咖啡酸又称3,4-二羟基肉桂酸,是一种酚酸类化合物,广泛存在于植物中,具有抗氧化、抗炎等多种生理活性[1-3]。同时,咖啡酸是绿原酸、迷迭香酸、咖啡酸苯乙酯等高附加值化合物的合成前体[4-5],在食品、药品和化妆品等领域应用广泛[6-7]。利用重组微生物合成咖啡酸的生产方式因其过程温和、不使用有机试剂等优势备受关注。咖啡酸的从头合成以葡萄糖或甘油为底物,经糖酵解、磷酸戊糖、莽草酸等途径转化生成酪氨酸,在酪氨酸解氨酶(tyrosineammonia-lyase,TAL)催化作用下生成对香豆酸,再由羟基化酶催化转化为咖啡酸[8-9](图1)。常用的羟基化酶为植物来源的香豆酸-4-羟基化酶C3H以及光合细菌来源的CYP1992A2,其均为细胞色素P450羟化酶,需共表达细胞色素P450还原酶以实现电子传递循环[10]。这类酶在工业微生物中的表达效率及活性较低,需配合酶改造等手段以促进产物高产。研究人员发现,大肠杆菌等细菌含有多种非P450型羟化酶复合物如4-羟基苯乙酸3-羟化酶(HpaBC),此类羟化酶的表达量和活性高,可催化对香豆酸转化为咖啡酸,这为咖啡酸的微生物合成提供了重要支撑[9]。
图1 合成咖啡酸重组大肠杆菌的代谢途径设计
Fig.1 Metabolic pathway of caffeic acid biosynthesis in E.coli used in this study
注:×表示相关基因的敲除,→表示强化代谢流和代谢通量。E4P,赤藓糖-4-磷酸;PEP,磷酸烯醇式丙酮酸;DAHP,3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸;3-DHQ,3-脱氢奎尼酸;3-DHS,3-脱氢莽草酸;SA,莽草酸;SHP,莽草酸-3-磷酸;EPSP,5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸;CHA,分支酸;PPA,预苯酸;L-Phe,L-苯丙氨酸;4HPP,4-羟基苯丙酮酸;TyrR,芳香族氨基酸合成及转运基因阻遏蛋白;TAL,酪氨酸解氨酶;EcHpaB,大肠杆菌来源的4-羟基苯乙酸-3-羟基化酶;SeC3H,西班牙糖丝菌来源的4-香豆酸-3-羟基化酶;EcHpaC,大肠杆菌来源的黄素依赖 性还原酶。
咖啡酸的微生物合成主要以大肠杆菌或酿酒酵母作为宿主[8, 10-12],其中,大肠杆菌的酪氨酸代谢途径通量较强,可为咖啡酸合成提供充足的酪氨酸前体物,是具有应用潜力的底盘菌株[10],因此使用更为普遍,且咖啡酸产量更高。一项研究在大肠杆菌中构建了对香豆酸到咖啡酸的合成途径,通过外源添加对香豆酸,利用静息细胞催化,可合成10.2 g/L咖啡酸[13]。另一研究以酪氨酸为前体物,通过生物转化合成了280 mg/L咖啡酸[14]。为减少前体物的外源添加、降低生产成本,研究人员开发了从头合成咖啡酸的重组大肠杆菌体系,并通过系统优化实现高产。其中,WANG等[15]在大肠杆菌中以葡萄糖和甘油为碳源,采用约翰逊黄杆菌来源的酪氨酸解氨酶与内源性HpaBC,通过促进酪氨酸累积、改善辅因子供应、增加咖啡酸外排,在摇瓶中实现了776 mg/L咖啡酸的从头合成,在5 L发酵罐中补料分批发酵生成7.92 g/L产品。另一项研究通过同源酶筛选、酶定向进化改造、代谢途径优化获得重组菌株,在15 L发酵罐内进行补料分批发酵,可利用葡萄糖从头合成6.36 g/L咖啡酸[16]。
这些研究虽具有产量高的优势,但其咖啡酸合成途径均置于重组质粒上,菌株遗传稳定性较差,且在发酵过程中需外源添加抗生素,一方面增加生产成本,另一方面可引发抗生素抗性基因的扩散传播,存在潜在生物安全隐患[17]。相比之下,整合型菌株通过将目标基因整合到宿主细胞的染色体上,可在不使用抗生素的前提下,保证目标产物合成的持续性和稳定性,促进绿色生产。目前,利用整合型菌株合成咖啡酸的研究仅限于酿酒酵母[4, 18-19],在大肠杆菌中尚未报道。本研究将咖啡酸合成途径整合至大肠杆菌基因组,以葡萄糖为底物,构建从头合成咖啡酸的整合型大肠杆菌工程菌株,建立咖啡酸在大肠杆菌中的无抗发酵生产工艺,以期为咖啡酸及其衍生天然产物的高效微生物合成体系设计构建提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要培养基及试剂
