优发酵条件对重组菌株surfactin产量的影响

根据上述得到的最优发酵条件:接种量4%,装液量30 mL/250 mL,温度37 ℃,pH 7,2 g/L谷氨酸添加量,对WT和10株工程菌进行48 h发酵培养,经分离纯化后测定surfactin含量。相较于优化前,发酵条件优化后的菌株大部分产量提升了1.5～2倍,结果如图7所示,3种启动子P43、Pveg、PamyE重组菌株中,Pveg启动子重组菌株的产量较高,为5.39 g/L,较野生型菌株提高了92.5%;基因缺陷型菌株中,ΔsipW产量最高,约为5.98 g/L,较野生型菌株提高了113.6%,ΔtasA产量为5.44 g/L,提高94.3%;Δsin I产量为5.51 g/L,提高96.8%,ΔphoP产量为5.45 g/L,较野生型菌株提高了94.6%,ΔcodY产量为5.04 g/L,提高80.0%;ΔspoIVB产量为5.11 g/L,提高82.5%,ΔspoIIIE产量为4.43 g/L,提高58.3%;spoIIIE基因缺陷型菌株提高程度较小,与优化前的变化趋势基本一致。

3 结论与讨论

为提高B.subtilis ATCC 21332菌株的surfactin产量,通过同源重组技术和CRISPR-Cas9基因敲除技术对其进行分子改造。首先通过同源重组技术将原始启动子PsrfA更换为3种强启动子,结果表明启动子的替换可显著增强surfactin产量,其中Pveg替换后产量最高,可达3.59 g/L,相较于野生型提高了28.2%。使用CRISPR-Cas9技术敲除B.subtilis ATCC 21332菌株合成过程中负调控因子和竞争途径基因,包括srfA合成酶负调控因子(phoP、codY、sinI)、芽孢合成关键基因(spoIIIE、spoIVB)、biofilm合成关键基因(sipW、tasA),以进一步强化surfactin表达。7个关键基因敲除后surfactin产量均有提升,其中phoP基因敲除后surfactin产量最高,可达到4.17 g/L,相较野生型提高了49%。进一步,通过单因素试验优化了菌株的发酵条件,在接种量4%,装液量30 mL/250 mL,温度37 ℃,pH 7,谷氨酸添加量2 g/L的条件下,B.subtilis ATCC 21332菌株的surfactin产量最高。在此条件下,对10株工程菌株进行发酵,结果表明优化后菌株的surfactin产量均提升1.5～2倍。其中,surfactin产量最高的是菌株B.subtilis ATCC 21332-ΔsipW,达到5.98 g/L,相较野生型菌株提高了113.7%。研究结果为探究枯草芽孢杆菌中surfactin的高效合成提供了理论支持,为高产surfactin工程菌株的构建提供了一种有效的借鉴策略,对其工业化生产及应用奠定了理论基础。

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Construction of high-yield surfactin Bacillus subtilis and optimization of fermentation conditions

LU Xingmiao, QIN Lihong, ZHAO Danyang, LU Fuping, LIU Fufeng*

(College of Bioengineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

ABSTRACT Surfactin is a lipopeptide biosurfactant with good physicochemical properties and biological activity.However, natural bacterial strains exhibit low surfactin yield and high costs, severely limits its industrial application.Therefore, Bacillus subtilis ATCC 21332 served as the starting strain, homologous recombination and CRISPR-Cas9 gene editing, combined with fermentation condition optimization, were employed to enhance surfactin expression and yield.Homologous recombination was used to replace the native PsrfA promoter with three strong promoters.The highest yield was achieved with Pveg promoter, reached 3.59 g/L, which was 28.2% higher than the wild type.To further increase yield, seven key genes were knocked out by CRISPR-Cas9, including srfA synthase negative regulatory factors (phoP, codY, sinI), spore synthesis key genes (spoIIIE, spoIVB), and biofilm synthesis key genes (sipW, tasA).The results showed that knocking out the phoP gene resulted in the greatest increase, reached 4.17 g/L, which was 49% higher than the wild-type.Fermentation optimization identified the following optimal conditions:4% inoculum (volume fraction), 30 mL/250 mL loading, 37 ℃, initial pH 7, and addition of 2 g/L glutamic acid.Under these conditions, engineered strains achieved approximately 1.5-2.0-fold improvements in surfactin production.The highest yield was obtained from B.subtilis ATCC 21332- Δ sipW, reached 5.98 g/L after 48 h of fermentation, representing a 113.7% increase over the wild type.This study offers theoretical support for elucidating the biosynthetic mechanism of surfactin and lays a foundation for industrial production and application.

Key words surfactin;Bacillus subtilis;CRISPR-Cas9;optimization of fermentation conditions

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044359

引用格式：芦星淼,秦丽虹,赵丹阳,等.高产surfactin枯草芽孢杆菌的构建及发酵条件优化[J].食品与发酵工业,2026,52(11):18-26.LU Xingmiao, QIN Lihong, ZHAO Danyang, et al.Construction of high-yield surfactin Bacillus subtilis and optimization of fermentation conditions[J].Food and Fermentation Industries,2026,52(11):18-26.

第一作者：博士,讲师(刘夫锋教授为通信作者,E-mail:fufengliu@tust.edu.cn)

基金项目：国家重点研发计划项目(2024YFA0917900);国家自然科学基金项目(32272269);天津市合成生物技术创新能力提升行动项目(TSBICIP-PTJJ-010)

收稿日期：2025-08-29,改回日期:2025-10-29