表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-epigallocatechin gallate, EGCG]是一种存在于茶中的天然儿茶素,其本质为亲水性的黄酮-3-醇多酚,因其强大的抗氧化能力受到广泛关注[1]。二氢槲皮素(dihydroquercetin, DHQ)作为一种疏水性的黄酮类化合物,其丰富的酚羟基可以发挥出抗氧化、抗炎,抑菌等多种功效,已被正式批准为新资源食品[2],尽管这2种物质对人体健康有诸多好处,但由于其化学不稳定性、溶解性差异及易受环境因素影响等缺陷,极大限制了它们在食品中的应用。

目前,已开发出一些利用胶体递送系统对多组分进行包封的共递送体系[3-4],可有效地用于活性物质的负载,但这些体系的长期稳定性较差、封装效率低,尤其对于溶解性差异较大的活性成分,包封效果并不理想。因此,需要选择一种更加高效、稳定的体系来实现EGCG和DHQ的共递送。近年来,以生物大分子聚合物(如蛋白质、多糖)稳定的水包油包水(water-in-oil-in-water, W1/O/W2)双重乳液以其安全性高、乳化性能好、化学稳定性强等优势在食品领域备受关注。LI等[5]将乳清蛋白分离物分别与低甲氧基果胶、κ-卡拉胶形成复合物,制备了同时负载脂溶性维生素E和水溶性维生素B2的W1/O/W2双乳,有效解决了活性成分因溶解性差异大而不能直接组合的缺陷,并具有良好的缓释效果。HUANG等[6]将乳清蛋白浓缩物与高甲氧基果胶形成复合物,制备了同时递送亲水性熊果苷和疏水性香豆酸的W1/O/W2双乳,显著地提高了熊果苷和香豆酸的包封率及稳定性。乳清蛋白(whey protein, WP)是一组同时具有亲水和疏水基团的表面活性乳蛋白,可在油和水界面上构建内聚的黏弹性层,通过产生强大的排斥相互作用和削弱界面张力从而保护液滴免于聚结[7]。透明质酸钠(sodium hyaluronate, SH)是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺双糖构成的葡聚糖醛酸大分子多糖,可与蛋白通过静电吸附及氢键结合形成多糖-蛋白复合物,可在液滴混合层之间形成间溶电解质框架[8],从而有效地稳定乳液,保护包封物质的活性。目前尚无文献报道利用SH-WP复合物制备同时负载亲水性EGCG和亲脂性DHQ的W1/O/W2双重乳液。

基于此,本文开发了一种基于SH-WP复合物协同稳定的、同时负载亲水性EGCG和亲脂性DHQ的W1/O/W2双重乳液,并对SH-WP复合物的结构及所制备乳液的稳定性进行探究,旨在为EGCG、DHQ的开发及相关活性成分递送体系的构建提供有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DHQ,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;EGCG、橄榄油、聚甘油蓖麻醇酸酯(polyglyceryl-6 polyricinoleate, PGPR),上海麦克林生化科技有限公司;SH(食品级),济南华熙生物科技股份有限公司;WP,上海源叶生物科技有限公司;所用水为蒸馏水。

1.2 仪器与设备

UV-6100紫外分光光度计,上海元析仪器有限公司;Litesizer 500纳米粒度及zeta电位分析仪,安东帕(上海)商贸有限公司;VHX-7000超景深显微镜,香港基恩士公司;FV3000激光共聚焦扫描显微镜,日本奥林巴斯公司;V70 IR傅里叶红外光谱仪,德国布鲁克公司;J-1500圆二色谱仪,日本JASCO公司;FLS1000稳态/瞬态荧光光谱仪,英国Edinburgh公司;JY-82C视频光学接触角测量仪,河北承德鼎盛公司;Turbiscan tower功能稳定性分析仪,法国FORMULACTION公司。

1.3 实验方法

1.3.1 油相溶解度测定

参照李淑珍[9]的实验方法,精确称取DHQ 2 mg溶解后定容于50 mL棕色容量瓶中,加乙酸乙酯溶解至稀释刻度,得标准品溶液。将标准液进行梯度稀释,配制成0.005、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03 mg/mL的梯度溶液,以乙酸乙酯为空白,在波长190～800 nm利用紫外分光光度计进行扫描,绘制紫外吸收图谱,选取最适吸收峰。在λ=288 nm下,以标准液浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标作图,得到DHQ标准曲线。

