甜瓜螺(Cymbium pepo)是一种西非海螺,螺肉肥厚宽大,斧足发达,体积巨大,可食性高,繁殖快,年产量达3 000 t[1],主要来源于我国在太平洋捕捞,常被加工成螺肉片或制成干制品,但其表面含黏液多、腥味重、硬度大,限制了甜瓜螺的开发利用。甜瓜螺作为新品种海螺,目前的开发和研究较少,导致其利用率和经济价值相对较低,造成资源的浪费。因此,对甜瓜螺的开发和知识体系的补充报道至关重要,是扩大其消费市场和减少其资源浪费的有效途径。
海洋动物生长在特殊的海洋环境,导致其具有结构新颖和功能特殊的生物活性物质。且海洋动物富含蛋白质,是制备水解物的丰富来源。其中蛋白酶水解法是产生水解物的常用方法,能提高原料的营养价值、功能特性和生物活性,也是实现原料高值化利用的重要途径。LUO等[2]用胃蛋白酶和胰蛋白酶水解Rapana venosa(脉红螺)肉制得的水解物具有抗氧化性,PETSANTAD等[3]用胃蛋白酶和胰蛋白酶水解Babylonia areolata(方斑东风螺)肉蛋白制得的水解物也同样具有抗氧化性。常用的蛋白酶[4]包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶,由于蛋白酶酶切位点、原料和水解条件的不同,导致水解物在结构、功能特性和生物活性上存在差异[5]。
本实验研究甜瓜螺肉并验证其潜在用途,填补甜瓜螺的理化性质和5种蛋白酶水解甜瓜螺制备水解物的知识空白,并探索了水解物的理化、结构和功能特性,以期为进一步探索甜瓜螺和水解物提供宝贵的信息资源,并有效地加强其未来的开发利用,提高甜瓜螺的经济效益。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
冷冻的甜瓜螺肉,中国水产总公司舟山分公司。
胃蛋白酶、中性蛋白酶,上海麦克林生化科技股份有限公司;胰蛋白酶,上海安迪生物科技有限公司;碱性蛋白酶,上海源叶生物科技有限公司;风味蛋白酶,北京索莱宝科技有限公司;异丙醇,山东科源生化有限公司;牛血清蛋白,广州赛国生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
UV-2600i紫外可见近红外分光光度计,日本岛津公司;Zetasizer pro激光粒度仪,马尔文纳帕科公司;CHIRASCAN VX圆二色光谱仪,英国应用光物理公司;F-7100三维荧光光谱仪、LA8080超高速全自动氨基酸分析仪,日立高新技术公司;HXLG-10-50B真空冷冻干燥机,上海沪析实业有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 甜瓜螺肉的理化性质分析
1.3.1.1 基本营养成分
水分含量:参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中直接干燥法;蛋白质:参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法;灰分:参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》中高温灼烧法;脂肪:参照GB 2009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》中索氏抽提法。
1.3.1.2 矿物质元素分析
参照GB 5009.268—2016《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》的电感耦合等离子体质谱法和GB 5009.87—2016《食品安全国家标准 食品中磷的测定》,包括5种常量元素和4种微量元素。
1.3.2 不同蛋白酶水解甜瓜螺肉
1.3.2.1 甜瓜螺肉的水解
