超声波预处理辅助蛋白质谷氨酰胺酶、精氨酸对蛋黄液乳化性的影响

蛋黄约占整个鸡蛋质量的30%,是一种由水(52%)、脂质(27%)、蛋白质(16%)以及碳水化合物、矿物质、维生素和其他营养素组成的食品,具有较高的营养价值和优良的功能特性,因其具备较高的乳化性能而被广泛地应用于食品加工生产中[1]。在烘焙类食品、蛋黄酱类食品以及冰淇淋等食品体系中,蛋黄液的乳化性能起着至关重要的作用。蛋黄液的乳化性能归因于其所含有的脂质和蛋白质具有良好的两亲性能,能使其在油水界面形成良好的界面膜并起到维持界面张力的作用[2]。然而,在实际加工过程中,蛋黄所含有的蛋白质极易受到外界因素的影响而使其结构和性质发生改变,从而使其乳化性能发生劣化,最终影响食品的品质和口感。因此,寻找高效、绿色的改性方法提高蛋黄液的乳化性能是目前研究的热点之一。

超声波改性是一种新型的蛋白质改性技术,通过诱导气泡的产生和破裂从而产生空化效应,破坏蛋白质的氢键,使蛋白质结构展开,暴露疏水基团,增强蛋白质和水分子之间的相互作用,将超声波改性与化学、酶法改性相结合,能产生协同效应,从而有效改善蛋白质的水合状态[3]。研究发现通过超声波处理后蛋黄颗粒溶液的浊度、平均粒径和zeta电位绝对值显著降低,蛋白质的溶解度显著增加,蛋黄液的乳化性能得到改善[4]。目前,超声波已被广泛应用于蛋白质改性处理中,但将其应用于提升蛋黄液功能特性的研究较为有限。

蛋白质谷氨酰胺酶(protein glutaminase,PGase)是一种新型脱酰胺酶,相较于化学脱酰胺条件更加温和,且底物特异性强、产物安全性高。PGase通过作用于蛋白质侧链中谷氨酰胺残基的氨基,产生谷氨酸和羧基,带负电荷的羧基会增强蛋白质的静电排斥,导致高阶肽结构的展开和蛋白质解聚。同时,PGase对蛋白质的有限水解暴露了疏水和亲水残基,增强蛋白质之间的两亲性,并加强乳化作用[5]。ZHANG等[6]研究发现利用大米蛋白经过PGase脱酰胺处理过后,导致蛋白质负电荷增加,增强了静电排斥力并阻止了蛋白质分子之间的聚集,使蛋白质具有更小的粒径、更高的zeta电位绝对值和更好的乳化活性(emulsifying activity index,EAI)。JIANG等[7]研究发现脱酰胺通过增加负电荷和疏水指数引起了更好的亲水亲脂平衡,使大豆分离蛋白更容易在油水界面处被吸附,PGase导致的高脱酰胺程度增强了乳液液滴之间的静电排斥力,这有助于更好地提高乳化稳定性(emulsion stability index,ESI)。目前,PGase主要集中于其他蛋白质乳化性能的提升上,但将其应用于蛋黄蛋白质的相关研究还未有报道。

碱性氨基酸是一类等电点大于7.0的氨基酸,包括精氨酸(arginine,Arg)、赖氨酸(lysine,Lys)和组氨酸(histidine,His)。Arg作为小分子功能物质并具有改性蛋白质的性质,它们通过抑制蛋白分子的聚集来增加蛋白质的溶解度,通过促进蛋白质在油水界面的扩散和吸附,形成更强的界面膜,降低界面张力,增强分子之间的静电排斥力,提高ESI,得到了广泛的应用[8]。ZHU等[9]发现Arg的引入能显著降低肌原纤维蛋白-大豆油乳液的粒径尺寸和表观黏度,提高粒子的zeta电位绝对值,Arg作为两亲性物质直接参与油滴的界面吸附,能有效提高蛋白质乳液的稳定性。GAO等[10]研究了Arg对鸡肌原纤维蛋白乳化性能的影响和潜在机制,发现Arg增加了鸡肌原纤维蛋白样的溶解度、电位绝对值、表面疏水性、荧光强度,有效增强了鸡肌原纤维蛋白的EAI和ESI,从而得到更小、更均匀的乳剂。目前,已有研究证明Arg能显著提升蛋白质的乳化性能,但将其实际应用于蛋黄液乳化性能的改善研究还未有报道。

