免疫系统在维持机体稳态和抵御病原体入侵中发挥关键作用,其功能受年龄、抗原刺激及生活方式等多种因素影响[1]。临床常用的化学免疫调节剂(如环磷酰胺、匹多莫德)不仅成本较高,还常伴随明显的副作用[2]。免疫调节肽因可同时调控特异性和非特异性免疫应答,且具有来源广、易吸收、安全性好等特点,近年来已成为功能性食品与药物开发中一种具有潜力的替代策略[3]。我国海洋贝类资源丰富,如牡蛎、文蛤、青蛤和贻贝等,已成为免疫调节肽开发的优质蛋白来源,通过酶解和分离纯化技术从中制备和鉴定活性肽段已有较多报道[4-5]。然而,目前针对贝类源免疫调节肽的活性筛选与构效关系研究仍相对薄弱,不同肽段之间的免疫活性缺乏系统比较,从而制约了活性肽资源的优选及其产业化应用。
分子对接和分子动力学模拟技术可为多肽配体与受体蛋白间的亲和力及结合构象稳定性提供有效预测,从而用于已知序列免疫调节肽的比对分析,总结其活性关键特征,提升靶向筛选效率[6-7]。另一方面,活性肽的功能发挥与其在胃肠环境中的结构完整性密切相关。多数含有3个以上氨基酸残基的肽段容易被肠上皮刷状缘膜酶降解为小片段肽甚至游离氨基酸,导致活性丧失[8]。如QIAN等[9]报道YPVEPF寡肽经模拟消化后几乎完全被降解,且其活性也显著降低。此外,食品加工与贮藏中的热处理、极端pH及金属离子等条件也会影响肽的稳定性[10]。因此,系统评估活性肽的胃肠消化耐受性和加工稳定性,对其在功能性食品或营养保健品中的应用具有重要现实意义。
本研究首先对已有报道的贝类源免疫调节肽进行总结,采用分子对接和分子动力学模拟技术筛选出与Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)具有高结合亲和力的肽段,进而通过体外细胞实验验证其免疫活性,以筛选出最优肽段,并系统评估该肽段在体外模拟胃肠消化和加工贮藏条件下的稳定性。本研究旨在为海洋贝类源免疫调节肽的作用机制探索及后续开发与应用提供理论依据和数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
QLNWD、RVAPEEHPVECRYLV、LLQLGSGR、DNSIAMESMK(纯度均>96%),上海强耀生物科技有限公司固相合成;小鼠巨噬细胞RAW264.7,中国科学院细胞库;RAW264.7细胞专用培养基、DMEM培养基,武汉普诺赛生命科技有限公司;细胞增殖-毒性检测试剂盒(cell counting kit-8, CCK-8),加拿大Biosharp公司;一氧化氮检测试剂盒、中性红细胞增殖试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司;脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),北京索莱宝生物科技有限公司;胃蛋白酶、胰酶,上海源叶生物科技有限公司;KCl、FeCl3、MgCl2,上海麦克林生化科技股份有限公司;NaHCO3、CaCl2、NaOH、盐酸,西陇化工股份有限公司。
1.2 仪器与设备
Forma 370型CO2恒温箱、Varioskan Flash多功能酶标仪,美国Thermo公司;SW-CJ-2FD超净工作台,苏州净化有限公司;UNIVERSAL 320R高速冷冻离心机,德国HETTICH公司;HL-6数显恒温水浴锅,常州奥华仪器有限公司;Arc高效液相色谱仪,美国Waters公司。
1.3 实验方法
1.3.1 基于分子对接技术的免疫调节肽的筛选
系统检索了中国知网、PubMed等中英文数据库(2010—2025年),以“贝类/免疫调节/肽”等为关键词,共获得20条具有明确序列的贝类免疫调节肽。使用ChemDraw绘制肽段的2D结构,并使用Chem3D软件对肽段进行能量最小化。将优化好的肽段导入AutoDockTools-1.5.6进行加氢、平衡电荷以及设置可旋转键。从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载Toll样受体2(toll-like receptors2, TLR2)(PDB ID:6 NIG)和Toll样受体4/髓样分化因子2(toll-like receptors 4/myeloid differentiation factor 2, TLR4/MD-2)(PDB ID:3FXI)的晶体结构,在对接之前,去除受体蛋白中的水和无关配体并加入氢,TLR4/MD-2晶体结构除去LPS。利用AutoDock Vina 1.1.2进行半柔性分子对接,并评分体系结合能。最终获得了16条能够与2个目标受体成功对接的肽段,作为本文的研究对象。对接结束后,使用PyMOL 3.8和Discovery Studio 2019分析相互作用模式。