选用橄榄油、玉米油、菜籽油、亚麻籽油、花生油、元宝枫子油、红花籽油、米糠油为油液。将过量的DHQ加入到定量(10 g)的油相中,在避光条件下恒温振荡12 h以使其饱和溶解,随后使用离心机将混合物以10 000 r/min离心10 min,取0.2 mL上清液经乙酸乙酯定容至10 mL容量瓶,摇匀,使用紫外分光光度法进行测定,计算DHQ在不同油中的溶解度。

1.3.2 W1/O/W2双乳的制备及工艺优化

制备W1/O初乳[10]:将0.5 mg/mL的EGCG、1 mg/mL 的NaCl、0.1 mg/mL的抗坏血酸、0.5 mg/mL的明胶溶于去离子水中,在磁力搅拌器中以500 r/min在60 ℃下搅拌20 min,以此作为内水相W1;将一定量的DHQ溶于橄榄油中使其饱和溶解后,以油相体积计,取1%、2%、3%、4%、5%(体积分数)的 PGPR置于橄榄油中,室温下磁力搅拌30 min,以此作为油相O,按不同的水/油体积比10%、20%、30%、40%、50%(体积分数)将内水相W1加入到油相O中,在8 000 r/min下高速分散3 min,制备得到 W1/O初乳。

W1/O/W2双乳的制备及工艺优化[11]:配制1 mg/mL 的SH和3 mg/mL的WP的复合物做外水相W2;以平均粒径、zeta电位为响应值,分别考察不同SH-WP质量比(1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1)、不同初乳体积分数(10%、30%、50%、70%、90%)、不同分散转速(4 000、8 000、12 000、16 000、20 000 r/min)及不同分散时间(1、2、3、4、5 min)对双乳的影响[12]。根据单因素试验结果,以SH-WP质量比(X1)、初乳体积比(X2)为自变量,以乳滴的平均粒径(Y1)和zeta电位(Y2)为因变量,进行两因素五水平的星点设计以筛选最优工艺[13],因素和水平设计见表1。

1.3.3 光学显微镜与共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscope, CLSM)观测

取制备好的W1/O/W2双乳涂抹于载玻片上,滴加去离子水稀释后通过超景深三维显微镜查看乳液的微观结构。通过CLSM对W1/O初乳、W1/O/W2双乳的形态观测[14]。取0.45 mL样品于1.5 mL的离心管中,加入质量分数为0.1%尼罗红50 μL,工作液质量分数为0.01%,混匀室温避光染色30 min,吸取20 μL在载玻片上观测W1/O、W1/O/W2乳液结构,尼罗红的激发波长/发射波长为561/570～620 nm。另一方面,分别使用荧光白、尼罗蓝对SH和WP进行染色,荧光白的激发波长/发射波长为405/430～470 nm(蓝色),尼罗蓝的激发波长/发射波为630 nm/650～750 nm(红色)。

1.3.4 SH-WP表征

1.3.4.1 傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)分析

通过FTIR分别对SH、WP及SH-WP进行结构分析[15]。将冻干的样品和干燥的溴化钾以1∶100的比例混合并压制样品-溴化钾薄片,采用衰减全反射法在透射模式下进行扫描,扫描波数范围为4 000～400 cm-1,间隔为0.5 cm-1。

1.3.4.2 蛋白结构变化分析

参照赵巧丽[16]的实验方法。通过圆二色光谱仪分析吸附蛋白的二级结构组成,使用瞬态荧光光谱仪表征界面吸附蛋白的三级构象。其中,圆二色光谱的测试条件为:扫描波长范围190～400 nm,扫描速率100 nm/min,采样间隔0.2 nm;荧光光谱的测试条件为:扫描范围350～800 nm,激发波长350 nm,发射波长440 nm, 激发和发射的狭缝宽度均为5 nm,扫描速度240 nm/min,电压600 V。

1.3.4.3 三相接触角

将SH、WP及SH-WP冻干成粉末,用模具将粉末压成直径为10 mm,厚度约为1 mm的圆柱形片剂,浸入装有橄榄油的石英皿中。从注射器针尖挤出3 μL蒸馏水,滴在圆形薄片表面形成液滴,静置30 s后记录液滴形状的变化[17]。

1.3.5 EGCG和DHQ的包封率测定

参照黄皓[18]的方法,取0.1 g样品加入1 mL体积分数70%的甲醇溶解,离心取上清液,过膜上机。色谱条件:流动相A为体积分数0.1%甲酸水溶液,流动相B为乙腈;色谱柱:Agilent C18;柱温35 ℃;流速0.3 mL/min;采集模式:ESI+;进样量2 μL。使用甲醇作为溶剂将EGCG和DHQ制成标品储备液,在上述色谱条件下测定峰面积值,将峰面积值(y)对质量浓度(x)进行线性回归,得到EGCG回归方程 y=78.304x-4.962,R2=0.999 1;DHQ回归方程 y=122.754x+223.063,R2=0.991,线性关系良好。包封率计算如公式(1)、公式(2)所示:

(1)

(2)

式中:NW,添加到乳液的EGCG的总量,mg/L;N0,添加到乳液的DHQ的总量,mg/L;NS,离心后测得的EGCG或DHQ的量,mg/L。

1.3.6 贮藏稳定性

采用稳定性分析仪考察乳液的稳定性。新鲜制备的乳液倒入样品瓶中,放入快速稳定性分析仪,室温下扫描24 h,总扫描次数为49次,扫描间隔30 min,在软件中记录扫描背散射光强度和透射率的变化。

1.4 数据处理与分析

以上每个数据均独立重复3次,实验结果以上实验均重复3次,采用 SPSS 23.0 对所得实验数据进行显著性分析,P<0.05 则表示具有显著性差异,实验数据以“平均值±标准差”表示,采用 Origin2018 绘图。

2 结果与分析

2.1 油相溶解度测定

2.1.1 标准曲线的绘制

DHQ在190～800 nm扫描区间,在λ=288 nm处有最大吸收峰,故选择λ=288 nm为检测波长。采用分光光度法在λ=288 nm处,测定不同浓度的DHQ吸光度值,绘制DHQ标准曲线,见图1。得到的回归方程为y=0.339 2x+0.105 9,R2=0.994 8。

2.1.2 油相的选择

由表2可知,DHQ在6种油液中的溶解度存在明显差异,溶解度大小依次为橄榄油>玉米油>菜籽油>红花籽油>花生油>元宝枫子油,故选用橄榄油作为制备乳液的固定油相。

2.2 W1/O初乳的最优制备工艺

固定水油体积比20%,不同PGPR体积分数(1%～5%)下制备W1/O初乳的储藏、离心前后的表观如图2-a所示。在PGPR体积分数为1%～3%时,初乳在贮藏10 d和离心后出现了明显相分离现象,表明该浓度范围不足以长时间稳定油水界面层。当PGPR体积分数≥4%时,贮藏、离心后的乳液体系均一且无分层。此外,通过图2-c和乳液平均粒径(表3)的对比也可反映不同PGPR体积分数下制备初乳的差异性。不同体积分数的PGPR制备的乳滴粒径差异较大,在3.21～2.87 μm,且随着PGPR体积分数的增大而减小。其中,体积分数1%～3%的乳滴粒径明显大于4%～5%体积分数的乳滴,当PGPR体积分数提高到4%及以上时,乳滴的粒径降幅较小,考虑到乳化剂的用量成本,以体积分数4%的PGPR为后续实验条件。

当PGPR体积分数为4%时,不同水油体积比(10%、20%、30%、40%、50%)下制备W1/O初乳的储藏、离心前后的表观如图2-b所示。水油体积比为10%的乳液在离心、贮藏10 d后出现了轻微的分层现象,50%的乳液在离心后出现了破乳现象,而其他水油比的乳液仍保持均一体系。有文献报道,水相分数较低的乳液稳定性较差,这是由于乳液中水滴的布朗运动会导致液滴在短时间内出现絮凝[19]。由图2-d和乳液平均粒径(表3)可知,不同水油体积比下制备的乳滴粒径在2.96～3.13 nm,总体比较均匀,水油比为10%时乳液粒径最小,随着水油比的升高乳滴粒径逐渐增大,因此选择20%为最佳水油比。