目前,关于超声波预处理辅助PGase、Arg对蛋黄乳化性的影响尚未报道。本研究采用超声波预处理辅助PGase、Arg联合改性蛋黄液,进而达到提高蛋黄液乳化性能的目的,为提高蛋黄液乳化性能提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鸡蛋,雅安名山黄家鲜鸡蛋(蛋鸡品种:大五金凤);玉米胚芽油,金龙鱼粮油食品股份有限公司。

PGase(酶活力1 000 U),河北仟盛生物科技有限公司;Arg(纯度≥98%),成都百思博生物技术有限公司;考马斯亮蓝R-250,成都市科龙化工试剂厂;PBS粉末,成都浩博优科技有限公司;NaOH、HCl、甲醇、乙酸,成都市科隆化学品有限公司;三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris]、甘氨酸、溴酚蓝(bromophenol blue,BPB)、SDS,北京索莱宝科技有限公司;其他试剂均为市售分析纯。Ellman试剂配制:用pH 8 Tris-甘氨酸缓冲溶液溶解0.4 g 5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)[(5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB],并定容至100 mL。

1.2 仪器与设备

Scientz-ⅡD 触摸式超声波细胞粉碎机,宁波新芝生物科技股份有限公司;SHHW21-420型恒温水浴锅,北京市永光明医疗仪器厂;HH-6J磁力搅拌水浴锅,恩谊科技有限公司;FSH-2A可调高速均质机,常州越新仪器制造公司;PHS-25型pH计,上海今迈仪器仪表有限公司;DYCZ-240型电泳仪及电源,北京市六一仪器厂;TGL-18M型高速冷冻离心机,上海卢湘仪离心机有限公司;L1物联智能可见分光光度计,上海佑科仪表有限公司;Zetasizer Nano动态光纳米粒度电位仪,马尔文仪器公司;Nicolet iS10型傅里叶变换红外光谱仪,赛默飞世尓科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 蛋黄液的预处理

挑选干净、完好的鲜鸡蛋用质量分数为0.4%的NaOH溶液浸泡鲜鸡蛋3 min,用流水清洗干净后,自然晾干。手工打碎鸡蛋,将蛋黄与蛋清分离,将蛋黄置于滤纸上轻轻滚动吸去蛋黄膜上残留的蛋清。用镊子刺破蛋黄膜将蛋黄液收集于烧杯中并搅拌均匀,将蛋黄液用蒸馏水按质量比1∶1进行稀释。将分离好的蛋黄清液于高速均质机(10 000 r/min),均质2 min,使其均一;采用120目筛过滤,重复过滤2次,除去系带、蛋壳等杂质,得到预处理好的蛋黄液。

1.3.2 超声波预处理辅助PGase、Arg改性蛋黄液的乳化性

将未经过任何改性处理的蛋黄液记为CK;将蛋黄液在冰水浴条件下进行超声波预处理,功率120 W,时间10 min,记为U;将超声波预处理后的蛋黄液pH值调至6.5,加入100 U/g蛋白质的PGase,于45 ℃水浴条件下反应2.5 h,记为UP;向超声波预处理后的蛋黄液中加入最终质量分数为0.4%的Arg,在室温下磁力搅拌1 h记为UA;将超声波预处理后的蛋黄液先按照UP组处理后再按照UA组方法处理记为UPA,将超声波预处理后先按照UA组处理后再按照UP组方法处理记为UAP。

1.4 指标测定

采用LI等[11]的方法并稍作修改。将待测样品蛋白浓度稀释至质量分数为1%,将45 mL样品溶液与15 mL玉米胚芽油混合,用高速分散器以10 000 r/min进行乳化分散1 min。均质后分别在静置0、10 min时吸取50 μL底部的乳液,与5 mL质量分数为 0.1% SDS溶液混合,在500 nm处读取吸光度值。EAI和ESI的计算分别如公式(1)和公式(2)所示。

式中:N,稀释比;C,乳化前蛋白质质量浓度,g/mL;F,乳化液中油的体积分数,0.25;A0,乳液在0 min的吸光度值;A10,乳液在10 min下的吸光度值。

