畜禽肉类是与蛋类、水产品并列的三大动物性食物之一,对全世界范围内的营养保障和食品安全具有重要意义,是均衡膳食的重要组成部分,也是人类必需的蛋白质、脂肪、维生素B2等营养素的重要来源。我国已有3 000多年的养驼历史,是世界上双峰驼的主要分布区域之一。目前我国约有骆驼33万多峰,主要分布在我国的西北地区,如新疆、内蒙古、甘肃、青海等地。骆驼肉凭借高蛋白、低脂肪、低胆固醇及高多不饱和脂肪酸的营养优势,已成为了新型食品开发的重要研究对象。研究表明,骆驼肉含有76%～78%的水分和19%的蛋白质,以及丰富的生物活性化合物[1],可用于治疗坐骨神经疼痛、关节痛和季节性发热等疾病[2]。双峰驼骆驼肉中含有丰富的α-亚麻酸(0.81～0.92 mg/g粗脂肪)[3],具有抗衰老、降血压、降血脂以及保护视力等功效。
紧致的肌肉纤维结构有助于维持良好的食用品质。肌原纤维蛋白(myofibrillar protein,MP)作为一种溶解性差、消化性低的盐溶性蛋白[4],构成了肌肉纤维的主要成分。MP是支撑肌肉运动的结构蛋白质,其主要组分是肌球蛋白和肌动蛋白,与肌肉运动机能紧密联系[5],还与肉制品的质构特性(如保水性、黏结性、质地和弹性等)密切相关。其中,MP的热诱导凝胶特性对肉制品的结构特性起关键作用。因此,MP的功能特性变化是反映肉制品组织微观结构变化的直观指标[6]。但在实际实验过程中,不同来源MP的适合pH值范围存在较大差异,且部分论文对缓冲液的pH值不明确,而pH值是影响MP及其凝胶功能特性的重要因素之一。目前已有一些关于pH值对MP影响的报道,KIM等[7]研究了不同pH值调节的分离昆虫蛋白对猪肉MP凝胶的功能特性,发现酸调节(pH 1)可以提高凝胶的弹性和红度值,碱调节(pH 10)可以提高凝胶的热稳定性和持水能力。DU等[8]研究了不同pH值对鲤鱼MP及其凝胶的影响,发现中性条件下(pH 6.0～7.0),MP可以形成稳定的凝胶结构。ZHENG等[9]研究了不同pH值对大黄鱼MP及其凝胶的影响,发现大黄鱼MP的等电点为5.5,在pH值为7.0时,大黄鱼MP凝胶达到最佳性能。
目前,针对骆驼肉MP的研究较少,未见pH值对骆驼肉MP及其凝胶性质影响的报道。因此,本研究以骆驼肉MP为研究对象,通过测定骆驼肉MP在不同pH值体系下的功能特性,如溶解性、疏水性、巯基含量、羰基含量、肌原纤维片段指数(myofibrillar fragmentation index,MFI)、SDS-PAGE和凝胶的色泽、保水性、微观结构,探究不同pH值(5.5～7.5)的磷酸缓冲液(0.01 mol/L KH2PO4,0.6 mol/L NaCl)对骆驼肉MP及其凝胶功能特性的影响,揭示pH值对骆驼肉MP的影响规律,以期为拓展骆驼肉制品的产业化应用提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
双峰驼后腿肉采自内蒙古自治区阿拉善盟,在冬季寒冷干燥的室外进行宰杀,气温低于-18 ℃,宰杀后立即对胴体进行分割并用塑封袋排气密封,置于液氮中,于24 h内运回位于内蒙古呼和浩特市的实验室,并放置于-80 ℃医用低温保存箱备用。
蛋白质Marker(11～245 kDa)、SDS-PAGE制胶试剂盒、双缩脲试剂,北京索莱宝科技有限公司;溴酚蓝,日本关东化学工业株式会社;无水乙醇、乙酸乙酯、三氯乙酸,天津新技术产业园区科茂化学试剂有限公司;TritonX-100,北京酷来搏科技有限公司;盐酸胍、乙二醇双α-氨基乙基醚四乙酸[glycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid,EGTA],上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