综上,当PGPR体积分数为4%、水油体积比为20%时制备出的W1/O初乳最佳,因此在后续的W1/O/W2双乳制备中使用该条件。

2.3 W1/O/W2双乳的制备及工艺优化

2.3.1 单因素试验筛选W1/O/W2双乳基本工艺

粒径、zeta电位是考察乳液稳定性的重要指标,液滴在分散相中的平均粒径越小,电位数值越高,所制备的乳液越趋于稳定。如图3-a所示,随着SH-WP质量比的增加,乳液的粒径呈现先下降后升高、电位先升高后降低的趋势。当SH-WP质量较低时,其不足以将油相完全包裹,从而使油相易发生聚集,导致油滴体积变大粒径增高;当SH-WP质量比过高时会破坏乳液的稳定体系,出现粒径增大现象[20]。当SH-WP质量比为5∶1时,乳液的粒径值最小、电位值最高且乳液体系均一稳定。如图3-b所示,当初乳体积比为70%时,考察结果最优。随着初乳体积的增加,乳液的粒径呈现逐渐降低、电位逐渐升高的趋势。这是由于初乳占比过低时,外水相不足以将全部初乳包裹起来,而未吸附的油滴则相互聚集加速了乳液的奥氏熟化,从而导致乳滴粒径变大,电位升高[21]。如图3-c所示,经高转数分散后的乳液粒径明显降低。当转数为4 000 r/min时,制备的乳液出现了明显的分层现象,当转数达到20 000 r/min时,过高的转数会对乳液内部结构造成破坏,从而导致粒径增大电位下降。考虑到均质设备的能耗及对乳液的破坏情况,以12 000 r/min为最佳转数。如图3-d所示,随着均质时间延长,乳液粒径呈先下降后上升、电位呈先上升后下降的趋势。当均值时间为3 min时,液滴粒径最小、电位数值最优。

综上,以SH-WP质量比为5∶1,初乳体积比为70∶1,高速分散12 000 r/min,分散时间3 min为制备W1/O/W2双乳基本工艺。

2.3.2 星点设计效应面法(central composite design response surface method,CCD-RSM)确定W1/O/W2双乳最优工艺

CCD-RSM试验结果如表4、图4所示。

2.3.3 模型拟合与方差分析

采用Design-Expert 11软件中的星点设计对实验结果进行模型拟合、模型二次多项式拟合。在粒径模型中,一次项B,二次项B2对平均粒径影响均达到极显著水平,一次项A影响显著(表5);在电位模型中,一次项B,二次项B2对zeta电位影响极显著,一次项A、二次项A2影响显著(表6)。经回归拟合后,得二次多项式如下:

Y1=43-0.053 8A+0.141 8B-0.027 5AB+0.039 3A2+0.126 8B2,R2=0.915 0,P<0.01

Y2=43.55-0.347 8A-0.487 3B-0.140 0AB-0.339 4A2-0.831 9B2,R2=0.933 8,P<0.01

双乳的粒径及zeta电位2个模型差异都达到极显著(P<0.01),失拟项差异均不显著(P>0.05),2个模型的拟合度R2分别为0.915 0和0.933 8,模型拟合度高,因此可用此模型对W1/O/W2的最优工艺进行预测与分析。各因素对响应值的3D效应面图、等高线图如图5所示,以Y1最小值为最优,双乳制备工艺为:SH-WP质量比3∶1、初乳体积比为63.32%,均质压力12 000 r/min、均质时间为3 min;以Y2最大值为最优,双乳制备工艺为:SH-WP质量比6.9∶1、初乳体积比为66.24%、均质压力12 000 r/min、均质时间为3 min。

根据上述Y1、Y2修正的最优工艺,分别制备3组平行,粒径预测值为43.04(μm),zeta电位预测值为43.03,偏差=(预测值-实测值)/预测值,结果见表7。由于Y2工艺制备中双乳出现絮凝现象,且偏差值相比Y1较高,因此,以Y1为制备双乳的最佳工艺。

2.4 光学显微镜与CLSM观测

如图6所示,通过显微镜及CLSM显微镜观察可以证实制备的乳液为W1/O/W2双重乳液结构,而不是被带入油相中形成的颗粒聚集体[22]。使用尼罗红对O进行染色(呈红色),W1(呈黑色)被O包裹呈现黑红色,表明W1/O初乳结构形成,见图6-a;从6-b可以看出,外水相W2(呈黑色)成功对W1/O初乳进行包裹且外水相W2未渗透进W1中,呈现典型的两层三相结构,证实了W1/O/W2双重乳液结构的形成。图6-c为SH-WP的CLSM图像,分别使用荧光白、尼罗蓝对SH(呈蓝色)和WP(呈红色)进行染色,以便确定2种颗粒在油水界面上的组装,蓝色荧光和红色荧光的重叠清晰可见,这种现象说明带相反电荷WP和SH形成的界面吸附层牢固的吸附在油水界面,且有效抑制了内外液滴之间的聚并。

2.5 SH-WP表征

2.5.1 FTIR分析结果

FTIR分析是被广泛应用于研究蛋白质、多糖系统的结构和相互作用的快速且实用的技术。由图7可知,SH-WP复合物的光谱与单独的SH或WP相似,这表明SH和WP之间没有发生化学反应。WP的FTIR光谱条带显示特征官能团的存在:3 276、2 925、1 628、1 531 cm-1处的条带分别对应N—H、C—H(CH2和CH3)、CO(酰胺Ⅰ)、CO(酰胺Ⅱ)的拉伸行为,1 394 cm-1和1 072 cm-1处的条带分别对应C—H和C—N的弯曲行为[23]。对于SH,位于3 273 cm-1与2 925 cm-1处的条带分别对应O—H与C—H的拉伸振动行为,位于1 606 cm-1与1 405 cm-1的条带分别与不对称的—COO—和对称的—COO—的伸展有关[24]。

