牦牛素有“高原之舟”的美誉,在高寒牧区承载着无可替代的生态屏障功能,维系着独特的游牧文明,更孕育着极具特色的经济价值体系[1]。在肉品加工与运输的复杂工艺过程中,不可避免存在由活性氧和氧化应激引发的次级产物介导产生的蛋白质氧化作用[2]。该过程主要导致蛋白质断裂、蛋白质交联及侧链残基的修饰,进而引起肌肉品质的显著下降,导致严重的经济损失。
花旗松素(taxifolin, Tax)又称紫衫叶素或二氢槲皮素,属于多酚类化合物,无味,易溶于乙醇、乙酸、热水等溶剂,微溶于冷水[3]。Tax主要存在于长白落叶松、花旗松等松科植物当中,同时也可从水飞蓟、红蓼、光叶菝葜及洋葱等植物中提取。Tax已列入美国食品和药物管理局的批准清单,主要用作抗病毒或肝脏保护剂[4]。LIU等[5]发现Tax具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒以及抗炎抗过敏等作用。因此,可将其开发为食品添加剂、保健品和药品等相关产品,具有很大的研发价值。在食品工业中Tax可作为一种食品添加剂被应用于奶酪、奶粉、动物脂肪以及糕点中以延长保质期[6]。Tax与发酵剂混合可以稳定和减缓香肠脂肪分解的速度,可以减少组胺和腐胺的积累,并有效地抑制脂质过氧化过程[7]。GUSTZENE等[8]同样发现Tax能有效延缓冷熏猪肉香肠的脂肪氧化过程,并且对霉菌和酵母菌具有显著抑制作用。以上研究均表明Tax在抗氧化方向有很强的潜力,但Tax是否对延缓肉类加工系统中的蛋白质氧化有积极影响尚不清楚。因此,本文旨在探讨不同质量分数的Tax对牦牛肉肌原纤维蛋白(myofibrillar protein, MP)氧化的影响,通过测定蛋白质羰基、巯基、游离胺、内源荧光等变化,揭示Tax与MP相互作用的机制。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牦牛肉,阿坝永源牦牛肉责任有限公司,为3～4年健康牦牛背最长肌。
Tax、考马斯R-250,上海源叶生物科技有限公司;5,5′-二硫基-2,2-二硝基苯甲酸[5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB]、2,4-二硝基苯肼,上海麦克林生化科技有限公司;尿素、三羟甲基氨基甲烷、盐酸胍、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS),德国BioFroxx公司;其他所有化学品均为分析级化学品,成都科隆化学品有限公司。
1.2 仪器与设备
T-25 高速分散匀浆机,德国IKA公司;5804R高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司;ZETASIZER NANO ZS 激光粒度仪,英国Malvern公司;UV2120 紫外分光光度计,龙尼珂仪器有限公司;F-4700 荧光分光光度计,日本那珂事务所;LR 64912C 傅里叶变换红外光谱仪,美国PekinElmer公司。
1.3 实验方法
1.3.1 MP的提取
参考陈腊梅等[1]的方法,取去除脂肪与结缔组织后的牦牛肉糜加入4倍体积的20 mmol/L磷酸盐缓冲溶液[含2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L 乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸、0.1 mol/L NaCl,pH 7.0],洗涤3次。然后用20 mmol/L磷酸盐缓冲液(含0.1 mol/L NaCl,pH 6.25)洗涤2次。最后向沉淀加入20 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0),匀浆后使用4层纱布过滤,滤液离心后得到MP沉淀。
1.3.2 肌原纤维-Tax-Fenton氧化混合体系的构建
参考CHENG等[9]的方法并稍作修改。在MP溶液中分别加入质量分数为0%、0.2%、0.8%及1.5%的Tax(以蛋白计)及质量分数0.2% 二丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT),并加入Fenton氧化液,使每组MP溶液包括:10 mg/mL MP、0.1 mmol/L抗坏血酸、30 mmol/L H2O2、0.01 mmol/L FeCl3和Tax。以10 mg/mL MP溶液为空白对照。在4 ℃下孵育12 h,通过加入乙二胺四乙酸-二钠终止反应,离心取沉淀溶解稀释后检测。
1.3.3 羰基含量的测定