AMM(Andrew’s magic medium)[20]:KH2PO4 3.5 g/L,K2HPO4 5 g/L,(NH4)2HPO4 3.5 g/L,3-吗啉丙磺酸8.372 g/L,三羟甲基甲基甘氨酸(Tricine)718 mg/L,蛋白胨2 g/L,甘油20 g/L,维生素B1(硫胺素) 50 μg/L,NH4Cl 510 mg/L,NaCl 2.92 g/L,K2SO4 48 mg/L,MgCl2 110 mg/L,MgSO4·7H2O 245 mg/L,CaCl2·2H2O 15 mg/L,FeSO4·7H2O 2 mg/L,(NH4)6Mo7O24·4H2O 3.6 μg/L,H3BO3 25 μg/L,CuSO4 2.4 μg/L,MnCl2 16 μg/L,ZnSO4 2.8 μg/L。
发酵培养基(fermentation medium,FM)[21]:葡萄糖 20 g/L,KH2PO4 9 g/L,(NH4)2HPO4 4 g/L,柠檬酸1.7 g/L,MgSO4·7H2O 0.6 g/L,酵母粉 5 g/L,EDTA 8.4 mg/L,MnCl2·4H2O 15 mg/L,CuSO4·5H2O 2.2 mg/L,H3BO3 3 mg/L,(CH3COO)2Zn 75 mg/L,FeSO4·7H2O 230 mg/L。
葡萄糖、CaCl2、MgSO4、NaOH,天津科密欧化学试剂有限公司;K2HPO4、Na2HPO4、NH4Cl、KH2PO4,国药集团试剂有限公司;无水乙醇,天津天力化学试剂有限公司;色谱级甲醇、色谱级乙腈,麦克林生化科技有限责任公司;咖啡酸标准品、酪氨酸标准品、对香豆酸标准品,上海源叶生物科技有限公司;IPTG,生工生物工程(上海)股份有限公司;LB肉汤、蛋白胨、酵母粉,北京奥博星生物技术责任有限公司;分子克隆酶制剂,纽英伦生物技术(北京)有限公司;质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒,天根生化科技(北京)有限公司。
1.1.2 主要仪器与设备
EClassical3200L高效液相色谱仪,依利特(大连)分析仪器有限公司;SPD-16检测器,岛津仪器(苏州)有限公司;Infinite M Nano酶标仪,瑞士帝肯(上海)贸易有限公司;T20型PCR仪,杭州朗基科学有限公司;JY04S-3C凝胶成像仪、JY600C蛋白质电泳仪,北京君意东方电泳有限公司;SCIENTZ-2C基因导入仪,宁波新芝生物科技有限公司;BIOTECH-5JG-7000发酵罐,上海保兴生物设备工程有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 质粒构建
携带咖啡酸合成途径基因的各重组质粒构建方法相同,现以pTargetF-sgRNA-HR-IS6-RgTAL-HpaBC的构建为例进行说明。按照文献方法[22]构建表达靶向IS6位点 sgRNA的工具质粒pTargetF-sgRNA-IS6。然后,使用引物IS6-UP-F/IS6-UP-R、IS6-Down-F/IS6-Down-R(表1),以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板,扩增靶向IS6位点的基因编辑同源臂上游与下游片段,再通过重叠延伸PCR连接成单片段后,通过酶切位点EcoR I与Xho I克隆到pTarget-sgRNA-IS6上,构建质粒 pTargetF-sgRNA-HR-IS6。按照质粒pZE-TH2[23]序列人工合成RgTAL和HpaBC表达框,使用启动子PLtetO-1控制RgTAL与HpaBC的表达,HpaBC采用操纵子形式的表达方式。合成的RgTAL-HpaBC片段通过酶切位点Sal I/Xba I插入到质粒pTargetF-sgRNA-HR-IS6中,形成最终的工具质粒,用以完成RgTAL-HpaBC到位点IS6的整合。