1.3.2 分子动力学模拟
采用amber22软件对分子对接获取的蛋白-肽分子复合物(QLNWD-TLR4/MD-2、LLQLGSGR-TLR4/MD-2、RVAPEEHPVECRYLV-TLR4/MD-2和DNSIAMESMK-TLR4/MD-2)进行分子动力学模拟。蛋白受体使用ff14SB力场参数,肽段配体使用gaff力场参数进行拟合,并使用ANTECHAMBER工具计算其AM1-BCC原子电荷。将复合物置于半径为1.2 nm的十二面体水盒子中,添加抗衡离子并进行能量最小化和升温控压平衡体系,体系温度和压力设置为300 K 和100 kPa。对平衡后的体系进行分子动力学模拟(100 ns),时间步长2 fs,每隔10 ps保存一次轨迹数据,使用CPPTRAJ工具对轨迹进行统计分析,模拟输出文件并计算复合物的均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)、均方根波动(root mean square fluctuation, RMSF)、回转半径(radius of gyration, Rg)和包埋面积(solvent accessible surface area, SASA),使用MMPBSA.py计算肽配体和蛋白的结合能。
1.3.3 体外免疫活性验证
1.3.3.1 细胞增殖实验
参考王震等[11]的方法并略加修改。取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞,将密度约为1×l05个/孔的细胞悬液接种于96孔板,100 μL/孔。在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h后,弃去细胞培养液。在各孔中分别添加100 μL不同质量浓度的肽溶液(6.25、12.5、25、50、100、250、500 μg/mL),空白对照组加入DMEM培养液,置于培养箱孵育24 h。弃去细胞培养液,每孔加入10 μL CCK-8试剂并于培养箱孵育1 h后,使用酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度。细胞活力的计算如公式(1)所示:
细胞活力
(1)
式中:A1,样品组吸光度;A2,空白对照组吸光度。
1.3.3.2 细胞吞噬能力
将RAW264.7巨噬细胞以约为1×l05个/孔接种于96孔板培养24 h,实验分组参照1.3.3.1节的方法,使用1 μg/mL LPS作为阳性对照。培养24 h后弃去上清液,按照中性红试剂盒的操作方法,在540 nm处测定吸光值,中性红吞噬指数的计算如公式(2)所示:
中性红吞噬指数
(2)
式中:A1,样品组吸光度;A2,空白对照组吸光度。
1.3.3.3 细胞NO的释放量
细胞接种、实验分组同方法1.3.3.2节,按照一氧化氮检测试剂盒的操作方法[12],培养24 h后吸取各组的细胞上清液,于540 nm处测定吸光值,并根据NO标准曲线计算NO含量。
1.3.4 文蛤肽QLNWD的体外模拟消化稳定性