参考HUANG等[10]的方法稍作修改,向1 mL 4 mg/mL MP溶液中加入1 mL 10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼,25 ℃避光振荡1 h。加入1 mL质量分数 20% 三氯乙酸,取离心后沉淀物。接着用1 mL乙酸乙酯-乙醇(1∶1,体积比)洗涤3次沉淀后,加入3 mL 6 mol/L盐酸胍溶液。37 ℃保温30 min后,在10 000×g下离心5 min。最后,在370 nm波长下测量上清液的吸光度。羰基含量按公式(1)计算。
羰基含量/(nmol/mg蛋白)
(1)
式中:A,吸光度值;ρ,蛋白质量浓度,mg/mL;22 000,摩尔吸光系数;D,比色光径,1 cm。
1.3.4 巯基含量的测定
参考HU等[11]的方法稍作修改,进行总巯基含量的测定,取1 mL 4 mg/mL MP溶液与8 mL Tris-甘氨酸尿素缓冲液(pH 8.0)混合,7 500×g 离心15 min,取4.5 mL上清液后加入500 μL 10 mmol/mL DTNB溶液。在25 ℃下避光30 min后,在412 nm处测量吸光度。巯基含量按公式(2)计算。
巯基含量/(nmol/mg蛋白)
(2)
式中:A,吸光度值;C,蛋白质量浓度,mg/mL;13 600,摩尔吸光系数。
1.3.5 蛋白质游离氨含量测定
参考LI等[12]的方法稍作修改,准确吸取200 μL 4 mg/mL MP溶液置于试管中,加入2 mL 含有质量分数1% SDS的0.2 mol/L磷酸缓冲溶液(pH 8.2)和1 mL 质量分数0.01%三硝基苯磺酸溶液后,在50 ℃水浴避光30 min,再加入2 mL 0.1 mol/L Na2SO3后,测定420 nm处吸光度值。代入L-亮氨酸标准曲线(y=0.223 7x+0.106 1,R2=0.999 4),按公式(3)计算游离氨含量。
游离氨含量/(nmol/mg蛋白)
(3)
式中:C,样品吸光度对应标曲查得的浓度,mmol/L;m,样品蛋白质量浓度,mg/mL。
1.3.6 表面疏水性
参照陈腊梅等[1]的方法,向1.0 mL 4 mg/mL MP溶液中加入200 μL 1.0 mg/mL溴酚蓝溶液,反应10 min 后4 ℃、4 500×g离心15 min。稀释上清液后,在595 nm波长处测定吸光度,以溴酚蓝结合量表示表面疏水性指数,按公式(4)计算。
溴酚蓝结合量
(4)
式中:A1,空白对照溴酚蓝吸光度;A2,样品吸光度。
1.3.7 二聚酪氨酸含量的测定
参考马思丽等[13]的方法,荧光分光光度计测定1 mg/ml MP溶液的二聚酪氨酸含量,发射波长420 nm,激发波长325 nm,狭缝宽度5 nm,电压400 V,二聚酪氨酸含量以相对荧光值表示。
1.3.8 色氨酸内源荧光强度
参考CHEN等[14]的方法并略作修改,荧光分光光度计测量,狭缝宽度5 nm,激发波长283 nm,发射波长300～450 nm,扫描速度1 200 nm/min,激发电压400 V,磷酸盐缓冲液作为空白。
1.3.9 Zeta电位
将1.0 mg/mL MP溶液置于电位样品池中,在室温下测量zeta电位,仪器设定参数为:平衡时间60 s,散射角90°,测试温度25 ℃。
1.3.10 SDS-PAGE分析
参照李锦锦[15]的方法,取4 mg/mL待测蛋白溶液和等体积的5×上样缓冲液以4∶1混合,混合均匀后沸水浴5 min,取10 000×g,4 ℃离心10 min后的上清液用于电泳分析。
1.3.11 傅里叶红外光谱的测定
参考LI等[12]的方法,将蛋白于-80 ℃冷冻6 h后进行真空冷冻干燥,仪器参数:光谱分辨率4 cm-1,扫描波段4 000～650 cm-1。
1.3.12 数据统计与分析
所有试验重复3次,结果以“平均值±标准差”表示。采用SPSS 26.0进行方差分析和相关性分析,使用Duncan多重比较进行显著性分析(P<0.05为显著),Origin 2021作图。
2 结果与分析
2.1 Tax对Fenton氧化下MP羰基含量的影响