表1 本研究使用的引物
Table 1 List of primers used in this study
引物名称引物序列(5′→3′)IS6-UP-FTCGGTGCTTTTTTTGAATTCCTTACCTCTGAGCCGTCCTGATTIS6-UP-RGCCCCAGGCATGCGTCGACTCTGACAGGTACCCTGGCGATTTIS6-Down-FGTCGACGCATGCCTGGGGCTCTAGACTTTGGTCAGTAGGAGGCATTACAIS6-Down-RTGGAGCTGCACATGAACTCGAGTGGGACGCGGTTTGTACTTTAAIS7-UP-FTCGGTGCTTTTTTTGAATTCGAGGTGTTGCCGAGCGTTTATAAIS7-UP-RGCCCCAGGCATGCGTCGACATGTTCCTGATGATGACTAACGGCTIS7-Down-FGTCGACGCATGCCTGGGGCTCTAGATGCACAATAAAGCTGCTGGCAAACIS7-Down-RTGGAGCTGCACATGAACTCGAGTTTCTGCAGTTCTGTCTGTGGGybbD-UP-FTCGGTGCTTTTTTTGAATTCTATGATAAGGAGTCGGGGCTGTACTybbD -UP-RGCCCCAGGCATGCGTCGACGGGAGCCATGTAAAAACTCCATCAybbD -Down-FGTCGACGCATGCCTGGGGCTCTAGAGCAAGGGGATGGTGTAAACCTTTybbD -Down-RTGGAGCTGCACATGAACTCGAGCAGCAACGAGCTGCGTAAACAIS6-check-F1TGTCGCCATTTCGTTTGCGCIS6-check-R2CCGGAATTGCCGATGCAGATTybbD-check-F1CGCTGATGGATGCGGATGGAAAybbD-check-R2GGTGTGGATGCGCAGATTAATCGTAIS7-check-F1GAAGTGCGATCTCAACTCCATTCTGIS7-check-R2AGTCCGCGAAGTTGATAGAATCCSeC3H-check-R1CAGACACTGCAAGCGTACCAGRgTAL-check-F2ACCGGCTCCAGGTTAAACAGTAL-HpaBC-F1TTAGCCTCTCATGCTGGCAAAATAL-HpaBC-R1GGCGAGGCGCCATATGTATATCT
1.2.2 整合型重组菌株构建
利用CRISPR/Cas9技术构建咖啡酸合成途径关键基因的基因组整合菌株。将含有目的基因及同源臂的重组质粒pTargetF-sgRNA-HR-IS6-RgTAL-HpaB/C或pTargetF-sgRNA-HR-X-RgTAL-SeC3H-HpaC(其中X代表IS6、ybbD或IS7整合位点)导入表达Cas9系统的rpoA14(DE3)宿主菌株[24],通过CRISPR/Cas9介导的同源重组,将目的基因整合到染色体的目标位点。为验证整合是否成功,提取菌株的基因组DNA,使用引物X-check-F1与TAL-HpaBC-R1、TAL-HpaBC-F1与X-check-R2对RgTAL-HpaB/C片段进行PCR扩增,使用引物X-check-F1与SeC3H-check-R1、RgTAL-check-F2与X-check-R2对RgTAL-SeC3H-HpaC片段进行PCR扩增,并对扩增产物进行DNA测序,测序正确的菌株按照文献的方法[22]丢失pCas和pTargetF-sgRNA-HR-X-RgTAL-SeC3H-HpaC质粒,获得整合型重组菌株。引物序列如表1所示。
1.2.3 咖啡酸在摇瓶中的合成