在SH-WP复合物的图谱中,与WP在3 275.42 cm-1和SH在3 274.96 cm-1处的条带相比,SH-WP的FTIR光谱显示在3 274.34 cm-1处产生一个与O—H基团拉伸振动相关的宽峰,这说明SH与WP之间存在一定的相互作用,可能是SH与WP之间产生了氢键。在WP中酰胺Ⅰ与酰胺Ⅱ在1 628 cm-1及1 531 cm-1处的条带分别在SH-WP中变为了1 602 cm-1和1 406 cm-1处的条带,这证明WPC和GA之间存在氢键和静电相互作用[25]。此外,复合物在2 905 cm-1处有一个较弱的吸收峰,这可能是因为SH中的CH2和WP中的疏水基团之间发生了疏水相互作用,导致该处吸收峰发生了位移[26]。

2.5.2 蛋白结构变化分析

氢键是稳定二级结构的主要作用力,利用远紫外区圆二色谱,进一步分析复合物形成对蛋白二级结构的影响。如图8、表8所示,对于未吸附的WP,其中的α-螺旋、β-转角、β-折叠和无规则卷曲百分比分别为8.4%、25%、16%和42.8%,归一化均方根偏差<0.2,这表明吸附对WP的二级结构组成存在较大影响,复合物的α-螺旋和β-折叠含量呈上升趋势,α-螺旋由8.4%上升到12.1%,β-折叠由25%上升到30.2%。一般来说,α-螺旋是蛋白质分子中连接最紧密的结构,α-螺旋含量的增加表明经复配后蛋白的结构变得更加致密,β-折叠含量的增加也表明SH可以改善WP的结构稳定性,同样的,在李丹枫[27]的研究中也发现类似的变化趋势[27]。这可能是由于多糖对蛋白质中氢键等次级键和二硫键的形成有不同的干扰,导致二级结构发生变化。

荧光光谱通过记录蛋白中的内源荧光基团(Trp和Tyr)的极性变化来描述蛋白质的三级结构和动力学信息[28]。WP的最大发射波长约为440 nm,当SH与WP结合后其最大荧光发射峰强度显著降低,这表明SH和WP的吸附掩蔽发色基团导致荧光淬灭(图9)。WP的构象发生改变,这可能是由于WP在吸附后发生展开或重排,阻碍了部分氨基酸残基的暴露[29]。

2.5.3 三相接触角

三相接触角(θ)是评估固体颗粒润湿性的常见参数。具有中等润湿性(接近90°)的颗粒能够同时稳定O/W和W/O界面,促进颗粒在两相界面有效吸附,进而在液滴表面形成抵抗聚结的空间物理屏障[30]。如图10所示,单独的SH、WP的三相接触角分别为69.33°和114.243°,2种颗粒的表面润湿性不佳。相比之下,SH-WP复合物的表面润湿性得到显著改善达到99.375°,最接近90°,亲油亲水达到平衡。

2.6 EGCG和DHQ的包封率测定

包埋率是评价载体对活性成分包埋能力的重要指标之一,良好的包埋能力对活性成分的保护、释放、利用率的提升等方面具有重要意义。由图11可知,包封后,该乳液中EGCG、DHQ的含量分别为25.98、190.67 mg/L,其包封率达41.24%、95.34%,表明该乳对EGCG、DHQ两种活性成分具有良好的负载能力。

2.7 贮藏稳定性

采用稳定性分析仪对乳液进行离心测试,以加速不稳定现象的发生,见图12。单双乳谱图的横坐标的右侧均出现一个向下的峰,表明样品的顶部都有析清现象,横坐标的左侧,初乳比双乳明显增多一个向下峰,表明初乳底部析清现象更为严重(图12-a、图12-b)。图12-c为乳液的稳定性指数曲线,该曲线与稳定性呈反比关系,指数越大,样品的稳定性变化越大、则稳定性越差,与初乳相比,双乳的TSI曲线增加相对缓慢且数值更低、稳定性更优[31]。