参考栾晓旭等[13]的方法并略加修改。将1 mg/mL的QLNWD肽溶液用1 mol/L盐酸调至pH 2.0,加入4 g/100 mL的胃蛋白酶(基于INFOGEST国际标准,终活性2 000 U/mL),于37 ℃水浴中模拟胃消化2 h。随后用0.9 mol/L NaHCO3调节pH为5.3,再以1 mol/L NaOH调节pH至7.0,加入4 g/100 mL的胰酶(终活性100 U/mL),于37 ℃水浴中模拟肠消化2 h。取消化液沸水浴灭酶10 min,冷却后4 ℃、10 000 r/min离心10 min,收集上清液。以未消化样品为对照,每30 min取一次消化样品,经0.22 μm滤膜过滤后,进行HPLC分析。色谱条件:ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为含0.05%(体积分数)三氟乙酸的乙腈(A)和超纯水(B);流速1 mL/min,进样量10 μL,紫外检测波长220 nm,梯度洗脱程序为10 min 内A相由32%升至47%,QLNWD保留率的计算如公式(3)所示:
保留率
(3)
式中:m3,未被降解的肽质量,mg;m4,总肽质量,mg。
继续采用CCK-8法测定QLNWD在模拟胃肠消化前后的促细胞增殖能力。消化后的样品经离心取上清液,调节pH至7.4后,进行冷冻干燥与复溶,并经0.22 μm滤膜无菌过滤。随后,以初始浓度等效值处理细胞,实验设置不含肽段的空白消化液作为对照,以排除消化过程本身对细胞活性的干扰。具体实验方法同1.3.3.1节。
1.3.5 QLNWD的加工贮藏稳定性
1.3.5.1 热稳定性
将等体积的1 mg/mL的QLNWD肽溶液分别置于25、37、60、80、100 ℃下水浴2 h,随后冷却至室温,以未经加热处理的肽为对照组,测定其保留率和促细胞增殖能力。
1.3.5.2 pH稳定性
将1 mg/mL的QLNWD肽溶液调节至不同初始pH值(3.0、5.0、7.0、9.0、11.0),室温振荡24 h后,统一调整溶液pH为7.0,以未经pH处理的肽为对照组,测定其保留率和促细胞增殖能力。
1.3.5.3 金属离子稳定性
将1 mg/mL的QLNWD肽溶液与不同金属离子(KCl、CaCl2、FeCl3和MgCl2)共混合,各离子的终质量浓度均设置为50、100、250 μg/mL,室温振荡24 h后,以不含金属离子的肽为对照组,测定其促细胞增殖能力。
1.3.5.4 贮藏稳定性
配制1 mg/mL的QLNWD肽溶液,分别置于4 ℃和25 ℃下避光贮藏,在第3、7、14、21、28天测定其保留率。
1.4 数据处理
实验结果平行测定3组,以“平均值±标准差”表示,采用SPSS 27.0统计软件进行分析和处理数据,并采用ANOVA和Duncan多重检验进行显著性分析(P<0.05表示差异显著)。
2 结果与分析
2.1 分子对接结果
海洋贝类蛋白质经酶解和分离纯化后可获得一系列具有明确序列的免疫调节肽,其序列与TLR蛋白分子对接结果见表1。目前常用的蛋白酶多为内切酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶等),但也有研究采用风味蛋白酶等外切酶作用于肽链末端的疏水性氨基酸,以降低产物的苦味[14]。与单一酶解相比,复合酶处理可通过扩大酶切位点,发挥协同效应,产生更小的酶解片段,有助于活性肽的释放[15]。免疫调节肽多为分子质量<2 000 Da、氨基酸残基数<20的短肽,其小分子肽特性有助于机体吸收。序列分析显示,Glu与Leu为出现频率较高的残基,且Leu与Arg倾向于富集于肽链的N端或C端。已有研究指出,免疫调节活性与Arg、Lys及His等带正电荷极性氨基酸的含量呈正相关性。其作用机制可能在于:此类阳离子肽可模拟趋化因子的电荷特性,优先结合免疫细胞表面的特异性受体,从而激活下游免疫信号通路[16]。
表1 贝类免疫调节肽的来源及分子对接得分
Table 1 Sources and molecular docking scores of immunomodulatory peptides derived from shellfish