挑取甘油菌于LB平板上划线培养,之后挑取单菌落接种于LB培养基,在37 ℃过夜培养。将种子菌以2%(体积分数,下同)的比例转接至50 mL新鲜AMM于37 ℃、220 r/min培养12 h,加入终浓度为0.1 mmol/L 的IPTG进行诱导,之后在30 ℃、220 r/min培养,每隔12 h采集发酵液样品1 mL,并向发酵体系补充50%甘油500 μL作为碳源。样品经12 000 r/min离心10 min,收集上清液,加入等体积甲醇混匀,于-20 ℃保存待检。
1.2.4 咖啡酸合成的发酵条件优化
为优化发酵条件,选取不同培养基成分、不同接种量、不同诱导剂浓度进行单因素试验。培养基优化中,将过夜菌液以2%的接种量转接至50 mL新鲜AMM或FM中,发酵12 h时加入终浓度为0.1 mmol/L 的IPTG进行诱导。接种量优化中,将过夜菌液分别以2%、4%、6%、8%、10%的接种量转接至50 mL新鲜FM中, 发酵12 h时加入终浓度为0.1 mmol/L 的IPTG进行诱导。诱导剂浓度优化中,将过夜菌液以2%的接种量转接至50 mL新鲜FM中,在发酵12 h时,使用终浓度0.1、0.2、0.5、1.0、1.5 mmol/L的IPTG进行诱导。其余步骤均与1.2.3节相同。
1.2.5 咖啡酸在发酵罐中的生产
参照1.2.3节的方法,将菌体在LB中过夜培养后,以2%接种量转接至2.5 L新鲜FM中,于5 L发酵罐中培养。发酵初始条件为pH 7.0,温度 37 ℃,通气量2 L/min,溶氧量30%;发酵过程中,pH维持在6.8。发酵12 h时,加入IPTG至终浓度0.1 mmol/L,同时降温至30 ℃并启动补料程序,补料成分包括葡萄糖 600 g/L、酵母粉50 g/L、MgSO4·7H2O 1.98 g/L、EDTA 0.84 g/L、MnCl2·4H2O 1.5 g/L、CuSO4·5H2O 0.22 g/L、H3BO3 0.3 g/L、(CH3COO)2Zn 7.5 g/L、FeSO4·7H2O 23 g/L,补料流速依据葡萄糖实时消耗速率调整,保证发酵罐内葡萄糖质量浓度低于2 g/L。定期收集发酵液样品,于12 000 r/min离心10 min,将上清液与甲醇以1∶4体积比稀释后,于-20 ℃保存待分析。
1.2.6 SDS-PAGE检测
在发酵过程不同时间点各收取100 μL菌液,经12 000 r/min离心2 min后弃去上清液,使用PBS重悬菌体至相同OD600。将4×Laemmli Sample Buffer与β-巯基乙醇按体积比9∶1混合后,与菌悬液以1∶3的体积比例混匀,95 ℃加热10 min,冷却至室温后,使用10%的SDS-PAGE 凝胶在140 V电压下进行电泳。电泳结束后,使用超纯水洗涤凝胶,使用考马斯亮蓝染色液(10%冰乙酸,45%甲醇,2.5 g/L考马斯亮蓝G-250)于室温染色,使用脱色液(5%无水乙醇,10%冰乙酸)进行脱色。
1.2.7 细胞生长的检测
在发酵不同阶段收取菌液,使用新鲜培养基进行梯度稀释后,利用酶标仪在波长600 nm处测定吸光度数值(OD600),用于反映大肠杆菌的生长状况。
1.2.8 代谢产物的检测方法
高效液相色谱采用C18色谱柱(5 μm,4.6 mm×250 mm)及紫外检测器在320 nm检测咖啡酸、对香豆酸浓度,280 nm检测酪氨酸浓度,柱温为室温条件,样品进样量10 μL,流速1 mL/min。咖啡酸及对香豆酸分析使用的流动相A相为乙腈+0.1%甲酸,B相为水+0.1%甲酸,梯度洗脱程序为0～10 min,10%～40% A;10～15 min,40%～60% A;15～20 min,60%～90% A;20～25 min,90%～10% A;25～35 min,10% A。酪氨酸分析使用的流动相A相为乙腈+0.1%三氟乙酸,B相为水+0.1%三氟乙酸,梯度洗脱程序为0～8 min,5%～80% A;8～10 min,80%～20% A;10～15 min,5% A。各物质标准品与实验样品在相同条件下进行测定并制作标准曲线,对样品中相应物质含量进行定量分析。
2 结果与分析