T6新锐可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;UV1102Ⅱ紫外分光光度计,上海天美科学仪器有限公司;FM200A高剪切分散乳化机,上海弗鲁克科技发展有限公司;IRSpiri-T傅里叶红外光谱仪,日本岛津制作所;Centrifuge5810R台式高速冷冻离心机,德国艾本德Eppendorf股份公司;E221JO08K蛋白染色仪,南京金斯瑞生物科技股份有限公司;DYY-6C电泳仪,北京六一生物科技有限公司;Synergy-H1酶标仪,美国伯腾BioTek仪器有限公司;TM4000PIus电子显微镜,日立制作所;90PIus zeta电位及粒度分析仪,美国布鲁克海文仪器公司。
1.3 实验方法
1.3.1 MP的提取和凝胶的制备
MP的提取:称取一定质量保存于-80 ℃冰箱内的肉样,切除筋膜与脂肪,加入10倍体积的1号缓冲液(KCl 0.1 mol/L,MgCl2 0.002 mol/L,EGTA 0.002 moL/L,K2HPO4 0.02 mol/L,pH 6.8),4 ℃下2 000×g离心15 min后取沉淀,然后用8倍体积的2号缓冲液(KC1 0.1 mol/L,MgCl2 0.002 mol/L,EGTA 0.002 mol/L,K2HPO4 0.02 moL/L,TritonX-100 10%,pH 6.8)洗2次,再用相同体积的KCl溶液(浓度为0.1 mol/L)洗2次,得到的沉淀为MP。为排除提取缓冲液对实验缓冲体系的影响,对得到的MP进行冷冻干燥48 h(图1),再用不同pH值的磷酸缓冲液进行溶解以进行后续实验。
图1 对MP进行前处理的流程
Fig.1 The process of pre-processing MP
参考DING等[10]的方法进行热诱导凝胶的制备:将上述蛋白质调为质量浓度40 mg/mL,搅拌均匀后移入50 mL离心管中,然后将其于40 ℃条件下加热30 min,然后立即转移至80 ℃条件下加热30 min,加热结束后立即置于冰水中快速冷却至室温,放置于4 ℃冰箱中保存过夜后进行相关指标测定。
1.3.2 溶解性的测定
参考DAI等[11]的方法。用磷酸盐缓冲液制备稀释样品,分散均匀后,用双缩脲法测定浓度,然后在4 ℃ 下4 100×g离心15 min,取上清液测定其蛋白质浓度。溶解度为离心前后的浓度比。
1.3.3 表面疏水性的测定
根据CHELH等[12]的方法进行测定。用蒸馏水配制1 mg/mL的溴酚蓝。样品组是将1 mL 5 mg/mL的MP分散液中加入200 μL的溴酚蓝。空白组则是将1 mL的样品用20 mmol的pH值为6.0的磷酸盐缓冲溶液替代。加样完毕后充分振荡,反应10 min,在25 ℃下 2 000×g离心。上清液稀释10倍后在595 nm下测吸光值。每组样品测定3次,最终结果以平均值表示。疏水性以溴酚蓝结合量表示,按公式(1)计算:
溴酚蓝结合量/μg=200×(Acontrol-Asample)/Acontrol
(1)
式中:Asample,样品上清液在595 nm下的吸光值;Acontrol,空白上清液在595 nm下的吸光值。
1.3.4 羰基含量的测定
参照OLIVER等[13]的方法。将MP样品稀释到5 mg/mL,分别取2份0.8 mol/L的MP溶液于离心管中。其中1份加入1 600 μL含有0.002 g/mL 2,4-二硝基苯肼的2 mol/L HCl溶液记为处理组;另1份加入1 600 μL的2 mol/L HCl溶液,记为空白组。分别在室温下反应30 min后,加入800 μL 0.4 g/mL的三氯乙酸溶液沉淀蛋白质,4 ℃、8 700×g离心15 min,移除上清液。然后加入2 mL的乙醇-乙酸乙酯混合液(1∶1,体积比)洗涤3次以除去未反应的2,4-二硝基苯肼,加入3 mL的磷酸盐缓冲液(20 mmol/L,pH 6.5,含有6 mol/L盐酸胍)溶解沉淀。放置过夜后,于370 nm波长处测定吸光度A370。按公式(2)计算蛋白质羰基含量:
蛋白质羰基含量
(2)
式中:A370,样品在370 nm处的吸光度;c,蛋白样品的质量浓度,mg/mL。
1.3.5 总巯基和活性巯基含量的测定
根据WEI等[14]的方法稍作修改。
总巯基的测定:取0.5 mL 1 mg/mL样品与5 mL总巯基试剂(20 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L EDTA,8 mol/L尿素,pH 6.0)试剂和100 μL Ellman试剂[10 mmol/L 5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、10 mmol/L K2HPO4,pH 6.0]振荡混匀。混合溶液在40 ℃的水浴锅中孵育25 min。取适量样品放置在光程为10 mm的比色皿中,以磷酸盐缓冲液作为空白,用紫外分光光度计测定412 nm下样品的吸光值。
活性巯基测定:取5.5 mL 1 mg/mL样品与100 μL Ellman试剂振荡混匀,混合溶液在4 ℃下静置1 h。测试方法同总巯基。
均按公式(3)计算巯基含量。
巯基含量/(μmol/g)=73.53×A412×D/ρ
(3)
式中:A412,样品在412 nm的吸光度;D,稀释系数;ρ,蛋白质量浓度,mg/mL。
1.3.6 MFI的测定
参考ILIAN等[15]的方法,称取0.5 g肉样,加入10倍体积的缓冲液(0.1 mol/L KCl、0.02 mol/L Na2HPO4、0.001 mol/L EDTA、0.001 mol/L MgCl2),2 000 r/min冰浴匀浆1 min,3 000×g冷冻离心15 min,取沉淀重复上述操作1次后,将最终沉淀用缓冲液重悬,采用双缩脲法测定蛋白质量浓度,并调至0.5 mg/mL,在540 nm测蛋白质吸光度A540,按公式(4)计算MFI:
MFI=A540×200
(4)
式中:A450,样品在450 nm的吸光度。
1.3.7 乳化特性的测定
乳化活性指数(emulsifying activity index,EAI)和乳化稳定性指数(emulsifying stability index,ESI)是用于评价凝胶的乳化能力的常见指标,参考WANG等[16]的方法并略作修改,将MP分散均匀后取1 mg/mL 20 mL MP溶液和5 mL大豆油混合匀浆1 min,结束后取50 μL乳浊液,加到5 mL 0.1 g/100 mL SDS溶液中,振荡均匀,静置10 min,于500 nm波长处测定吸光度,记为A1。将上述乳浊液静置3 h后从相同位置取50 μL,加入到5 mL SDS溶液中,并测定吸光度,记为A2,空白为上述SDS溶液。EAI和ESI分别按公式(5)和公式(6)计算。
(5)
(6)
式中:ρ,MP质量浓度,g/mL;φ,油相体积分数20%;D,稀释倍数。
1.3.8 粒径和zeta电位的测定
将1 mg/mL的MP溶液放比色皿中,再放入测量池内,用激光粒度仪分别测试粒径和zeta电位。
1.3.9 SDS-PAGE
根据LAEMMLI[17]的方法稍作修改,将MP质量浓度调至2 mg/mL,以体积比4∶1与蛋白上样缓冲液混合,并于100 ℃金属浴煮沸变性10 min,制得变性蛋白样品。