3 结论

本文开发了一种基于SH-WP复合物协同稳定的W1/O/W2双重乳液,能够同时实现亲脂性DHQ和亲水性EGCG的共同负载。以SH-WP质量比、初乳体积比、分散转数及时间进行单因素试验,在此基础上采用CCD-RSM,以粒径和zeta电位为响应值进行响应面分析试验,确定最优工艺参数:PGPR体积分数4%、初乳水油体积比20∶1、SH-WP质量比3∶1、初乳体积比为63.32∶1、分散转数12 000 r/min、均质时间3 min。通过显微镜与CLSM图像证实该乳为典型的两膜三相结构;SH-WP复合物主要基于静电吸附及氢键作用,具有稳定结构;三相接触角的探究表明,该复合物的表面润湿性得到明显改善,可同时稳定2种相反曲率的油-水界面;包封后,该乳液中EGCG、DHQ的含量分别为25.98、190.67 mg/L,其包封率达41.24%、95.34%,且具有良好的贮藏稳定性。本实验是开发基于W1/O/W2双乳的DHQ和EGCG共递送体系的基础性工作,在后期的研发工作中,拟通过向此递送系统中添加更多的功能性物质,从而提高其利用率及商业价值。

参考文献

[1] LIU B B, YAN W D.Lipophilization of EGCG and effects on antioxidant activities[J].Food Chemistry, 2019, 272:663-669.

[2] NGUYEN M H T, NGUYEN T H T, PHAN T T, et al.Evaluation of stability and in vitro anti-cancer activity of dihydroquercetin nanoemulsion[J].Current Nanoscience, 2025, 21(1):127-139.

[3] CHEN S, ZHANG Y H, QING J, et al.Core-shell nanoparticles for co-encapsulation of coenzyme Q10 and piperine:Surface engineering of hydrogel shell around protein core[J].Food Hydrocolloids, 2020, 103:105651.

[4] ALMEIDA LOPES N, BARRETO PINILLA C M, BRANDELLI A.Antimicrobial activity of lysozyme-nisin co-encapsulated in liposomes coated with polysaccharides[J].Food Hydrocolloids, 2019, 93:1-9.

[5] LI B, JIANG Y F, LIU F, et al.Synergistic effects of whey protein-polysaccharide complexes on the controlled release of lipid-soluble and water-soluble vitamins in W1/O/W2 double emulsion systems[J].International Journal of Food Science and Technology, 2012, 47(2):248-254.

[6] HUANG H, BELWAL T, AALIM H, et al.Protein-polysaccharide complex coated W/O/W emulsion as secondary microcapsule for hydrophilic arbutin and hydrophobic coumaric acid[J].Food Chemistry, 2019, 300:125171.

[7] WANG C, LI J, SUN Y H, et al.Fabrication and characterization of a cannabidiol-loaded emulsion stabilized by a whey protein-maltodextrin conjugate and rosmarinic acid complex[J].Journal of Dairy Science, 2022, 105(8):6431-6446.

[8] WIJAYA W, VAN DER MEEREN P, WIJAYA C H, et al.High internal phase emulsions stabilized solely by whey protein isolate-low methoxyl pectin complexes:Effect of pH and polymer concentration[J].Food &Function, 2017, 8(2):584-594.

[9] 李淑珍. 番茄红素微乳液的制备、稳定性及抗氧化活性的研究[D].乌鲁木齐:新疆农业大学, 2022.LI S Z.Study on preparation,stability and antioxidant activity of lycopene microemulsion[D].Urumqi:Xinjiang Agricultural University, 2022.

[10] 黄耀成. W/O/W双重乳液的制备及其对葡萄籽原花青素负载作用的研究[D].广州:华南理工大学, 2021.HUANG Y C.Preparation of W/O/W double emulsion and its loading effect on grape seed proanthocyanidins[D].Guangzhou:South China University of Technology, 2021.

[11] 刘艳, 胡宏, 邹颖, 等.纤维素纳米纤丝稳定的椰子油乳液的制备及表征[J].食品工业科技, 2025, 46(19):122-131.LIU Y, HU H, ZOU Y, et al.Preparation and characterization of coconut oil emulsions stabilized by cellulose nanofibers[J].Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(19):122-131.

[12] 段方宇, 王越, 张旭, 等.葡萄籽油/大米水解蛋白复合乳液工艺优化及稳定性研究[J].中国食品学报, 2023, 23(5):125-137.DUAN F Y, WANG Y, ZHANG X, et al.Studies on process optimization and stability of grape seed oil/rice hydrolyzed protein composite emulsion[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2023, 23(5):125-137.