将甜瓜螺肉解冻,洗净表面杂质,切块,按料液比1∶10(g∶mL)加入10%(体积分数)异丙醇,脱脂6 h,清洗沥干,搅碎螺肉。以20%(质量分数,下同)的底物浓度添加搅碎螺肉和蒸馏水,然后分别加入2.0%的胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶,控制在不同酶解条件(表1)下酶解4 h,随后沸水灭酶10 min,冷却至室温,离心(4 ℃、10 000 r/min、10 min)过滤,收集上清液,冷冻干燥,得甜瓜螺肉水解物粉末,贮存在4 ℃备用。
表1 蛋白酶的最适pH和温度
Table 1 Optimum pH and temperature of proteases
蛋白酶最适pH最适温度/℃胃蛋白酶(WDB)237 胰蛋白酶(YDB)837 碱性蛋白酶(JDB)1050 中性蛋白酶(ZDB)750 风味蛋白酶(FDB)7.550
注：WDB、YDB、JDB、ZDB和FDB分别为5种蛋白酶制得水解物的缩写。
1.3.2.2 水解度测定
参考唐鹏杰等[6]的方法稍作修改,取15 mL水解液和60 mL去离子水混匀,用0.05 mol/L NaOH标准滴定液滴定至pH 8.2,加入10 mL 20%中性甲醛溶液,混匀静置2～3 min。然后滴定至pH 9.2,记录NaOH消耗量(V2)。空白组用去离子水代替水解液,记录NaOH消耗量(V1)。其计算如公式(1)和公式(2)所示:
式中:C,NaOH标准滴定液的浓度,mol/L;A1、A0,水解液、水解前溶液的游离氨基态氮含量;A,水解前溶液的总氮含量。
1.3.2.3 多肽含量的测定
按照石菊芬[7]的方法稍作修改,2.5 mL水解液和2.5 mL 10%三氯乙酸溶液混匀静置,离心10 min,取1 mL上清液和4 mL双缩脲试剂在540 nm处测其吸光度,利用牛血清蛋白作为标准曲线,计算上清液的多肽含量。
1.3.2.4 SDS-PAGE
准确称量5 mg水解物样品,加入200 μL Tris-EDTA缓冲液(pH 8.0,10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA)和50 μL样品缓冲液,然后在100 ℃下煮沸5 min,冷却后上样。将5 μL Marker(10～200 kDa)和10 μL经处理的水解物样品分别载入BeyoGelTM SDS-PAGE预制胶(4%～20%)内,先在80 mV下运行0.5 h,然后调整到120 mV下运行1.5 h。电泳结束后用快速染色液进行染色,并在摇床上进行固定,随后水洗脱色,拍照。
1.3.2.5 氨基酸组成
参考GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》。称取一定质量的水解物样品,加入10 mL 6 mol/L盐酸,水解22 h,冷却至室温。1 mL样液干燥后用pH 2.2柠檬酸钠缓冲液溶解,过0.22 μm滤膜后上样。
1.3.3 结构特征
1.3.3.1 粒径分布、多分散指数(polydispersity index, PDI)及zeta电位分析
水解物样品配制成1 mg/mL的溶液,通过激光粒度仪测定粒径分布、PDI和zeta电位。
1.3.3.2 紫外光谱的测定
水解物样品配制成1 mg/mL的溶液,置于石英管中,扫描波长190～400 nm范围内测量紫外吸收波长的变化。
1.3.3.3 圆二色光谱的测定
水解物样品配制成1 mg/mL的溶液,分析其圆二色光谱,扫描范围190～260 nm,比色皿光径0.1 cm,扫描间隔1 nm,使用杨氏算法拟合计算二级结构的比例。
1.3.3.4 荧光光谱的测定
水解物样品配制成1 mg/mL的溶液,在290 nm下测量水解物在300～500 nm处的荧光发射光谱,恒定狭缝5 nm。
1.3.4 功能特性
1.3.4.1 溶解度和吸水性
根据WANG等[8]的方法稍作修改。将100 mg的水解物样品溶解在20 mL去离子水中,涡旋2 min后,将混合物离心5 min。将15 mL上清液在110 ℃的烘箱中干燥4 h。其计算如公式(3)所示:
溶解度
(3)
式中:m1、m2,溶解的水解物样品和干燥上清液的质量。
吸水性:称取0.5 g水解物样品于培养皿中,称量其与培养皿的总质量;将培养皿置于室温24 h,观察24 h后培养皿的质量变化。其计算如公式(4)所示:
吸水性
(4)
式中:m1,样品放置后质量;m0,样品放置前质量。
1.3.4.2 持水性(water-holding capacity, WHC)和持油性(oil-holding capacity, OHC)
参考BING等[9]的方法稍作修改,将0.5 g水解物样品与10 mL去离子水涡旋1 min后静置,离心10 min,去除上清液,称量离心管与沉淀物质量(m2);使用大豆油代替去离子水测量OHC。其计算如公式(5)所示:
(5)
式中:m2,离心管与沉淀物的质量;m1,样品放置前的质量;m0,空离心管的质量。
1.3.4.3 乳化活性指数(emulsification activity index, EAI)和乳化稳定性指数(emulsion stability index, ESI)
参考YANG等[10]的方法稍作修改,将1%水解物溶液(6 mL)与大豆油(2 mL)混合,匀浆2 min。分别在0 min和10 min从底部吸取100 μL乳状液,加入10 mL 0.1% SDS溶液涡旋。在500 nm处测定0 min 和10 min处的吸光度,其中0.1% SDS(10 mL)视为空白。其计算如公式(6)和公式(7)所示:
(6)
(7)
式中:A0、A10,0、10 min时的吸光度;DF,稀释系数,100;c,水解物质量浓度,g/mL;φ,油相体积分数,0.25。
1.3.4.4 起泡性(foaming ability, FA)和泡沫稳定性(foaming stability, FS)
制备10 mg/mL水解物溶液,常温下对溶液均质2 min制成泡沫。测量搅打0 min和搅打后10 min的泡沫体积数。其计算如公式(8)和公式(9)所示:
(8)
(9)
式中:V0、V,搅打后0 min、搅打前的体积;V10,搅打停止10 min的体积。
1.4 数据处理
实验均重复3次,图表使用Origin 2021软件绘制,使用Excel和SPSS软件处理数据,小写字母表示差异显著(P<0.05)。
2 结果与分析
2.1 甜瓜螺肉的基本成分
甜瓜螺肉的4种基本营养成分中水分含量最高,为(76.09±0.15)%,含水量高赋予螺肉多汁的品质,其次是蛋白质含量(14.95±0.20)%,灰分含量2.88%,脂肪含量(0.56±0.11)%,此外还含有糖原等能量储备物质[11]。海洋生物的营养成分差异[12]与性别、年龄、捕获季节、性腺成熟阶段、生活环境和饮食结构息息相关。甜瓜螺肉的蛋白质含量丰富,脂质含量远低于其他海洋软体动物,因此非常适合制备水解物。
2.2 甜瓜螺肉的矿物质元素
常量元素在人类生长发育过程中发挥着积极作用,而微量元素对代谢和生化过程至关重要。甜瓜螺肉富含人体所需的钾、钠、镁、钙等元素,含量分别为(1 400.93±26.72)、(7 818.95±478.17)、(2 702.38±79.76)、(821.12±7.65) mg/kg,但磷含量低于检出限。在微量元素中,铁含量最为丰富,为(14.37±0.14) mg/kg,其次是锌,含量为(10.91±0.29) mg/kg,甜瓜螺中富含铁、铜、锌、硒,可以作为营养补充剂的良好来源。
2.3 甜瓜螺肉水解物的理化性质
2.3.1 水解度和多肽含量
水解物的性质通常与水解度和多肽含量有关,水解度的定义是水解的肽键数占肽键总数的比例[13],水解物通过蛋白酶水解原料蛋白获得,因此水解物的多肽含量也反映了蛋白酶的水解效率[14]。如图1所示,蛋白酶的特异性导致了裂解位点不同,从而使5种蛋白酶的酶解效果存在差异,其中碱性蛋白酶制得的水解物具有较高的水解度(23.10%)和多肽含量(5.505 mg/mL),可能是因为碱性蛋白酶是一种非特异性内切酶[15],作用于Met、Leu、Tyr、Lys及Gln等羧端肽键,具有更广泛的酶切位点,导致水解度和多肽含量高于其他蛋白酶。在特定条件下,酶切位点越多,酶切产物的分子质量越小,水解程度和多肽含量也就越高。
图1 五种水解物的水解度和多肽含量