SDS-PAGE条件为:分离胶质量分数为12%,浓缩胶质量分数为4%,蛋白上样量为14 μg,先以80 V电压电泳直到指示条带迁移至浓缩胶与分离胶界限处,然后以120 V电压电泳直到指示条带迁移至距底端1 cm处结束,用考马斯亮蓝法染色,再用乙醇-冰乙酸-蒸馏水进行脱色,最后用凝胶成像系统拍照。
1.3.10 凝胶保水性和水分含量的测定
参照CHEN等[18]的方法。准确称取离心管的质量,记为m0。将10 g样品放入50 mL试管中,记录离心管和凝胶的总质量m1,在4 ℃,6 000×g离心20 min。除去水分,准确称量装有样品的离心管质量m2。凝胶保水性的计算按公式(7)进行:
保水性
(7)
凝胶水分含量的测定依据GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中的直接干燥法。
1.3.11 凝胶色泽和白度的测定
使用标准白板和黑板校准色度计,用滤纸拭干凝胶表面的水分后,测量凝胶表面的颜色。将仪表调整为亮度、红度和黄度(分别为L*、a*和b*)。白度值根据公式(8)得出:
白度值
(8)
1.3.12 凝胶微观结构的测定
根据NI等[19]的方法略作修改,从MP凝胶中心区域切下3 mm×3 mm×3 mm的立方体放入质量分数2.5%的戊二醇溶液中,在4 ℃冰箱中过夜,取出后用0.1 mol/L的磷酸缓冲液(pH 7.0)漂洗3次,每次15 min,以洗去戊二醇;再依次用体积分数30%、50%、70%、80%、90%的乙醇溶液进行梯度脱水,每次15 min,最后再使用无水乙醇脱水30 min,每次脱水时在摇床上振荡。将脱水后的样品进行冷冻干燥,镀膜后置于电子显微镜下观察。放大倍数2 000倍,电压5 kV。
1.4 数据处理
数据采用“平均值±标准偏差”表示,所有处理均重复3次。数据分析使用Excel 2019,并用Origin Pro 2021作图。显著性分析采用SPSS 25进行,P<0.05代表具有显著性差异。
2 结果与分析
2.1 功能特性
水合特性包括溶解性和疏水性,是MP的基础特性之一,直接决定了MP的其他功能特性。如图2-a所示,骆驼肉MP的水合特性在不同pH值间具有显著差异(P<0.05),溶解性在pH 5.5[(56.71±0.38)%]时最小,在pH 6.5[(73.74±0.45)%]时达到最大值,在pH 6.0～7.5降低,但在pH 7.0～7.5没有显著差异(P>0.05)。LEE等[20]发现猪肉MP溶解性在pH 7.0及以上时没有显著变化,与本实验的研究结果一致。而MP的疏水性则是随着pH值的升高逐渐降低,在pH 5.5时,MP的疏水性为(159.05±3.12) μg,在pH 7.5时,MP的疏水性为(91.87±5.22) μg。MP的等电点通常在5.0～5.5[21],MP的溶解性在等电点时最低,疏水性在等电点时最高[22],此时MP的净电荷趋近于零,分子间静电排斥力减弱,导致蛋白质分子通过疏水相互作用紧密聚集,这种不溶性体聚集的同时降低了MP的溶解度[23]。LE等[24]发现鲍鱼MP溶解性在pH 7.0时最高,在pH 5.5时溶解性最低;YU等[25]发现MP溶解性会在特定氨基酸的酸解离常数的负对数处产生1个峰值,这些结果与本实验的研究结果相近。疏水性与溶解性通常呈负相关[26],这与本实验结果不一致,可能是因为pH 6.5接近等电点,但此时MP的净电荷仍高于等电点,分子间静电斥力尚未完全消失,这种斥力可部分抵消疏水相互作用,使MP分子之间保持适当的分散性,从而提高其溶解度。同时,MP充分舒展使得MP表面暴露出更多极性基团,这些基团更倾向于与水分子形成蛋白质-水氢键[27]。MP二级结构中的α-螺旋是依靠MP分子内氢键形成的,β-折叠是依靠蛋白质分子间氢键形成的[28]。适当的pH值有利于维持MP良好的二级结构,增强α-螺旋,即分子内氢键,避免疏水基团过于暴露,从而提升溶解性。因此,与其他实验不同的是,以pH值为自变量的溶液体系通过静电斥力和氢键等多种作用力影响MP水合特性,呈现出一定的复杂性。