2.1 整合型咖啡酸合成菌株的设计构建与验证
大肠杆菌rpoA14(DE3)为L-酪氨酸高产菌株,可为咖啡酸生物合成提供充足前体。为转化酪氨酸,首先选用活性较高且广泛使用的粘红酵母(Rhodotorula glutinis)来源酪氨酸解氨酶(RgTAL),催化其生成对香豆酸[25]。对香豆酸向咖啡酸的转化为羟基化过程,是整个反应途径的限制性步骤[9,26]。由于不同种类羟基化酶对该反应的催化效率不同,本研究选取了2种酶进行比较。第1种是大肠杆菌来源的4-羟基苯乙酸-3-羟基化酶(EcHpaBC),其为细菌双组份黄素依赖性单加氧酶,包括加氧酶组分(EcHpaB)和还原酶组分(EcHpaC);第2种为西班牙糖丝菌(Saccharothrix espanaensis)来源的4-香豆酸3-羟基化酶(SeC3H),其活性发挥需要黄素依赖性还原酶HpaC的辅助[27],因此同时选取大肠杆菌来源的HpaC(EcHpaC)予以配合。最终,本研究构建了共表达RgTAL和羟基化酶的代谢途径,并将其编码基因整合到基因组的IS6这一常用位点[28],表达EcHpaBC和SeC3H-EcHpaC的菌株分别命名为CA1、CA2。
摇瓶发酵测试表明,CA1菌株生长略快,在发酵结束时(96 h),其菌体浓度比CA2菌株高16%(图2)。然而,CA2菌株在整个发酵过程中均具有较强的咖啡酸合成能力(图3)。尽管这2种菌株的菌浓在72～84 h时达到最高,但咖啡酸持续合成,在发酵96 h达到最大积累量。在该时间点,CA2菌株的咖啡酸产量约为199 mg/L,比CA1菌株高3.1倍,中间产物对香豆酸、酪氨酸的积累量分别比CA1菌株低34%、8%(图3),表明SeC3H-EcHpaC羟基化酶体系对于咖啡酸合成更为有利。因此,后续研究选择SeC3H-EcHpaC代谢途径进行优化。
图2 CA1、CA2菌株在AMM中的生长状况
Fig.2 Growth curves of CA1 and CA2 in AMM
图3 不同菌株在AMM中咖啡酸产量以及对香豆酸、酪氨酸积累量随时间的变化
Fig.3 Time-dependent change of caffeic acid production,p-coumaric acid accumulation, and tyrosine accumulation in different strains in AMM
2.2 咖啡酸合成途径基因的表达优化
整合型菌株中,目标基因的表达水平与基因整合位点密切相关。BASSALO等[28]在大肠杆菌 IS7等7个位点整合GFP标签,效率达100%;ENGLAENDER等[29]则证实ybbD等位点可整合mCherry标签,且不同位点基因表达水平差异明显。为此,本研究在大肠杆菌rpoA14(DE3)基因组上另外选取了IS7、ybbD两个位点,对RgTAL-SeC3H-EcHpaC途径进行单位点整合,分别构建了CA3、CA4菌株,并与CA2菌株进行对比。现有报道表明,大肠杆菌基因组的IS6、IS7为插入序列,ybbD为非必需基因,这些均为中性位点,不参与细胞核心生理过程,在这些位点整合外源基因后通常不影响宿主菌体生长[28-29]。与文献报道一致,本研究中3株基因单拷贝菌株在诱导前后均表现出高度相似的生长特性(图4)。在摇瓶发酵中,菌株CA2与CA3咖啡酸产量接近,并且在发酵终点时达到最高(199 mg/L),比CA4菌株高33%(图5、图6);CA2及CA3菌株中对香豆酸的积累量均高于CA4菌株,可能原因是对香豆酸向咖啡酸的快速转化拉动了上游过程中对香豆酸的合成,由于对香豆酸的消耗是限速步骤,故导致其合成快于消耗,积累量升高。然而,3株菌中酪氨酸积累量与咖啡酸产量之间并无明显关联趋势,提示咖啡酸合成途径基因的表达在不同整合位点间可能存在差异。
图4 不同咖啡酸合成基因拷贝数的菌株在AMM中的生长曲线
Fig.4 Cell growth of strains varying in caffeic acid biosynthetic gene copy number in AMM medium