Fig.1 Degree of hydrolysis and peptide content of five hydrolysates
注:不同小写字母表示有显著差异(P<0.05)(下同)。
2.3.2 SDS-PAGE分析
利用凝胶电泳验证了5种蛋白酶制得的水解物的分子质量分布,蛋白酶的水解作用导致蛋白质分子间的肽键断裂,产生低分子质量和小粒径的水解物。如图2所示,胃蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶制得的水解物在25～30 kDa之间具有条带,胰蛋白酶的水解物在15、25 kDa具有条带。其中,碱性蛋白酶水解甜瓜螺肉的效果最好,其分子质量低于10 kDa,说明碱性蛋白酶能有效水解甜瓜螺肉,形成更小的多肽和氨基酸。由于蛋白质中氨基酸的平均分子质量约为110 Da[16],因此所制备的5种水解物不是简单的氨基酸,而是被蛋白酶水解成肽段。
图2 五种水解物的SDS-PAGE图
Fig.2 SDS-PAGE results of five hydrolysates
2.3.3 氨基酸分析
氨基酸在人体生长和发育过程中扮演着重要角色,对蛋白质、细胞等物质的组成、平衡和调节具有重要作用。氨基酸的组成对水解物的功能特性和生物活性具有很大的影响。如表2所示,5种水解物共检查出17种氨基酸;5种水解物的总氨基酸分别为(53.14±0.27)、(61.59±1.40)、(66.75±0.36)、(60.29±1.00)、(56.58±0.45) g/100 g,蛋白酶水解丰富了甜瓜螺肉的氨基酸种类和含量,其中碱性蛋白酶制得的水解物总氨基酸含量最高,营养价值丰富。因此,5种水解物具有潜在的营养价值和生物活性,可以作为膳食补充剂。
表2 五种水解物的氨基酸组成 单位:g/100 g
Table 2 Amino acid compositions of five hydrolysates
氨基酸胃蛋白酶胰蛋白酶碱性蛋白酶中性蛋白酶风味胃蛋白酶天冬氨酸5.40±0.016.25±0.106.85±0.036.04±0.075.54±0.04苏氨酸2.35±0.002.74±0.052.99±0.022.64±0.032.46±0.02丝氨酸2.97±0.013.43±0.063.70±0.013.39±0.053.15±0.03谷氨酸8.70±0.0210.37±0.5610.92±0.0610.00±0.169.20±0.07甘氨酸8.13±0.048.68±0.139.29±0.059.64±0.219.17±0.05丙氨酸4.06±0.024.55±0.065.01±0.024.67±0.104.34±0.03半胱氨酸0.10±0.000.15±0.000.20±0.000.10±0.000.10±0.00
续表2
氨基酸胃蛋白酶胰蛋白酶碱性蛋白酶中性蛋白酶风味胃蛋白酶缬氨酸1.82±0.002.32±0.042.49±0.012.03±0.042.15±0.02蛋氨酸0.03±0.020.03±0.020.52±0.02—0.04±0.01异亮氨酸1.30±0.011.74±0.041.82±0.011.46±0.031.55±0.01亮氨酸3.51±0.014.20±0.084.50±0.033.86±0.073.53±0.02酪氨酸1.51±0.021.85±0.031.90±0.011.65±0.041.45±0.01苯丙氨酸1.40±0.011.64±0.041.80±0.011.53±0.031.37±0.01赖氨酸2.13±0.012.61±0.042.83±0.012.26±0.042.07±0.02组氨酸0.51±0.000.62±0.010.87±0.020.54±0.010.54±0.02精氨酸5.12±0.025.93±0.076.24±0.025.72±0.105.42±0.03脯氨酸4.10±0.074.47±0.064.82±0.024.75±0.014.49±0.07总氨基酸53.14±0.2761.59±1.4066.75±0.3660.29±1.0056.58±0.45