1.4.2 粒径、zeta电位

参照XIA等[12]方法。使用0.01 mol/L PBS(pH=7)将样品蛋白质量浓度稀释至1 mg/mL,使用马尔文粒度仪对样品的粒径和zeta电位进行测量。

1.4.3 表面疏水性

参照BIE等[13]的方法并稍作修改。用0.01 mol/L 的PBS(pH 7.2)将蛋黄液蛋白质量浓度稀释至1 mg/mL,并取1 mL稀释溶液与200 μL BPB(1 mg/mL)混合。在4 ℃下以2 000×g离心15 min后,用PBS将上清液稀释10倍。在595 nm 处测量吸光度值。无蛋黄液作为对照组。疏水性指数(以BPB结合量表示)计算如下:

式中:A空白,空白样品在595 nm处的吸光度值;A样本,BPB混合的蛋黄液在595 nm处的吸光度。

1.4.4 游离巯基含量

参考XIAO等[14]的方法,并稍加修改。采用Ellman法测定样品中游离巯基的含量:将0.5 mol的样品与4.5 mL pH 8 的Tris-甘氨酸缓冲溶液混合,然后加入0.05 mL Ellman试剂,将样品在黑暗中孵育30 min,然后用紫外分光光度计在412 nm处测量溶液的吸光度值。使用0.05 mL Ellman 试剂和5 mL Tris-甘氨酸缓冲溶液的混合物作为空白对照。游离巯基含量(C-SH)按公式(4)进行计算:

式中:13 600是摩尔消光系数;A412,412 nm处的吸光度值;D,稀释因子;C,蛋白质量浓度,mg/mL。

1.4.5 傅里叶红外光谱

参照LUO等[15]和方法,并稍加修改。将冻干样品和KBr以1∶200的质量比放入玛瑙研钵中,充分混合研磨成粉末后于干燥条件下压制成薄片。使用傅里叶红外光谱仪收集红外光谱,扫描范围为4 000～450 cm-1,分辨率为4 cm-1,扫描次数为32次。

参考HUANG等[16]方法,并加以修改。使用质量分数为15%的分离胶和质量分数为5%的浓缩胶进行SDS-PAGE检测。将15 μL质量浓度为5 mg/mL的样品与15 μL 2倍上样缓冲液充分混合后煮沸5 min。冷却至室温后,取10 μL进行SDS-PAGE。样品在浓缩胶时采用80 V恒压进行电泳,在分离胶时,采用120 V恒压进行电泳。电泳结束后用质量分数为2.5%考马斯亮蓝R250对凝胶染色2 h,使用脱色液进行脱色处理直至条带清晰,并使用扫描系统成像。

1.4.7 内源荧光光谱

参考TAN等[17]方法,使用10 mmol/L PBS(pH 4)制备样品溶液(1 mg/mL),使用荧光光谱仪扫描,激发波长为280 nm,发射波长扫描范围为290～450 nm,发射光与激发光狭缝宽度为5 nm,灵敏度为2。磷酸盐缓冲液作为空白对照。

参考TANG等[18]的方法,略作修改。将蛋白质量浓度为1 mg/mL的蛋黄液(10 mmol/L PBS,pH 7.4)放入石英比色皿中,扫描在190～400 nm的紫外吸收光谱。

1.4.9 扫描电子显微镜

采用扫描电子显微镜观察样品表观结构,使用喷金机于干燥条件下喷金,放于载物台上,通过调整视野、放大倍数,观察其表面形态,使用配套软件捕捉图像。

所有实验均重复测定3次,数据采用“平均值±标准差”的形式表示。采用SPSS 27软件对实验数据进行显著性分析(P<0.05,显著)。使用 Origin 2025软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 超声波预处理辅助PGase、Arg改性对蛋黄液乳化性能的影响