来源来源拉丁学名水解酶肽序列长度分子质量/Da结合能/(kcal/mol)TLR2(ID:6 NIG)TLR4/MD-2(ID:3FXI)香港牡蛎[17]Crassostrea hongkongensis动物蛋白酶DNSIAMESMK101 125.28-6.1-7.6LLQLGSGR8842.99-7.8-8.0长牡蛎[18]Crassostrea gigas复合蛋白酶QCQCAVEGGL101 007.14-7.2-6.0青蛤[19]Cyclina sinensis胃蛋白酶RVAPEEHPVECRYLV151 797.06-7.8-7.5文蛤[20]Meretrix meretrix胰蛋白酶QLNWD5674.71-8.3-8.1文蛤[21]Meretrix meretrix胰蛋白酶HKGQCC6674.79-5.4-7.3波纹巴非蛤[22]Paphia undulata碱性蛋白酶PHTC4 456.52-1.3-1.3EF2294.31-6.3-6.5LF2278.35-6.9-6.4EGAK4403.44-6.4-6.1WI2317.39-7.3-6.4WL2317.39-6.9-6.2马氏珠母贝[15]Pinctada martensi复合蛋白酶AR2 245.28-5.3-5.6PM2246.32-4.9-5.6厚壳贻贝[14]Mytilus coruscus风味蛋白酶GVSLLQFFL91 023.24-7.4-7.2厚壳贻贝[23]Mytilus coruscus胰蛋白酶LVVLGH6636.79-7.7-6.4
TLR是先天性免疫中关键的跨膜受体,参与调控细胞吞噬、信号转导和凋亡等过程。其中,TLR4的激活依赖于MD-2蛋白与LPS的结合,是其发挥功能的关键[24]。采用分子对接技术预测了16条肽与受体蛋白TLR2和TLR4/MD-2结合能,结合能的负值越大,表示该肽段与受体结合的越紧密。结果显示,TLR2因其结合口袋较小,对含有特定疏水性(如Leu、Val、Gly、Phe)或芳香基氨基酸(如Tyr、Trp、Phe)的肽段表现出较高亲和力,如QLNWD(-8.3 kcal/mol)、LLQLGSGR(-7.8 kcal/mol)和LF(-6.9 kcal/mol)。相比之下,TLR4/MD-2复合体更易于结合长度>5个氨基酸,且富含酸性氨基酸(Asp、Glu)的肽段。由于MD-2内部存在1个富含正电荷的LPS结合口袋,肽段可通过电荷互补与之高效对接。例如,QLNWD(-8.1 kcal/mol)、DNSIAMESMK(-7.6 kcal/mol)和RVAPEEHPVECRYLV(-7.5 kcal/mol)均凭借其酸性氨基酸残基与该正电区域发生强静电相互作用,从而表现出较高的结合活性。
基于结合能最优原则筛选出QLNWD、LLQLGSGR和RVAPEEHPVECRYLV这3条肽段,同时,为控制物种变量以探究序列差异的影响,还纳入了同样来源牡蛎且结合能达标(<-6.0 kcal/mol)的肽段DNSIAMESMK,用于分析与TLR2及TLR4/MD-2的相互作用模式(图1和图2)。与TLR2的对接结果表明(图1),QLNWD与TLR2分子的氨基酸残基Ser346、Phe349、Tyr332和Leu350形成氢键,LLQLGSGR与TLR2分子的Leu350、Phe349、Trp332和Leu328形成氢键,RVAPEEHPVECRYLV与TLR2分子形成氢键的氨基酸残基为Pro306、Met270、Leu328、Ser329和Tyr332形成氢键,DNSIAMESMK则为Ala297、Asp327、Leu350和Tyr332。类似于一种TLR2的激动剂Pam3CSK4,Asp327、Leu328、Tyr332和Leu350是介导其与TLR2结合的关键残基[25],说明4条肽可以作用于与Pam3CSK4相似的位点。与TLR4/MD-2的相互作用分析显示(图2-a),QLNWD通过多种非键作用与受体结合,包括与Ser482、Arg460、Thr459、His458、Lys480、Gln507、Phe483和Asn486等残基形成氢键、碳氢键、π-阳离子及π-供体氢键等。4条肽与TLR4/MD-2之间的相互作用以常规氢键和碳氢键为主,这些作用力显著增强了肽-受体结合的稳定性。分析表明,Asn486、Gln507、Ser482、His456和Arg460是介导QLNWD、LLQLGSGR和DNSIAMESMK与TLR4/MD-2结合的关键残基,此外,在RVAPEEHPVECRYLV与受体的对接模型中发现了Arg90和Arg264等关键残基,暗示该肽可能以类似于LPS的方式促进TLR4/MD-2二聚化[26]。