注：“—”表示未检出。
2.4 甜瓜螺肉水解物的结构特征
2.4.1 粒径分布、PDI和zeta电位
图3显示,胃蛋白酶制备的水解物粒径分布较宽,有2个明显的峰值,此外,与胃蛋白酶的水解物相比,胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶的水解物呈现出2个较小的分布峰,粒径较小。粒径的差异可能是由于螺肉中的蛋白质被酶分解成不同分子质量大小的多肽。5种水解物的PDI在0.18～0.42,其中YDB的PDI最小,分布更加均匀,而WDB最差。在5种水解物中,只有WDB具有正电荷,zeta电位为4.17 mV,其他4种水解物都具有负电荷,且zeta电位绝对值显著大于WDB,较高的zeta电位导致水解物具有较好的稳定性,对水解物的理化性质和功能特性有积极影响[17]。
a-粒径;b-PDI;c-zeta电位
图3 五种水解物的粒径、PDI和zeta电位
Fig.3 Particle size,polydispersity index,and zeta potential of five hydrolysates
2.4.2 紫外光谱分析
通过紫外光谱的最大吸收峰和峰强度的变化来说明蛋白质的相互作用,从而探究蛋白酶对水解物结构的影响。如图4所示,观察到水解物的最大吸收峰在220 nm附近,这是肽键上羰基的n→π*电子跃迁,电子吸收肽键发生跃迁,使其具有吸收峰[18]。其中YDB吸收峰最强,可能是水解作用使蛋白质分子之间展开,暴露出埋藏的疏水基团,增强了紫外的吸收峰,而WDB的吸收峰最弱。此外,在270 nm左右处出现吸收峰,说明水解物含有芳香族氨基酸[19],与苯环的共轭双键有关,从而导致吸收峰的增强。
图4 五种水解物的紫外光谱
Fig.4 UV spectra of five hydrolysates
2.4.3 圆二色光谱分析
圆二色光谱分为190～250 nm的远紫外区和250～320 nm的近紫外区,远紫外区用于检测蛋白质的二级结构[20]。由图5-a可知,5种水解物在190～210 nm处有明显的负谱带,而ZDB和FDB在220 nm左右处具有正谱带。
a-圆二色光谱;b-二级结构
图5 五种水解物的圆二色光谱和二级结构
Fig.5 CD spectra and secondary structure of five hydrolysates
蛋白酶在水解过程中将蛋白质降解,导致蛋白质的结构发生变化。图5-b显示了二级结构的相对比例,5种水解物主要由β-折叠(45%～48%)组成,其次是β-转角(30%～33%)、无规卷曲(8%～14%)和α-螺旋(7%～17%)。α-螺旋的含量最低,β-折叠和β-转角的含量较高,这可能与酶解后水解物的结构更加开放和松散有关,导致蛋白酶的酶解位点更容易与甜瓜螺肉接触,从而提高水解度,降低分子质量。
2.4.4 荧光光谱的分析
测定了5种水解物的荧光光谱,蛋白质分子内部的荧光基团在特定的激发波长下会发出荧光,其中芳香族氨基酸苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的相互作用影响荧光强度和波长变化,从而产生内源性荧光[21],因此,通过观察荧光强度的变化和最大吸收波长预测水解物的三级结构变化。图6显示了5种水解物在300～500 nm范围内的发射光谱,5种水解物在350 nm处具有最大吸收峰,其中YDB的荧光强度最大,可能是酶解作用破坏水解物的结构,导致蛋白质内部的芳香族氨基酸暴露,其次是JDB、ZDB、FDB,WDB,这些结构变化也为水解物的理化性质和功能特性提供理论支持。
图6 五种水解物的荧光光谱
Fig.6 Fluorescence spectra of five hydrolysates
2.5 甜瓜螺肉水解物的功能特性
2.5.1 溶解性和吸水性