EAI表征蛋白质在油水界面的吸附能力,ESI表征蛋白质在油水体系中维持稳定状态的能力。如图1所示,不同改性处理对蛋黄液乳化特性的影响存在差异,就EAI而言,所有改性组均显著高于CK(P<0.05),具体表现为:超声波辅助复合改性组(UPA,UAP)>单一辅助改性组(UP,UA)>U。其中,在单一辅助改性组中,UP组的EAI显著高于UA组(P<0.05);在复合改性组中,UPA组的EAI也显著高于UAP组(P<0.05)。在ESI方面趋势有所不同:超声波辅助复合改性组(UPA,UAP)的ESI显著高于单一辅助改性组(UP,UA),而后两者又显著高于单一超声波组(U)。值得注意的是,U与CK组之间、UP与UA之间、以及UPA与UAP之间的ESI均未观察到显著差异。综上,超声波预处理辅助PGase以及超声波预处理辅助Arg均能有效提高蛋黄液的EAI和ESI,将两者复合处理过后,乳化性能达到最大值,说明多重复合改性能更有效改善蛋黄液的乳化性能。其中UPA的EAI和ESI较CK组分别提高了185.59%和249.42%,UAP的EAI和ESI较CK组分别提高了171.86%和239.20%。这可能是因为超声波预处理产生的空化作用和机械破裂使得蛋白质结构展开,增加了蛋白质分子的柔韧性,同时暴露出更多的反应基团,随着PGase和Arg与蛋白质反应的发生,蛋白质之间的静电排斥力增加,分子间相互作用增强,疏水基团暴露,界面张力降低,实现了更好的亲水-亲油平衡,并且增强了蛋白质在界面的吸附能力。CAO等[19]的研究结果也有相似的原理,超声诱导了蛋白质构象发生改变,促进了蛋白质结构的扩展并暴露了内部基团,最终改善蛋白质的乳化性能。

2.2 超声波预处理辅助PGase、Arg改性对蛋黄液乳化性能影响的机理分析

粒径大小是评价蛋白质EAI和ESI的重要指标之一,较小的粒径能使蛋白质颗粒迅速填充到油-水界面中,有助于提高蛋白质的EAI。如图2所示,与CK组相比,经过超声波预处理后的样品平均粒径显著降低(P<0.05),超声波辅助复合改性组(UPA,UAP)显著低于单一辅助改性组(UP,UA),其中,UP组显著低于UA组,但UPA及UAP组之间无显著差异,较CK组而言,UPA及UAP组粒径值分别降低了90.74%和87.78%。这说明超声波预处理辅助酶以及碱性氨基酸改性处理能有效破坏蛋白质的结构。与CK组相比,U组的平均粒径降低了15.65%,可能是因为超声波在溶液内部迅速产生空化气泡,气泡破裂坍塌,从而爆发出强剪切力,使不溶性蛋白聚集体在溶液中分散均匀。UP组的粒径与UA组粒径为213.3、267.1 nm,显著低于CK组以及U组(P<0.05),这说明超声波预处理辅助PGase可以减小蛋白质的粒径,这可能是由于在脱酰胺过程中酰胺基团转化为羧基,增强了蛋白质分子之间的静电排斥力,避免了蛋白质的聚集,导致了更小的粒径。此外,超声波的空化效应可以产生较高的剪切力,使蛋黄蛋白质的结构更松散,易与PGase结合[20]。在图2中也能发现,UPA组和UAP组的粒径值较其他组而言更低,这说明再次复合改性处理能在单一超声波改性的基础上降低蛋白质的平均粒径值。在超声波预处理辅助PGase改性的基础上,再加入Arg对蛋黄液进行改性处理,使得原本暴露出的基团更易与Arg发生相互作用,增强分子间静电排斥力,使得蛋白质聚集受到限制,界面活性提高,从而获得更小的粒径,最终获得更优的乳化性能,这与上述的乳化性能结果一致。

Zeta电位与蛋白质的表面电荷以及蛋白体系的稳定性有关。如图3所示,与CK组相比,经过超声波处理后的蛋黄液zeta电位绝对值显著增加(P<0.05),UP组以及UA组较高,UPA组达到最大值,UAP次之,各组间均存在显著性差异(P<0.05)。这可能是因为不同改性处理均显著改变了蛋白质的结构,从而改变了蛋白质表面带正电基团以及带负电基团之间的平衡,这与LI等[21]的研究结果一致,在超声波预处理辅助改性处理条件下,蛋白质表面负电荷增加,蛋白质分子间的静电排斥力和界面膜厚度增加,从而提升体系的EAI。在ZHANG等[6]的研究中也得出了类似的结论,说明超声波预处理辅助PGase改性处理后,蛋黄液的zeta电位绝对值提高,这可能是由于超声波预处理使蛋黄液中蛋白质粒径降低,酰胺基团暴露,导致后续与PGase反应时更容易改善蛋白质结构的柔性,更易发生羧化作用,转化为带负电荷的羧基,使蛋白质分子负电荷增加,增强蛋白质的两亲性,分子间的静电排斥力增加,最终使蛋黄液的ESI得到改善。这与前面EAI和ESI的结果相对应。