a-QLNWD;b-LLQLGSGR;c-RVAPEEHPVECRYLV;d-DNSIAMESMK
图1 肽段与TLR2(PDB ID:6 NIG)互相作用的3D和2D模式图
Fig.1 3D and 2D interaction profiles between peptides and TLR2 (PDB ID:6 NIG)
a-QLNWD;b-LLQLGSGR;c-RVAPEEHPVECRYLV;d-DNSIAMESMK
图2 肽段与TLR4/MD-2(PDB ID:3FXI)互相作用的3D和2D模式图
Fig.2 3D and 2D interaction profiles between peptides and TLR4/MD-2 (PDB ID:3FXI)
a-RMSD;b-RMSF;c-Rg;d-SASA
图3 分子动力学模拟结果
Fig.3 Molecular dynamics simulation results
2.2 分子动力学模拟
通过100 ns分子动力学模拟验证了4条肽段与TLR4/MD-2复合物的结合稳定性,以评估分子对接所得亲和度预测的可靠性[27]。RMSD用于评估复合物结构的稳定性和构象变化,较低的RMSD表明复合物具有更好动态稳定性。由图3-a可见,4条肽与TLR4/MD-2复合物的RMSD值在模拟20 ns后均趋于平稳,稳定值在0.065～0.070 nm左右,说明复合物在分子模拟过程中的整体构象变化相对平稳。氨基酸残基的局部柔性通过RMSF反映(图3-b),4个体系中大部分氨基酸残基的RMSF值低于0.05 nm,表明整体结构刚性较强。其中,QLNWD-TLR4/MD-2复合物在595～610和1 200～1 205残基区间出现了显著的波动峰,这可能与肽段配体进入蛋白空腔的过程相关,表明这些区域为配体结合提供了必要的构象柔性[28]。复合物结构的紧密程度通过Rg衡量(图3-c),4个复合体系的Rg值均稳定在4.005～4.020 nm的狭窄范围内,说明蛋白质在结合配体后未发生显著的构象膨胀,结构保持紧凑。
SASA用于评价肽段配体与蛋白结合时的疏水作用和折叠稳定性。如图3-d所示,在10 ns分子动力学模拟后,4种复合物的SASA值主要波动范围在185～200 nm2,波动幅度较小,表明结合物整体保持稳定。进一步通过MM/GBSA方法计算结合自由能(表2),在QLNWD-TLR4/MD-2和RVAPEEHPVECRYLV-TLR4/MD-2复合物中,静电相互作用ΔGele对结合能的贡献均占主导地位,其绝对值大于范德华相互作用ΔGvdw,并远大于疏水相互作用ΔGnonpolar。然而,RVAPEEHPVECRYLV极性溶剂化能ΔGpolar过高,导致其总结合自由能低于QLNWD,甚至低于LLQLGSGR。相比之下,QLNWD具有最低的总结合自由能,该计算结果与前期分子对接的亲和力趋势一致。因此,综合分子对接和分子动力学模拟的分析结果,选择QLNWD、RVAPEEHPVECRYLV、LLQLGSGR及DNSIAMESMK这4条肽段进行后续的细胞实验验证。
表2 复合物的结合自由能和能量组分 单位:kcal/mol
Table 2 Binding free energy and its constituent energy components of the complex
能量组分QLNWD-TLR4/MD-2LLQLGSGR-TLR4/MD-2RVAPEEHPVECRYLV-TLR4/MD-2DNSIAMESMK-TLR4/MD-2ΔGvdw-107.16±3.71-76.14±3.21-116.66±4.23-100.96±3.79ΔGele-443.49±10.59-11.27±4.39-447.53±11.88-15.48±6.56ΔGpolar489.63±9.6453.84±3.78545.90±10.57100.38±5.74ΔGnonpolar-13.26±0.23-9.72±0.22-18.74±0.41-14.86±0.26ΔGgas-550.64±11.45-87.41±4.94-564.20±12.08-116.43±7.14ΔGsolv476.38±9.5944.12±3.69527.17±10.5485.51±5.63ΔGtotal-74.27±4.66-43.29±3.78-37.03±5.02-30.92±4.98