水解物的氨基酸组成和结构变化是影响其功能特性的重要因素,水解物的功能特性决定其在生产、加工和贮藏中的应用,溶解度和吸水性是各种食品应用中必不可少的功能特性。如图7所示,在不同蛋白酶水解下,水解物的溶解度都在60%以上,可能是酶解降低了蛋白质的分子质量,增加了游离氨基和羧基数量,导致水解物的静电斥力增大,促进水与水解物的相互作用,从而提高了溶解度。其中碱性蛋白酶和风味蛋白酶的水解物具有较高的溶解度,溶解度高可能与水解物较低的分子质量和较多极性氨基酸有关,能更好地与水分子形成氢键[22]。吸水性反映了水解物吸附或摄取水分的能力,吸水能力与氨基酸的组成和结构有关,水解物的带电基团越多和结构越松散,其吸水性越大[23],其中风味蛋白酶制备的水解物吸水性优于其他4种水解物。
图7 五种水解物的溶解性和吸水性
Fig.7 Solubility and absorbency of five hydrolysates
2.5.2 WHC和OHC
WHC和OHC被定义为单位质量蛋白质吸收和保留水或油的量[9],水解物的亲水氨基酸与水相互作用,从而具有WHC[24],如图8所示,胃蛋白酶和风味蛋白酶制备的水解物WHC最高,可能与含有较多的亲水氨基酸有关。酶解使疏水氨基酸暴露在环境中,从而赋予水解物具有优异的OHC,水解物的非极性氨基酸与脂质的碳氢链形成疏水相互作用,决定了不同蛋白酶水解物的OHC[25]。中性蛋白酶制备的水解物OHC最好,可能是中性蛋白酶在水解过程中暴露较多的疏水氨基酸,导致其吸收更多的油,其次是碱性蛋白酶。
图8 五种水解物的WHC和OHC
Fig.8 Water holding capacity and oil holding capacity of five hydrolysates
2.5.3 EAI和ESI
EAI表示蛋白质稳定油水的界面面积,ESI是蛋白质保持油水界面乳化稳定的能力[26]。在乳液形成过程中,蛋白质的亲水基团保留在水相中,疏水基团吸附在油水界面,形成保护层,防止油滴聚集[24]。如图9所示,中性蛋白酶制备的水解物EAI和ESI较大,可能是因为较大的粒径可以包裹和吸附更多的油;碱性蛋白酶和胰蛋白酶的水解物乳化性能较差,可能是分子质量较小和疏水基团的暴露,破坏亲疏水平衡,减弱界面张力,使乳化性能降低。有限的水解能提高其乳化性,而过度的水解导致乳化性能降低。
图9 五种水解物的EAI和ESI
Fig.9 Emulsification activity index and emulsifying stability index of five hydrolysates
2.5.4 FA和FS
起泡性能是水解物的重要功能,FA表明了蛋白质在空气-水界面吸附、迁移和重新定向的能力,FS是衡量蛋白质随时间变化保持泡沫体积的能力[27]。如图10所示,5种水解物中,碱性蛋白酶和胰蛋白酶的水解物具有较小的FA和FS,起泡性能差与水解物的结构和分子质量有关,肽链太短降低泡沫表面黏弹性和张力,从而减少薄膜厚度和气液界面的机械强度,最终导致起泡性能随分子质量减小而下降[10]。水解物起泡性能的差异可能是因水解物表面电荷的改变,这与水解物的分子质量和疏水相互作用强度的变化有关。
图10 五种水解物的FA和FS
Fig.10 Foaming ability and foaming stability of five hydrolysates
3 结论
研究表明蛋白酶水解对甜瓜螺水解物的理化、结构和功能特性有较大的影响。甜瓜螺是一种高蛋白、低脂肪的海洋动物,富含多种矿物质。5种蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶)将甜瓜螺水解成分子质量和结构更小的水解物,增加了水解度和多肽含量,丰富了氨基酸种类。不同蛋白酶水解甜瓜螺肉改变了水解物的二级和三级结构,使水解物的结构更加松散和灵活,并改善了水解物的功能特性,其中胃蛋白酶与其他4种蛋白酶有显著差异。总之,蛋白酶水解法改变了甜瓜螺肉水解物的理化性质和结构特性,从而影响功能特性。此外,本研究扩大了甜瓜螺的研究和开发利用,后续将对水解物的生物活性进行系统研究,为甜瓜螺在多领域的应用提供理论依据。
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