2.2.3 表面疏水性

表面疏水性对蛋白质的稳定性、构象和功能特性具有重要影响,通常根据蛋白质表面的疏水基团数量来确定,用于分析蛋白质三级结构的变化。如图4所示,蛋黄液经过超声波处理、超声波预处理辅助PGase以及Arg改性等处理条件的表面疏水性均发生了显著变化(P<0.05),其中UP组较CK组表面疏水性提高了154.22%,超声波预处理辅助PGase处理能显著提高蛋白质的表面疏水性,这可能是因为超声波诱导的空化效应破坏了蛋白质疏水区的水合层结构,导致非共价相互作用的崩解,暴露出掩埋在蛋白质内部的疏水基团,PGase的脱酰胺作用进一步导致蛋白质去折叠和表面疏水性增加[22]。而UA组较CK组表面疏水性提高了114.39%,这与BAN等[23]的研究结果一致,表面疏水性升高表明了疏水基团的暴露,这可能是因为Arg诱导了疏水相互作用的加强,通过氢键、疏水相互作用和静电相互作用等机制诱导蛋白质构象发生变化。在超声波辅助复合改性处理组中,UPA组与UAP组的表面疏水性显著高于其他实验组。在超声波预处理辅助PGase的脱酰胺反应中,使酰胺基团转化为羧基,加速了蛋白质分子在界面膜的吸附,暴露出更多的反应基团与Arg相互作用;脱酰胺反应也增加了空间位阻和静电排斥,使其具有更完整的界面膜,这也说明复合改性条件下,蛋黄液会具有更高的乳化性能。

游离巯基是影响蛋白质功能特性的官能团之一,用于反映蛋白质的变性程度。如图5所示,与CK组相比,经过改性后的蛋黄液样品的游离巯基含量均显著增加了(P<0.05)。在超声波预处理的辅助改性处理下,UP的游离巯基含量较CK组提高了269.85%,这可能是因为经过超声波产生的物理作用破坏了蛋白质的交联,使其更易展开同时暴露出更多的酶切位点,随着酶解脱酰胺的发生,蛋白质结构展开并伴随着二硫键断裂,静电斥力增大,分子内部游离巯基暴露在分子表面[7]。UA组的游离巯基含量较CK组增加了251.34%,这可能是超声波预处理辅助Arg改性通过空间位阻和干扰疏水相互作用抑制蛋白质聚集,并将原本掩埋在分子内部或聚集体核心的游离巯基暴露[24]。另外,UPA组和UAP组的游离巯基含量显著高于其他实验组,UPA最高、UAP次之(P<0.05),这说明超声辅助PGase、Arg多重复合改性处理更有利于蛋白质结构的变化,使其具有更高的乳化性能:超声波处理破坏了蛋白质的高级结构,暴露出大量被掩埋的酶作用位点和疏水区域;随后,PGase高效催化脱酰胺反应,不仅使蛋白质分子充分展开、二硫键断裂,暴露出大量游离巯基,其产生的大量负电荷还增强了蛋白质分子的静电排斥力,防止已暴露的巯基重新聚合;最后,Arg的引入进一步提供了强大的空间位阻,稳定了已展开的蛋白质构象,防止了巯基的再掩埋与氧化。因此,UPA组能获得最高的游离巯基含量。这些高度暴露的游离巯基不仅显著增强了蛋白质表面活性,使其能更快速、牢固地吸附在油-水界面上并形成分子间二硫键交联的稳定界面膜,最终最有效地改善了蛋黄液的乳化性能。