a-水合特性;b-巯基含量;c-羰基含量和MFI;d-乳化特性;e-zeta电位和平均粒径;f-粒径分布
图2 不同pH值对MP功能特性的影响
Fig.2 The effect of different pH values on MP functional characteristics
注:不同字母表示不同pH值之间存在显著性差异(P<0.05)(图4同)。
巯基是半胱氨酸残基侧链上的基团,是一种亲水基团,半胱氨酸的巯基是MP中活性最强的基团[29],MP中的总巯基包括其表面的活性巯基和深埋于分子内部的巯基,当蛋白质变性展开,原本包埋在蛋白内部的巯基暴露到表面,就成为了活性巯基[30]。二硫键的含量或状态影响加热过程中的蛋白质交联模式,并且对蛋白质凝胶特性至关重要[31]。如图2-b所示,总巯基含量和活性巯基含量都呈下降趋势,总巯基含量由pH 5.5时的(75.68±1.22) μmol/g下降到pH 7.5时的(33.40±2.91) μmol/g(P<0.05),活性巯基含量由pH 5.5时的(11.23±0.25) μmol/g下降到pH 7.5时的(6.13±0.47) μmol/g(P<0.05)。巯基含量的升高可能与水合特性密切相关,在较低pH值时,活性巯基可能受到保护,氧化程度较低,因此巯基含量较高,但在远离等电点的pH值环境下,蛋白质分子因静电斥力增强而展开,MP结构的展开可能使原本隐藏的巯基暴露,并加速其氧化或形成分子内和分子间二硫键,从而减少总巯基和活性巯基含量。
羰基是蛋白质氧化过程中氨基酸侧链被氧化形成的羰基化合物,反映蛋白质的氧化损伤程度[32]。如图2-c所示,MP的羰基含量在pH 6.0[(4.73±0.43) nmol/mg]时达到峰值,羰基含量在pH 5.5[(3.16±0.21) nmol/mg]和pH 6.5[(3.40±0.30) nmol/mg]、pH 7.0[(2.12±0.19) nmol/mg]和pH 7.5[(2.56±0.33) nmol/mg]之间没有显著性差异(P>0.05)。屈莎等[33]发现牦牛肉MP在pH 6.0时,相较于pH 5.0、7.0、8.0时更易被氧化,表现出更高的羰基含量,与本实验的研究结果一致。在MP氧化过程中,巯基与羰基含量通常呈负相关。在本实验中,羰基含量在pH 6.5时达到峰值,但巯基含量随着pH值的升高持续下降,这一现象可能与不同氧化途径的阶段性作用及蛋白质构象的阶段性变化有关。在pH 5.5时,氨基酸侧链可能被包裹,羰基生成受限,因此羰基含量较低。pH值远离等电点时,分子内静电斥力增强,MP构象展开,使巯基进一步暴露,加速其氧化,巯基持续下降,同时氨基酸侧链(如赖氨酸)更易被氧化,导致羰基在pH 6.0时达到峰值,此时MP构象展开程度较高,既促进了巯基的持续氧化,又为氨基酸侧链氧化提供了最佳条件。在蛋白质氧化进程中,羰基会与蛋白质分子中的氨基(比如赖氨酸残基上的ε-氨基)发生席夫碱反应,促使蛋白质分子间形成共价交联。在此过程中,羰基的生成与消耗并存[21],这解释了羰基含量在pH 6.5～7.5时的波动。
MFI是衡量肌原纤维及其骨架蛋白降解程度的关键指标,MFI值越高,表明肌原纤维断裂和骨架蛋白(如Z线蛋白、肌联蛋白等)的降解程度越高,肌原纤维结构的完整性越差。如图2-c所示,MFI的低值出现在pH 6.5(5.65±0.09)和pH 7.0(5.68±0.13),说明MP在pH 6.5和pH 7.0时降解程度最低。这可能是因为组织蛋白酶B、L在MP的降解中发挥着关键作用[34],且组织蛋白酶B、L是一种酸性蛋白,其最适pH值为4.5～5.5,在酸性条件下发挥最大活力,在pH值达到中性时,其活性显著下降,减少了肌原纤维的降解途径,导致MFI较低[35],这也解释了大多数文献中测定MFI的缓冲液pH值为中性的原因。MFI在pH 7.5时较高可能是因为MP发生轻微变性。