图5 不同菌株在AMM中咖啡酸产量随时间的变化
Fig.5 Time-dependent production of caffeic acid by various strains in AMM
图6 各整合型菌株在AMM中96 h咖啡酸产量、对香豆酸及酪氨酸积累量
Fig.6 Concentrations of caffeic acid, p-coumaric acid, and tyrosine after 96 h of fermentation in AMM
目标产物合成途径的基因表达量与基因拷贝数直接相关,基因组多拷贝整合的代谢工程策略可增强功能酶的基因剂量,从而促进产物合成[30]。本研究中,各整合型重组菌株的合成途径基因均为单拷贝,为进一步考察基因拷贝数对咖啡酸产量的影响,本研究在不同整合位点同时整合咖啡酸合成途径基因,分别构建了双拷贝型菌株CA5(IS6、ybbD双位点整合)、CA6(IS6、IS7双位点整合)、CA7(IS7、ybbD双位点整合)以及三拷贝型菌株CA8(IS6、IS7、ybbD三位点整合)。SDS-PAGE分析显示,对于诱导后的细胞样品,相比于单拷贝菌株中RgTAL条带几乎不可见的情况,双拷贝及三拷贝菌株中该条带清晰存在(图7),表明基因拷贝数增加确实可提升RgTAL的表达量。
M-Marker;Ctrl-纯化后的RgTAL;12、24、48、72分别为培养12 h(诱导前)、24 h、48 h、72 h的细胞样品。
图7 各菌株RgTAL表达量的SDS-PAGE分析
Fig.7 SDS-PAGE analysis of RgTAL expression in various strains over time
生长测试表明,诱导前,所有菌株生长速度相近;诱导后菌株生长出现分化,菌液浊度与基因拷贝数呈负相关(图4),提示咖啡酸合成途径多拷贝基因表达加重代谢负担。随着发酵的进行,各菌株咖啡酸产量逐渐积累(图5)。相比于单拷贝菌株,双拷贝菌株的咖啡酸产量升高,对香豆酸积累量增加,酪氨酸积累量减少,表明随基因拷贝增加,相应酶促反应步骤加强,使得酪氨酸向对香豆酸的转化、对香豆酸向咖啡酸的转化过程增强,这与SDS-PAGE结果一致。
各双拷贝菌株中,酪氨酸积累量仅有轻微差异,咖啡酸合成能力为CA5>CA6>CA7,对香豆酸积累量的变化趋势与此相反;其中CA5菌株的咖啡酸产量比CA7菌株高39%、对香豆酸积累量比CA7菌株低28%(图6),再次表明不同整合位点组合对途径基因表达效果具有较大影响。
当合成途径基因拷贝数增加至三拷贝时,咖啡酸产量进一步提高,CA8菌株的最高产量达到488 mg/L,比单拷贝菌株高145%～224%,比双拷贝菌株高56%～117%。该菌株酪氨酸积累量低于其他菌株,而其对香豆酸积累量介于单拷贝与双拷贝菌株之间。一方面,由于基因表达量增加,对香豆酸向咖啡酸转化这一限速步骤得到进一步加强,促进了对香豆酸的消耗;另一方面,RgTAL表达量增加,促进酪氨酸向对香豆酸转化,而对香豆酸大量积累可抑制RgTAL活性[25],从而减缓对香豆酸合成。这2个过程的共同作用使得对香豆酸浓度在双拷贝菌株的基础上有所下降。
为进一步明确各菌株中咖啡酸产量、对香豆酸积累量和酪氨酸积累量之间的关联关系,本研究对各物质在发酵终点的浓度、物质的量比例及3种物质的总浓度进行了分析,结果如表2所示。在双拷贝菌株中,酪氨酸与咖啡酸的比例越高,咖啡酸产量越低;同样,对比单拷贝、双拷贝及三拷贝菌株,随着拷贝数增加,酪氨酸占比逐渐下降,咖啡酸产量提升。这表明,酪氨酸积累量与咖啡酸产量反向相关。同样,对香豆酸浓度与咖啡酸浓度比值越高,则咖啡酸产量越低。因此,提高咖啡酸产量的关键是减少酪氨酸和对香豆酸的积累,促进其转化。此外,不同菌株中3种物质的总浓度并不一致,再次证明基因表达量在不同整合位点间存在差异。其中,使用IS6位点的菌株CA2、CA5和CA6中,3种物质总浓度高于其他菌株,证明其具有较高的物质合成潜力。
表2 不同菌株中咖啡酸、对香豆酸以及酪氨酸的浓度及比例