[13] HUANG X Z, FENG L Z, LU X F, et al.Development and optimization of a self micro-emulsifying drug delivery system (SMEDDS) for co-administration of sorafenib and curcumin[J].Drug Delivery and Translational Research, 2025, 15(5):1609-1625.

[14] YU H J, WANG H T, SU W T, et al.Co-delivery of hydrophobic astaxanthin and hydrophilic phycocyanin by a pH-sensitive water-in-oil-in-water double emulsion-filled gellan gum hydrogel[J].Food Hydrocolloids, 2022, 131:107810.

[15] 鲁燕玲, 梁珀溶, 邓艳梅, 等.核桃分离蛋白-花青素稳定Pickering乳液的制备及性质研究[J].食品工业科技, 2025, 46(18):93-101.LU Y L, LIANG P R, DENG Y M, et al.Preparation and properties of walnut protein isolate-anthocyanin stabilized Pickering emulsion[J].Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(18):93-101.

[16] 赵巧丽.紫苏粕蛋白基高内相乳液体系的构建、表征及其性能研究[D].无锡:江南大学, 2023.ZHAO Q L.Fabrication, characterization and performance investigation of perilla residue protein-based high internal phase emulsion system[D].Wuxi:Jiangnan University, 2023.

[17] 姜成辰, 黄泽昊, 周戚薇, 等.OSA淀粉-壳聚糖复合基Pickering乳液的构建及其特性表征[J].食品工业科技, 2023, 44(15):116-125.JIANG C C, HUANG Z H, ZHOU Q W, et al.Preparation and characterization of Pickering emulsion stabilized by OSA starch/chitosan complexes[J].Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(15):116-125.

[18] 黄皓.基于W/O/W乳液的熊果苷和香豆酸共递送体系构建及其界面行为研究[D].杭州:浙江大学, 2022.HUANG H.Study of W/O/W emulsion-based codelivery systems of arbutin and coumaric acid as well as their interfacial behaviors[D].Hangzhou:Zhejiang University, 2022.

[19] BHATTI H S, KHALID N, UEMURA K, et al.Formulation and characterization of food grade water-in-oil emulsions encapsulating mixture of essential amino acids[J].European Journal of Lipid Science and Technology, 2017, 119(6):1600202.

[20] GARCIA L C, TONON R V, HUBINGER M D.Effect of homogenization pressure and oil load on the emulsion properties and the oil retention of microencapsulated basil essential oil (Ocimum basilicum L.)[J].Drying Technology, 2012, 30(13):1413-1421.

[21] KUNDU P, AGRAWAL A, MATEEN H, et al.Stability of oil-in-water macro-emulsion with anionic surfactant:Effect of electrolytes and temperature[J].Chemical Engineering Science, 2013, 102:176-185.

[22] TENORIO-GARCIA E, RAPPOLT M, SADEGHPOUR A, et al.Fabrication and stability of dual Pickering double emulsions stabilized with food-grade particles[J].Food Hydrocolloids, 2024, 156:110327.

[23] ANDRADE J, PEREIRA C G, DE ALMEIDA J C Jr, et al.FTIR-ATR determination of protein content to evaluate whey protein concentrate adulteration[J].LWT, 2019, 99:166-172.

[24] RANI S, KADAM V, ROSE N M, et al.Wheat starch, gum Arabic and chitosan biopolymer treatment of wool fabric for improved shrink resistance finishing[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2020, 163:1044-1052.

[25] FALSAFI S R, ROSTAMABADI H, NISHINARI K, et al.The role of emulsification strategy on the electrospinning of β-carotene-loaded emulsions stabilized by gum Arabic and whey protein isolate[J].Food Chemistry, 2022, 374:131826.

[26] 龚穗菁. 玉米醇溶蛋白纳米颗粒和纤维素纳米晶协同稳定的皮克林双重乳液[D].无锡:江南大学, 2022.GONG S J.Pickering double emulsion synergistically stabilized by zein nanoparticles and cellulose nanocrystals[D].Wuxi:Jiangnan University, 2023.

[27] 李丹枫. 大豆蛋白-聚谷氨酸复合物双重乳液体系构建及纳豆激酶递送效果研究[D].北京:中国农业科学院, 2023.LI D F.Construction of a soy protein-polyglutamic acid complex double emulsion system and research on the delivery effect of nattokinase[D].Beijing:Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2023.

[28] ZHANG H X, CHEN G J, LIU M, et al.Effects of multi-frequency ultrasound on physicochemical properties, structural characteristics of gluten protein and the quality of noodle[J].Ultrasonics Sonochemistry, 2020, 67:105135.