注：ΔGvdw-肽与蛋白的范德华相互作用;ΔGele-静电相互作用;ΔGpolar-极性溶剂化;ΔGnonpolar-非极性溶剂化;ΔGgas-气相分子力学项;ΔGsolv-溶剂化能;ΔGtotal-总结合自由能。
2.3 优选肽的细胞免疫活性验证
2.3.1 优选肽对RAW264.7细胞活力的影响
如图4所示,QLNWD表现出明显的促增殖作用,且呈剂量依赖性,在500 μg/mL时细胞存活率达到峰值。对比之下,RVAPEEHPVECRYLV、LLQLGSGR和DNSIAMESMK在较低浓度范围内表现出更强的促进增殖效应。RVAPEEHPVECRYLV(6.25～50 μg/mL)、LLQLGSGR(6.25 μg/mL和12.5 μg/mL)、DNSIAMESMK(6.25～25 μg/mL)对细胞增殖活性较高,该趋势与已有文献报道一致[17,19,29]。在后续的实验中,为验证可能高于增殖实验的最佳效应浓度,对RVAPEEHPVECRYLV、LLQLGSGR和DNSIAMESMK统一采用25～250 μg/mL的质量浓度进行平行比较;而对在增殖实验中显示峰值效应浓度为500 μg/mL的QLNWD,则将其实验浓度范围设定为50～500 μg/mL。
图4 活性肽对RAW264.7细胞活力的影响
Fig.4 Effect of peptides on the viability of RAW264.7 cells
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(图7、图8同)。
2.3.2 优选肽对RAW264.7细胞吞噬能力的影响
巨噬细胞可以通过吞噬作用识别并吞噬病原体,图5评价了4条肽段对RAW264.7细胞吞噬作用的影响,与空白对照组相比,500 μg/mL的QLNWD、50 μg/mL 的RVAPEEHPVECRYLV和100 μg/mL的LLQLGSGR均显著增强了细胞的吞噬作用。其中,QLNWD在500 μg/mL时促进效果最为明显(P<0.01),吞噬指数为1.26±0.02,但其作用仍低于LPS阳性对照组。研究表明,免疫调节肽可借助其末端特征性残基(如Arg、Trp、磷酸化Ser或Glu)被免疫细胞表面的δ-、μ-型或κ-型阿片受体识别,此识别过程激活中枢阿片受体,从而间接调控免疫应答[30]。QLNWD、RVAPEEHPVECRYLV和LLQLGSGR在相应适宜的质量浓度条件下表现出最佳的促吞噬功能,其末端结构可能参与了类似的受体识别与免疫调节机制。
图5 活性肽对RAW264.7细胞吞噬能力的影响
Fig.5 Effect of peptides on phagocytosis activity in RAW264.7 cells
注:与空白对照组相比,*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001(图6同)。
2.3.3 优选肽对RAW264.7细胞NO释放量的影响
NO是免疫应答中的重要信号分子,可由激活的巨噬细胞分泌并用于清除病原体。如图6所示,QLNWD以剂量依赖的方式极显著地促进了RAW264.7细胞NO的释放,其在500 μg/mL质量浓度下的NO释放量为4组肽样品中最高,但仍低于LPS阳性对照组。与分子对接和动力学模拟所预测的趋势一致,体外细胞实验结果表明,QLNWD在4条候选肽中表现出最强的免疫调节活性,能够通过提高细胞吞噬能力和NO释放量增强RAW264.7细胞的免疫活性。
图6 活性肽对RAW264.7细胞NO释放量的影响
Fig.6 Effect of peptides on NO release in RAW264.7 cells
2.4 体外模拟消化稳定性