SDS-PAGE表征蛋白质相对分子质量的分布情况、亚基组成以及蛋白质的降解或聚集程度。分子质量为110、78、59、53、30 kDa附近的条带为高密度脂蛋白的特征条带,分子质量是40、37 kDa左右的条带为卵黄高磷蛋白的特征条带[25]。如图6所示,与空白组相比,经过超声波处理后的蛋黄液条带明显加深,这可能是因为蛋黄液由脂质和蛋白质组成,在CK组样品中,存在大量的多聚体或者大的脂蛋白复合物,导致其无法进入浓缩胶或分离胶,超声波处理产生的强烈空化效应、剪切力,可以有效地打断疏水作用、氢键、范德华力等非共价相互作用,从而破坏这些聚集体,这与毕雅雯等[26]的研究结果一致。随着后续处理的发生,条带颜色相较U组变浅,随着PGase反应的进行,观察到37 kDa以及40 kDa的条带明显变窄,这表明酶促脱酰胺反应促进了高分子质量蛋白质降解成更小的亚基或多肽,之前的研究也得到了类似的结果[27]。而Arg作为碱性氨基酸的加入可能会提高蛋黄液的pH值,同时改变了蛋黄液中蛋白质的表面电荷以及构象情况,通过优先与蛋白分子的芳香族氨基酸残基相互作用,阻碍蛋白质的聚集,最终增强体系乳化性能。

2.2.6 傅里叶变换红外光谱

通过傅里叶变换红外光谱可观察经过不同处理的蛋白质多个特征吸收峰的变化情况。其中由C

O伸缩振动引起酰胺Ⅰ带是指1 600～1 700 cm-1处的峰变化;与C—N伸缩振动及N—H弯曲振动均相关的酰胺Ⅱ带是指1 500～1 600 cm-1处的峰变化,峰的位置以及强度变化可反映相关肽链结构变化[28]。如图7所示,经过不同条件处理后,峰的强度以及频率均有不同程度的变化,但并没有出现新的吸收峰,说明体系中并没有形成新的官能团。值得注意的是,在3 700～3 200 cm-1处的吸收峰值增加并发生红移,这可能是因为经过超声波预处理辅助PGase改性后,样品结构遭到破坏同时释放出大量的极性基团,Arg的加入不仅直接贡献了N—H基团,更促进了基团的暴露以及自身携带的极性基团之间、与水分子之间形成更强、更广泛的氢键网络,从而增强了吸收峰的强度,也导致了红移的发生。在酰胺I带以及酰胺Ⅱ带的峰发生蓝移且吸收峰强度增加,说明在改性过程中发生了二级结构的改变,在超声波产生的空化作用下,蛋白质展开并暴露出内部的化学键,从而增加蛋白质的红外吸收强度。与此同时,超声波产生的机械能也可能破坏蛋白质的柔性结构,使得无规则卷曲数量降低,这与LI等[29]的研究结构类似。在PGase脱酰胺作用下,可能会产生末端基团,发生—COO-伸缩振动;Arg的改性处理使得蛋白质发生—NH2变形振动,另外,暴露的极性基团例如—COO-、—OH、—NH2与Arg的氨基会形成新氢键或离子对,可能增强特定振动模式,含有的胍基与羧酸根的强静电作用可能使C—N振动蓝移,之前的研究也有类似结果[30]。

2.2.7 内源荧光光谱

蛋白质的内源荧光主要由色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸等荧光发色基团产生,此类芳香族氨基酸残基微环境极性的改变会导致荧光光谱的变化。如图8所示,与CK组相比,经过超声波处理后的蛋黄液的荧光强度有所下降,可能是超声波使得蛋白质的复杂结构展开,三级结构去折叠化,导致酪氨酸和色氨酸等发色基团暴露到非极性更大的环境中,疏水性增加,这与前面的表面疏水性结果一致[31]。与U组相比,UP的荧光强度下降并发生了明显的蓝移,这可能是因为PGase的脱酰胺作用使得静电斥力增加,色氨酸所处的极性环境发生了改变,空间位阻作用增大使得荧光发色基团的信号被屏蔽从而削弱蛋白质的三级结构,这与以往的研究结果一致[20]。UPA和UAP组的荧光强度持续下降,可能是因为随着反应的持续发生,蛋白质发生变性进一步展开,色氨酸、酪氨酸疏水残基暴露在蛋白表面,导致蛋白质间产生氢键和疏水相互作用使得内源荧光发生猝灭。