EAI反映了MP在油水界面的吸附能力,即蛋白质分子在油水界面上形成稳定乳液的能力,EAI值越高,表示蛋白质在油水界面的吸附能力越强,乳化性能越好。ESI反映了MP在乳化体系中的稳定性,即乳液在形成后抵抗分离的能力,ESI值越高,表示乳液的稳定性越好。不同pH值对MP乳化特性的影响如图2-d所示,MP的EAI在pH 5.5时最大,达到(11.83±0.23) m2/g,在pH 6.0时最低,为(7.73±0.21) m2/g,在pH 6.5～7.5没有显著差异(P>0.05);ESI在pH 6.5时最高[(81.41±0.59)%],在pH 5.5时最低[(72.54±0.41)%],但ESI在pH 6.0、pH 7.0、pH 7.5之间都没有显著差异性(P>0.05),与董唯等[36]对鸡胸肉MP的研究结果类似。pH 5.5接近等电点,MP带少量电,疏水基团暴露在外,促进其在油水界面的吸附,增加了MP的吸油能力,有利于体系乳化,且分子间的静电排斥力最小,蛋白质容易聚集在油水界面,从而表现出较高的EAI,远离等电点的pH值条件下,MP可能保持较为紧密的构象,疏水区域暴露较少,EAI降低。pH 6.5时,MP带有适度的净负电荷,静电排斥力有助于稳定乳液,防止液滴聚集,因此ESI较高。
Zeta电位是分散体系中颗粒表面与周围溶液之间的电动电位差,反映蛋白质分子在溶液中的表面电荷特性。Zeta电位绝对值越高,蛋白质分子表面电荷密度越大,分子间静电斥力越强,溶解性和分散稳定性越好。粒径指蛋白质分子或聚集体的流体力学直径,粒径小表明蛋白质处于天然折叠状态或轻度展开,分散均匀;粒径大可能提示蛋白质发生聚集或变性。如图2-e所示,zeta电位绝对值在pH 6.5[(11.34±0.32) mV]时达到最大,在pH 5.5[(4.26±0.95) mV]时达到最低,在pH 6.0[(7.16±0.34) mV],pH 7.0[(7.31±0.22) mV],pH 7.5[(7.35±0.16) mV]之间没有显著差异性(P>0.05)。平均粒径在pH 5.5时最大,为(3.21±0.18) μm,在pH 7.5时最小,为(2.05±0.18) μm,但在pH 6.5、7.0、7.5没有显著差异性(P>0.05)。MP的pH值接近等电点时,分子间静电斥力最弱,疏水相互作用增强,导致蛋白质聚集形成大颗粒,粒径显著增大。当pH值远离等电点,蛋白质表面带负电荷,静电斥力再次增强,溶解度提高,粒径减小。本实验中,MP的zeta电位绝对值最高值出现在pH 6.5时,这可能是因为MP是多种蛋白质的复合体(如肌球蛋白、肌动蛋白、原肌球蛋白等),不同组分的等电点存在差异,不同组分的电荷差异可能通过静电相互作用形成局部电荷极化,导致整体zeta电位绝对值升高,也有可能是pH值在远离等电点但未引起过度构象破坏时,pH值驱动的电荷积累与离子强度调控的电荷屏蔽之间达到动态平衡,类似地,WANG等[37]也发现在一定离子强度下,MP的zeta电位绝对值会出现一个峰值。粒径分布如图2-f所示,pH 5.5时,粒径分布最为集中,pH值越高,其粒径分布左移越大,且粒径分布越广。
2.2 SDS-PAGE
利用SDS-PAGE对骆驼肉MP进行分析,结果如图3所示。MP的分子质量分布广,主要分布在11～245 kDa,含有肌球蛋白重链、肌动蛋白、原肌球蛋白、肌钙蛋白和肌球蛋白轻链。
图3 不同pH值对MP SDS-PAGE的影响