[29] 张冰雁. 酪蛋白-咖啡酸复合纳米颗粒稳定Pickering乳液的制备与应用[D].无锡:江南大学, 2023.ZHANG B Y.Preparation and application of pickering emulsion stabilized by casein-caffeic acid composite nanoparticles[D].Wuxi:Jiangnan University, 2023.

[30] TU F Q, LEE D.One-step encapsulation and triggered release based on Janus particle-stabilized multiple emulsions[J].Chemical Communications, 2014, 50(98):15549-15552.

[31] HUA Y J, WEI Z H, XUE C H.Bilayer electrostatic deposition:An effective strategy to enhance physical stability of double emulsion[J].Food Hydrocolloids, 2023, 145:109083.

SH-WP complex stabilized W1/O/W2 double emulsion:Construction and performance evaluation of EGCG and DHQ co-delivery system

CHEN Jinfeng1,2, HOU Furong1, WANG Wenliang1, CUI Wenjia1, JIA Fengjuan1, SONG Shasha1, GONG Zhiqing1, SHI Junyan1, JIA Chengli1, ZHANG Jian1, CHEN Jingxin2, WANG Yansheng1*

1(Institute of Agricultural Products Processing and Nutrition, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of New Food Resources Processing, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Jinan 250100, China)
2(College of Food Science and Engineering, Bohai University, Jinzhou 121013, China)

ABSTRACT The complex of sodium hyaluronate (SH) and whey protein (WP) was used as the external aqueous phase W2.A water-in-oil-in-water (W1/O/W2) double emulsion co-delivery system loaded with lipophilic dihydroquercetin (DHQ) and hydrophilic (-)-epigallocatechin gallate (EGCG) was constructed by single factor test and central composite design response surface method.Taking the concentration of polyglyceryl-6 polyricinoleate (PGPR) and the volume ratio of water to oil as the influencing factors, the optimum ratio of W1/O colostrum was screened by emulsion surface, microstructure and particle size:the concentration of PGPR was 4% (v/v), and the volume ratio of water to oil was 20% (v/v).Through single factor experiments, the mass ratio of W2 (SH-WP) in the external aqueous phase, the volume ratio of colostrum, the dispersion speed and time were screened.Based on this, the star point design effect surface method (CCD-RSM) was used to investigate the effects of W2 mass ratio and colostrum volume ratio on the particle size and Zeta potential of W1/O/W2 emulsions.The binomial and multiple linear regression models were used to fit and establish the relationship between indicators and factors, and the optimal process parameters were determined:SH-WP mass ratio of 3∶1, colostrum volume ratio of 63.32%, dispersion speed of 12 000 r/min, and dispersion time of 3 min.The predicted values of various indicators in the optimized process were close to the target values.The prepared emulsion has a white appearance and a uniform and stable system.The confocal laser scanning microscope (CLSM) staining image shows that the emulsion is a typical “two-film three-phase” interface structure.The structure of SH-WP complex was investigated by Fourier transform infrared spectroscopy, circular dichroism and fluorescence spectroscopy.The results showed that SH and WP were mainly electrostatic adsorption and hydrogen bond interaction.The three-phase contact angle investigation showed that the surface wettability of the SH-WP composite was significantly improved.The embedding rates of EGCG and DHQ in the prepared double emulsion were 41.24% and 95.34%, respectively, and the double emulsion had good stability.In summary, the W1/O/W2 double emulsion prepared in this study can simultaneously achieve the co-delivery of hydrophilic EGCG and lipophilic DHQ, and has good potential for active ingredient delivery.

Key words W1/O/W2 double emulsion;CCD-RSM;sodium hyaluronate-whey protein complex;dihydroquercetin;gallocatechin gallate

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.043153

引用格式：陈金凤,侯福荣,王文亮,等.透明质酸钠-乳清蛋白复合物稳定W1/O/W2双乳:EGCG和DHQ共递送体系的构建及其性能评价[J].食品与发酵工业,2026,52(11):186-195.CHEN Jinfeng, HOU Furong, WANG Wenliang, et al.SH-WP complex stabilized W1/O/W2 double emulsion:Construction and performance evaluation of EGCG and DHQ co-delivery system[J].Food and Fermentation Industries,2026,52(11):186-195.

第一作者：硕士研究生(王延圣副研究员为通信作者,E-mail:sdnky_wys@163.com)

基金项目：2024年山东省重点研发计划项目(乡村振兴科技创新提振行动计划)(2024TZXD005);山东省农业科学院农业科技创新工程 (CXGC2025A07, CXGC2025C09, CXGC2025G05)

收稿日期：2025-05-29,改回日期:2025-09-10