2.2.8 紫外吸收光谱

紫外吸收光谱是表征蛋白质是否发生色谱基团的形成和吸收强度的变化从而判断变性过程中是否发生蛋白质的构象改变,蛋白质的紫外吸收光谱显示在260～310 nm范围内有酪氨酸残基和色氨酸残基形成的吸收带。如图9所示,与CK组相比,经过改性处理后各实验组的紫外吸收强度增加,说明处理组的蛋白质较CK组更加舒展,发色基团暴露在外部。与CK组相比,UPA组的吸收强度显著增加,这可能是因为超声波导致部分结构域解折叠,将掩埋在疏水核心的色氨酸残基暴露出来,随着PGase的脱酰胺作用以及Arg的加入,蛋白质进一步变性,酪氨酸和色氨酸残基暴露在极性环境中,同时蛋白质分子形成新的结构,导致吸收强度再次增加[32]。值得注意的是,在超声波预处理辅助PGase处理以及超声波预处理辅助Arg处理条件下,最大吸收峰出现蓝移且强度有所增强,这说明此时蛋白质发生了三级结构的变化,使得色氨酸以及酪氨酸等基团暴露在极性环境中,Arg的加入可能会形成新的氢键相互作用,从而改变了基团周围的微环境极性,这与WANG等[33]的研究结果一致。

2.2.9 扫描电子显微镜

本研究利用扫描电子显微镜图像放大100倍观察不同改性方式对蛋黄组分聚集程度的影响,如图10所示,CK组的蛋黄液颗粒较大,形态不规则且呈现不均匀分布,而经过超声波处理后观察到的颗粒减小。这可能是因为经过超声波处理后,蛋黄颗粒形态发生破坏,破裂成大量的碎片,并形成不规则结构,表面呈现出裂隙以及片状突起。相较单独超声波处理后的蛋黄颗粒,超声波预处理辅助PGase以及超声波预处理辅助Arg的复合改性的蛋黄颗粒微观排列更为致密,颗粒尺寸进一步减小,这可能是脱酰胺作用以及Arg带来的化学效应影响了蛋白质的构象,从而改变其颗粒状态;分子间作用力增强,颗粒结构稳定性得以提升。UPA组和UAP组蛋黄颗粒呈现出较小的团聚体和较粗糙的表面,其中UPA组的蛋黄颗粒尺寸最小且分布均匀,这说明三重复合改性使得原本结构致密的蛋白质分子簇得以分散,且小的颗粒代表着更大的表面积与体积比,这会暴露出更多的接触点发生反应,活性残基暴露,使得蛋黄颗粒分散性提高、分布更加均匀[34]。

3 结论

本研究中,尽管UPA与UAP在ESI、粒径及表面疏水性上无显著差异,但UPA被确定为最佳改性方案。其核心优势体现在EAI的显著提升,这主要归因于其在zeta电位、游离巯基含量及蛋白质结构展开程度上的综合优势。这些结果表明,先进行酶法脱酰胺再引入氨基酸修饰能更高效地协同优化蛋白质的界面性质,因此经超声波预处理辅助PGase改性蛋黄液后再加入Arg进行改性处理是蛋黄液乳化性能最大化提升的首选策略,与空白组相比EAI提高了185.59%,ESI提高了249.42%,蛋白质的结构和性质发生了显著的变化。超声波处理、PGase、Arg多重复合改性能起到分级调控蛋黄蛋白质结构的作用,超声波处理通过产生空化作用优先诱导蛋白质结构部分展开,增加分子柔韧性;PGase脱酰胺暴露出疏水基团并通过增加负电荷,强化静电斥力改变蛋白质的结构;Arg通过疏水相互作用、氢键网络以及静电排斥降低界面张力,增强界面膜机械强度。上述协同效应促使蛋白质发生关键结构的变化,通过增加降低平均粒径值、zeta电位绝对值、暴露疏水残基、显著增加游离巯基含量以及改变蛋白质二、三级结构的精细调控,最终显著提升蛋白质的界面吸附能力与其在水油体系中维持稳定状态的能力。

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