口服给药是活性肽最便利和消费者接受高的方式,但其生物利用度受胃肠消化酶解稳定性的显著影响。因此,评估了优选肽段QLNWD在模拟胃肠消化环境中的稳定性。图7中QLNWD的保留率随消化时间延长而降低,尤其在接触胰酶30 min后被快速降解,经胃消化和完整胃肠消化后,其保留率分别降至(74.63±0.05)%和(10.48±0.39)%。LIANG等[31]也报道了类似现象,这主要归因于胰酶成分的复杂性,包含了胰蛋白酶、羧肽酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶等多种酶类,可协同作用于多肽链。此外,QLNWD经消化后,其促细胞增殖活性降低至(100.29±1.51)%,与消化前相比显著降低了约21%(P<0.05),这一趋势与乳源血管紧张素转化酶抑制肽RLSFNP[32]的表现类似。这与消化酶的切割特异性及肽段的构效关系密切相关,胃蛋白酶偏好切割芳香族氨基酸(Phe、Tyr和Trp)和Leu的羧基端,而胰蛋白酶则特异性切割Lys和Arg[33],从而导致活性肽段的破坏和功能丧失。
图7 体外模拟消化过程中QLNWD的保留率和细胞增殖活性
Fig.7 Retention rate and cell proliferative activity of QLNWD during in vitro simulated digestion
2.5 加工贮藏稳定性
活性肽在口服前的生物活性易受加工与贮藏条件的影响,包括热处理、pH环境及食品基质等[10]。图8-a显示,与室温相比,QLNWD经80 ℃处理2 h后保留率下降约26%。当温度升至100 ℃时,保留率仅为34.90%,其促细胞增殖活性也显著降低(P<0.05)。栾晓旭等[13]指出持续的高温会破坏多肽的二级结构,引发变性或聚集。另有研究认为Asp残基在高温下易发生脱酰胺化,改变多肽的电荷分布和空间构象,导致其活性降低[34]。如图8-b所示,QLNWD在中性条件下促RAW264.7细胞增殖率显著高于强酸和强碱条件(P<0.05),在pH 11.0环境下反应24 h后,其保留率下降约5%。裴云成等[35]发现强碱性环境显著降低杏鲍菇柄多肽的抗氧化活性,可能与碱性环境会促进多肽发生外消旋或脱酰胺反应有关。朱巧楠等[36]则认为pH依赖的多肽溶解性变化可能是其活性差异的关键机制之一。因此,为维持QLNWD的免疫活性,在食品加工中应避免高温与强碱条件。
a-温度;b-pH值;c-金属离子;d-贮藏时间
图8 QLNWD的加工贮藏稳定性
Fig.8 Processing and storage stability of QLNWD
如图8-c所示,50、100 μg/mL的K+和100、250 μg/mL 的Ca2+对QLNWD的促细胞增殖活性无显著影响。Fe3+的影响最为明显,当Fe3+质量浓度达到250 μg/mL时,其活性约为初始值的75%。不同金属离子对多肽的影响程度有差异,可能与多肽与金属离子的络合能力及络合物构象变化有关[37]。在不同温度下贮藏28 d后(图8-d),QLNWD在4 ℃和25 ℃条件下的保留率分别降至(73.75±1.06)%和(39.03±0.04)%,表明升温加速了QLNWD的降解。
3 结论
本研究基于分子对接和分子动力学模拟技术,从16条已知序列的贝类免疫调节肽中筛选出4条候选肽(QLNWD、RVAPEEHPVECRYLV、LLQLGSGR和DNSIAMESMK)。这些肽段不仅与TLR4/MD-2受体表现出良好的结合亲和力,而且其中QLNWD的复合物结合构象稳定性最为突出。体外细胞实验表明,QLNWD在促RAW264.7巨噬细胞吞噬功能和NO释放方面活性最强,与模拟预测结果相符。然而,该肽段的稳定性面临挑战:体外模拟消化结果表明QLNWD易在模拟胃肠环境中被酶解,保留率较低;此外,其活性易受高温、强碱及Fe3+等因素影响。因此,在实际应用中需采用包埋或结构修饰等策略,以提高其稳定性和生物利用度。本研究通过多维度横向评价体系,明确了文蛤肽QLNWD的免疫调节潜力与应用局限性,为海洋源活性肽在功能食品与药物开发中的理性利用提供了数据支撑与理论参考。
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