Table 2 Concentrations and ratios of caffeic acid,p-coumaric acid and tyrosine in various strains
菌株CA浓度/(mmol/L)p-CA浓度/(mmol/L)Tyr浓度/(mmol/L)CA∶p-CA∶Tyr总浓度/(mmol/L)CA21.1±0.02.1±0.015.7±0.61∶2∶1418.9±0.7CA31.1±0.12.3±0.112.6±1.01∶2∶1115.9±1.1CA40.8±0.01.6±0.114.2±0.41∶2∶1716.6±0.5CA51.7±0.02.5±0.113.4±0.21∶1∶817.6±0.4CA61.5±0.02.9±0.012.6±0.31∶2∶917.0±0.3CA71.3±0.03.2±0.112.5±0.11∶3∶1016.9±0.2CA82.7±0.02.5±0.111.4±0.51∶1∶416.6±0.6
注：CA-咖啡酸;p-CA-对香豆酸;Tyr-酪氨酸。
2.3 咖啡酸合成的发酵条件优化
培养基组成对菌体生长代谢、目标产物合成效率具有关键影响。由于CA8菌株在AMM培养基中的菌体浓度较低,可能影响产物合成,因此,本研究选取大肠杆菌发酵工业常用的培养基FM,与培养基AMM进行摇瓶水平的发酵性能比较,结果如图8、图9所示。CA8菌株在FM中的OD600值最高可达6.0,为AMM中最大OD值的2.1倍,呈现出更高的生长速率与细胞密度。碳源消耗趋势与菌体生长呈现良好的一致性,FM中初始浓度为10 g/L的碳源(葡萄糖)在培养9 h时已完全耗尽。发酵96 h时,菌体在FM中的咖啡酸含量达到峰值,为598 mg/L,与AMM培养条件相比,咖啡酸产量、酪氨酸积累量、对香豆酸积累量分别提高22%、159%、79%。与AMM相比,FM含有速效碳源、更丰富的氮源、较高浓度的Mg2+及Fe2+,可有效促进大肠杆菌生长,进而加速产物合成。
图8 不同培养基对CA8菌株生长及碳源消耗的影响
Fig.8 Effect of media on cell growth and the utilization of carbon source of strain CA8
注:实线代表OD600值变化,虚线代表碳源消耗情况。
图9 培养基种类对CA8菌株咖啡酸产量及中间产物积累量的影响
Fig.9 Effect of media on the production of caffeic acid and the accumulation of intermediate metabolites
接种量作为发酵工艺的关键参数,直接调控菌体生长动力学特征、代谢流分配模式及目标产物合成效率[20]。为此,本研究在FM中对CA8菌株开展不同接种量的摇瓶发酵研究。随着接种量从2%增至10%,咖啡酸产量从598 mg/L逐渐降至447 mg/L(降低25%),酪氨酸积累量从5.33 g/L增至9.25 g/L(增加74%),而对香豆酸积累量仅增加了6%(图10)。该结果表明,较高接种量极大促进了酪氨酸的合成,但其向目标产物的转化效率并没有相同水平的提升。此外,高浓度酪氨酸可抑制RgTAL活性[25],反而不利于咖啡酸合成。
图10 菌株CA8接种量对咖啡酸产量及中间产物积累量的影响
Fig.10 Effect of inoculum size on the production of caffeic acid and the accumulation of intermediate metabolites
诱导剂浓度是影响产物合成途径基因表达量的关键因素,进而直接关联目标产物的合成效率。本研究对诱导剂IPTG浓度开展了优化,结果显示,随诱导剂浓度升高,咖啡酸产量及对香豆酸积累量呈下降趋势,酪氨酸积累量略有上升(图11)。高浓度诱导剂虽可增强咖啡酸合成途径基因的表达,同时亦增加了菌体代谢负担;此外,途径酶的大量表达可能导致酶折叠错误,影响活性;再者,由于合成途径中各个酶的活性及动力学特性不同,导致各反应步骤的进行程度不均衡、不匹配,酶表达量的提升可加剧这种不平衡。通过优化,最终确定CA8菌株摇瓶发酵的最佳条件为过夜菌液以2%的比例转接至新鲜FM中,诱导剂浓度为0.1 mmol/L。