自由基能直接氧化蛋白质的赖氨酸、苏氨酸、精氨酸和脯氨酸侧链中的氨基酸残基形成羰基及其衍生物,因此羰基含量反映了蛋白氧化程度[16]。由图1知,经羟自由基(·OH)氧化(Ox-0%组)的MP羰基含量为(7.06±0.22) nmol/mg,比-Ox组增加了16%。逐步增加Tax质量分数,则羰基含量逐渐降低(P<0.05)。HUANG等[10]同样发现多酚添加量增加,羰基含量呈逐渐下降趋势,并且在高添加浓度时其下降幅度趋于平缓。Tax质量分数为0.8%及1.5%时对蛋白质氨基酸残基的保护作用最强。Tax以剂量依赖性方式抑制氧化MP中羰基化合物的积累,这也与YANG等[17]结果一致。这是因为包括Tax在内的类黄酮类物质由于含有羟基结构,它们表现出强大的抗氧化活性,能够中和自由基的影响,并可螯合金属离子[18]。BHT组与Ox-0%组羰基含量无显著差异(P>0.05),这可能是受到BHT溶解性影响,致使BHT与蛋白混合反应不充分。此外,Tax组的羰基含量均低于Ox-BHT组(P<0.05),表明Tax与BHT相比在抑制蛋白氧化方面展现出显著优势,能够有效阻断自由基对蛋白质的损伤作用。
图1 Fenton氧化下不同处理组MP的羰基含量
Fig.1 Carbonyl content of MPs in different treatment groups under Fenton oxidation
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.2 Tax对Fenton氧化下MP巯基含量的影响
巯基(—SH)是蛋白质氧化的关键敏感基团与生化标志物[19]。如图2所示,-Ox组巯基含量最高,为(96.81±1.48) nmol/mg;经·OH氧化后,Ox-0%巯基含量降至(85.69±1.36) nmol/mg。氧化处理后,MP构象变化暴露出若干巯基,而巯基作为蛋白质中的活性基团极易受到自由基的攻击,进而发生氧化修饰,转化为分子内或分子间的二硫键,导致了蛋白质交联和随后的功能改变[20]。随着Tax质量分数的增加,巯基含量先升高后下降,0.8%Tax能有效抑制巯基损失(P<0.05),且与Ox-BHT组相比差异不显著(P>0.05)。但当Tax质量分数增至1.5%时,MP巯基含量却降至比Ox-0%组更低的水平(P<0.05),说明高浓度酚暴露原本隐藏的巯基使其更易受自由基攻击。这可能由于部分Tax在清除自由基过程中导致羟基的氧化,形成的醌类化合物与蛋白质分子中的巯基反应,通过Michael加成反应机制形成稳定的巯基-醌加成产物,进而显著降低蛋白质分子中巯基的相对含量[21]。
图2 Fenton氧化下不同处理组MP的巯基含量
Fig.2 Thiol content of MPs under different treatment groups with Fenton oxidation
2.3 Tax对Fenton氧化下MP游离氨含量的影响
如图3所示,未氧化MP的游离氨含量为(83.84±1.52) nmol/mg,其显著高于其余组(P<0.05),·OH氧化后下降了7.45%。MP中赖氨酸残基的ε-NH2基团倾向于转化为羰基,然后与伯胺反应形成席夫碱化合物,从而导致游离氨含量降低[22]。Ox-0.8%组的游离氨含量显著大于其余添加Tax组(P<0.05),且与Ox-BHT组差异不显著,Ox-1.5%组的游离氨含量显著降低,表明加入质量分数0.8%Tax对MP保护作用最强。这一现象可能归因于多酚类化合物对MP氧化的保护作用,它有效地抑制了游离氨基的减少。CAO等[23]发现MP与绿原酸结合后游离ε-NH2呈下降趋势,这种抑制作用与多酚浓度有关。CHANG等[24]同样发现高浓度添加多酚会导致游离氨含量下降。多酚氧化生成的醌与蛋白质自由氨之间的共价加成是导致额外ε-NH2损失的原因。
图3 Fenton氧化下不同处理组MP的游离氨含量
Fig.3 Free amine content of MP under Fenton oxidation in different treatment groups
2.4 Tax对Fenton氧化下MP表面疏水性的影响
表面疏水性能反映出蛋白质构象变化,表征蛋白质中疏水位点在蛋白表面的暴露程度[25]。如图4所示,氧化组MP表面疏水性显著高于-Ox组(P<0.05),证明·OH可导致蛋白质疏水基团的暴露。在添加Tax组合中,表面疏水性从0%到0.2%是降低趋势,JIA等[26]也发现类似结果,这表明Tax与儿茶素同样可能在疏水结构域与MP发生非共价结合并形成新的复合物。Ox-0.2%组表面疏水性与BHT组处于相同水平,两者之间没有显著性(P>0.05),这可能是由于Tax和MP之间的疏水力和氢键同样能有效防止MP内疏水基团的暴露[17]。而从Tax 0.2%到1.5%为上升趋势,蛋白质表面疏水性的增加可能归因于Tax氧化形成的醌类化合物和MP之间的共价相互作用[27]。
图4 Fenton氧化下不同处理组MP表面疏水性变化
Fig.4 Changes in surface hydrophobicity of MP under different treatment groups with Fenton oxidation