Fig.3 Effect of different pH values on MP SDS-PAGE
条带肌球蛋白轻链1在pH 6.0和pH 6.5时最为清晰,在pH 7.0和pH 7.5时较淡,在pH 5.5时消失。小分子条带在pH 5.5和pH 7.5存在一定的托尾现象,这可能是因为pH 5.5处在等电点附近,蛋白质三级结构展开,表面疏水性增强,分子间疏水作用导致聚集,可能使SDS无法充分结合,影响电泳迁移率,在pH 7.5处,高pH值可能增强SDS结合效率,导致迁移率略快于中性pH值条件,从而导致条带较淡。肌球蛋白重链等大分子条带在pH 5.5时相较于其他pH值条件颜色更深,也证明了pH 5.5条件下大分子聚集。
2.3 凝胶色泽和白度
凝胶的色泽和白度直接影响肉制品的视觉吸引力。如表1所示,随着pH值的升高,L*值(亮度)显著增加,从pH 5.5时的71.84±2.37上升到pH 7.5时的77.79±1.19(P<0.05),这表明在较高pH值下,MP凝胶的亮度较强。a*值(红度)和b*值(黄度)随着pH值的升高显著降低(P<0.05)。a*值在pH 5.5～7.5内从-2.05±0.03显著下降到-2.76±0.05(P<0.05),而b*值则从-3.6±0.16下降到-5.12±0.67(P<0.05),白度是L*、a*和b*综合影响的结果,在pH 5.5～7.5,随pH值上升而上升,这与屈莎等[38]对牦牛MP凝胶的研究结果相同。pH对MP的影响也可能通过改变蛋白质的结构和化学性质来影响凝胶的色泽,在较高pH值条件下,MP展开并形成更开放的网络结构,这种结构变化可能会使凝胶更加透明,从而提升亮度和白度[39]。
表1 不同pH值对MP凝胶色泽和白度的影响
Table 1 Effect of different pH values on the color and whiteness of MP gel
pHL∗a∗b∗白度5.571.84±2.37a-2.05±0.03a-3.60±0.16a71.83±2.37b6.072.26±1.63ab-2.14±0.07ab-3.76±0.46a72.24±1.62b6.574.15±1.05ab-2.38±0.12bc-4.27±0.27ab74.12±1.05ab7.075.99±1.14b-2.58±0.18cd-4.83±0.12ab75.96±1.14ab7.577.79±1.19b-2.76±0.05d-5.12±0.67b77.73±1.19a
注：同列不同字母表示不同pH值之间存在显著性差异(P<0.05)。
2.4 凝胶保水性
如图4所示,pH 5.5的凝胶含水量为(87.79±0.14)%,显著低于其他组(P<0.05),而在pH 6.0～7.5凝胶含水量没有显著差异性(P>0.05),为89.35%～89.47%。
图4 不同pH值对MP凝胶水分含量和保水性的影响
Fig.4 Effect of different pH values on the moisture content and water retention of MP gel
凝胶保水性直接决定了肉制品的持水能力。如图4所示,凝胶保水性在pH 6.5达到最大值,为(83.22±1.55)%,这可能是因为此时zeta电位的绝对值达到最大,抑制了蛋白质的聚集,促进了凝胶网络的扩展,形成了致密且具有延展性的凝胶网络结构。保水性在pH 5.5和pH 6.0时达到最低,分别为(63.55±1.41)%和(65.62±1.07)%。当pH值为5.5时,由于蛋白处于等电点附近,MP表面电荷减少,导致大量蛋白聚集靠拢,氧化反应促使蛋白质分子提前形成非特异性交联,导致所形成的凝胶网络呈现无序排列特征,具体表现为凝胶表面粗糙、孔隙异质性显著。同时,蛋白之间的次级相互作用(如氢键等)强度也减弱,致使凝胶三维网络结构稳定性下降,最终表现为凝胶持水能力降低和致密性下降(图5)。