图11 诱导剂浓度对菌株CA8咖啡酸产量及中间产物积累量的影响
Fig.11 Effect of inducer concentration on the production of caffeic acid and the accumulation of intermediate metabolites
2.4 菌株CA8在5 L发酵罐中的性能测试
为进一步验证菌株CA8的咖啡酸合成能力,在5 L发酵罐中使用FM对其进行补料分批发酵(图12)。发酵初始12 h内,葡萄糖快速消耗,伴随菌体浓度快速增加;发酵12 h时,葡萄糖质量浓度降至2 g/L以下,此时开始补料,同时以IPTG诱导咖啡酸合成途径基因表达。此后,菌体浓度持续上升,于72 h达到最大(OD600=26.1);咖啡酸产量开始逐渐增加,于发酵84 h时达到峰值(1.55 g/L),与菌体生长呈现部分偶联。对中间产物的浓度检测发现,酪氨酸积累量在发酵12 h时达到1.39 g/L,此后基本保持稳定;对香豆酸浓度在发酵48 h时基本稳定,达到1.85 g/L。这一现象表明,酪氨酸的合成和转化基本平衡,而对香豆酸在发酵前期的合成速率大于其转化速率,进一步证明对香豆酸向咖啡酸转化这一限速步骤的存在。在发酵84 h后,菌体浓度下降,菌体活力不足,咖啡酸产量维持稳定。
图12 菌株CA8在5 L发酵罐中的生长状况、底物利用及代谢产物合成情况
Fig.12 Cell growth, carbon source utilization, and metabolite production of strain CA8 in a 5 L bioreactor
3 结论与讨论
本研究将酪氨酸至咖啡酸的合成途径整合至高产酪氨酸的重组大肠杆菌基因组中,构建了从头合成咖啡酸的整合型重组菌株。通过比较不同来源的途径基因、优化基因整合位点及基因拷贝数,获得了一株表达RgTAL-SeC3H-EcHpaC的三拷贝重组菌株CA8。通过后续培养基优化、接种量优化以及诱导剂浓度优化,菌株在摇瓶中咖啡酸产量可达598 mg/L,在5 L发酵罐中产量约为1.55 g/L。本研究表明4-羟基苯乙酸-3-羟基化酶的筛选与表达优化对于咖啡酸产量提升具有关键作用,这为咖啡酸生物合成菌种开发提供了重要参考。相较于已报道的咖啡酸生产菌株,本研究构建的CA8菌株具有一定优势,其基于高产酪氨酸底盘菌构建,且基因组整合型表达无需质粒维持,避免了前体供应及抗生素使用的相关问题。然而,该菌株的产量与现有质粒型菌株存在较大差距,且发酵过程中酪氨酸和对香豆酸大量积累,推测与整合型基因表达调控精度有限、未完全实现关键酶活性最优匹配相关。为此,后续研究可从多方面进行系统优化:1)整合型基因表达存在最佳拷贝数阈值,不同功能基因的最佳拷贝数具有特异性,且同一基因在不同整合位点的表达效率及最佳拷贝数亦存在差异,因此,可进一步优化RgTAL、SeC3H及EcHpaC编码基因的整合位点与拷贝数配比,配合启动子强度调控,精细调节关键酶的表达;2)对香豆酸向咖啡酸的转化为整个合成途径的限速步骤,此外,对香豆酸对RgTAL存在较强的抑制作用,高浓度酪氨酸亦可抑制该酶活性,因此,为减少对香豆酸及酪氨酸积累、保证咖啡酸高产,需强化SeC3H/EcHpaC的表达,强化关键辅因子FADH2的供给,同时平衡RgTAL和SeC3H/EcHpaC的表达比例,实现酪氨酸到对香豆酸、进而到咖啡酸的快速转化;3)对RgTAL、SeC3H、EcHpaC进行改造并筛选高活性突变体;4)利用菌种诱变、适应性实验室进化等手段,增强菌体对咖啡酸和对香豆酸的耐受性。这些优化策略有望助力咖啡酸生物合成工业菌种的开发。
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