图5 不同pH值对MP凝胶微观结构的影响
Fig.5 Effect of different pH values on the microstructure of MP gel
2.5 凝胶微观结构
凝胶的三维网络结构是影响其特性的重要因素,其稳定性是多种化学作用力协同的结果,如疏水相互作用、氢键、二硫键、离子键等。如图5所示,在pH 5.5时,MP凝胶孔隙较大且分布不均匀,存在明显的团块状结构,随着pH值的升高,凝胶结构逐渐变得有序。pH 6.5时的凝胶结构最为顺滑,孔隙较小,此时凝胶网络可能兼具适度的致密性和延展性,形成一种既能束缚自由水又能抵抗离心力破坏的稳定结构。
MP凝胶微观结构的形成取决于蛋白质聚集和展开的相对速度。聚集速度慢,有利于蛋白分子充分变性展开,形成高伸展性的直链分子,再缓慢缔合成线状聚集体,形成的凝胶微观结构均匀有序。如果球状蛋白质聚集速度很快,大于蛋白质展开速度,如氧化后的蛋白在还未充分变性展开前就已经在分子之间发生了交联聚集,缔合成球状聚集体,这样形成的凝胶结构粗糙无序[40]。
2.6 相关性分析
骆驼肉MP及其凝胶在不同pH值体系下的功能特性的相关性分析如图6所示。多项指标之间存在显著相关性。溶解性和ESI存在显著正相关(P<0.05),与zeta电位呈显著负相关(P<0.05),这可能是因为MP溶解性增加时,蛋白质分子更充分的分散于水相中,促进其在乳化体系中均匀分散,为乳滴界面膜的稳定奠定了基础;zeta电位绝对值越高,MP分子间的静电斥力越强,抑制聚集并维持分散状态,从而提升溶解性。平均粒径和疏水性呈极显著正相关(P<0.01),疏水性增加意味着MP分子间的疏水相互作用增强,导致MP聚集,形成较大的颗粒,平均粒径上升。MFI和凝胶保水性呈极显著负相关(P<0.01),MFI值较高表明MP解离程度较高,结构受损严重,可能导致蛋白质分子之间的相互作用减弱,形成的凝胶网络结构不够稳定和致密,从而影响其持水性。
图6 不同pH值体系下的骆驼肉MP及其凝胶功能特征相关性
Fig.6 Correlation between MP and gel functional characteristics of camel meat under different pH conditions
注:*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001。
3 结论
不同pH值对骆驼肉MP及其热诱导凝胶功能特性有显著影响。骆驼肉MP的溶解性在pH 6.5时达到最大值,在pH 5.5时最低。疏水性随着pH值的升高逐渐降低,这表明在pH 6.5时,MP的溶解性最佳,而在pH 5.5时,MP的疏水性最强。总巯基和活性巯基含量均随着pH值的升高呈下降趋势。在pH 5.5时,MP的乳化活力最强,而在pH 6.5～7.5时,乳液的稳定性较佳。MP的zeta电位绝对值在pH 6.5时达到最大,MP分子间的静电斥力最强,且溶解性和分散稳定性最佳。粒径在pH 5.5时最大,MP分子聚集程度最高。不同pH值下,MP的蛋白条带清晰度和分子质量分布存在差异,在pH 6.0和6.5时效果较好。凝胶的亮度(L*)和白度随着pH值的升高而增加,而红度(a*)和黄度(b*)则随着pH值的升高而降低。这表明在较高pH值下,凝胶的色泽更为明亮和白皙。凝胶的保水性在pH 6.5时最高,凝胶网络结构最为致密且均匀,能够有效保持水分。这些研究结果为研究骆驼肉MP提供了参考数据,为开发骆驼肉提供了理论参考。
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