2.5 Tax对Fenton氧化下MP二聚酪氨酸的影响
酪氨酸因其苯环的酚羟基容易被自由基攻击,首先被氧化生成酪氨酰基;随后通过分子内或分子间交联反应形成二聚酪氨酸[28]。如图5所示,Ox-0%组二聚酪氨酸含量最高(P<0.05),为(4.03±0.03),表明该组氧化最严重。-Ox组与Ox-0.2%组差异不显著,表明Tax具有较好的抗氧化作用,可抑制蛋白质分子中侧链氨基酸的聚合,从而降低二聚酪氨酸的生成。当加入质量分数0.8%及1.5% Tax时,其含量最低且显著低于-Ox组(P<0.05),可能由于Tax的引入对蛋白质侧链氨基酸产生了过强的保护效应,致使酪氨酸分子被过度包裹,从而引起荧光强度的下降[29]。
图5 Fenton氧化下不同处理组MP二聚酪氨酸变化
Fig.5 Changes in dityrosine content in MP across different treatment groups under Fenton oxidation
2.6 Tax对Fenton氧化下MP固有色氨酸荧光的影响
色氨酸残基在蛋白质内部疏水环境中,其荧光强度强;蛋白解折叠后其暴露于亲水环境则荧光强度减弱[30]。如图6所示,与未氧化MP相比,氧化MP的色氨酸荧光强度显著下降,反映了蛋白质三级结构的破坏。BHT与Tax的加入均抑制了荧光信号,高质量分数Tax产生的抑制作用更为显著,荧光强度下降更为突出,这说明蛋白质发生了解折叠,使更多色氨酸残基暴露于极性环境。CAO等[23]也发现了类似结果。Tax的苯环与色氨酸残基的吲哚结构发生相互作用,部分遮蔽荧光发色团,导致固有荧光淬灭[31-32]。PAN等[21]研究发现,丁香酚的加入能够有效抵消氧化应激导致的荧光淬灭效应,这一现象与Tax处理后呈现相反趋势。该差异可归因于所添加酚类化合物的极性、芳香环数目及分子质量等结构特征方面的固有差异[33]。
图6 Fenton氧化下不同处理组MP固有色氨酸荧光变化
Fig.6 Changes in intrinsic tryptophan fluorescence of MP across different treatment groups under Fenton oxidation
2.7 Tax对Fenton氧化下MP溶液zeta电位的影响
Zeta电位是表征蛋白质表面电荷的关键参数,绝对值越大,体系越稳定。如图7所示,-Ox组电位绝对值显著高于其余组,蛋白稳定性最好(P<0.05),而在氧化的Ox组体系稳定性均低于该组。HUANG等[10]同样发现,蛋白质氧化后结构发生改变,氧化削弱了颗粒之间的静电相互作用力,其分子间的吸引力强于排斥力,相互交联聚集,zeta电位绝对值降低[34]。随着Tax添加量增加,其绝对值先增大后降低(P<0.05),峰值出现在0.8%,表明此时体系稳定性最好,这证明Tax能有效抗氧化,减轻蛋白质氧化损伤并增强体系稳定性,但添加过量会导致蛋白质聚集及稳定性下降[10]。
图7 Fenton氧化下不同处理组MP溶液zeta电位变化
Fig.7 Changes in zeta potential of MP solutions under different treatment groups in Fenton oxidation
2.8 Tax对Fenton氧化下MP的SDS-PAGE影响
如图8所示,-Ox组条带强度均强于其余组别,Ox-0%组肌球蛋白重链、肌动蛋白及部分肌球蛋白轻链条带均较弱,MP氧化程度高。此后,随着Tax质量分数的增加以上区域条带强度均逐渐升高,Ox-0.8%组达到最大,说明Tax能抑制蛋白质的过度交联聚集;Ox-1.5%组的肌球蛋白重链条带强度低于Ox-0.8%组,表明此时多酚通过蛋白质-多酚-蛋白质共价相互作用导致交联和蛋白质聚集,形成大分子聚合物,降低其强度[35]。PAN等[36]与LI等[12]同样发现高剂量的含酚类物质可形成醌,这促进了蛋白质中蛋氨酸、赖氨酸、丝氨酸等的交联聚合,最终降低了其条带强度。
图8 Fenton氧化下不同处理组MP的SDS-PAGE变化
Fig.8 Changes in SDS-PAGE of MP solutions under different treatment groups in Fenton oxidation
2.9 Tax对Fenton氧化下MP二级结构的影响
如图9所示,与未氧化组相比,氧化后α-螺旋、β-折叠及β-转角的含量下降,大量转化为了无规则卷曲。这说明氧化使蛋白质展开、氢键断裂,破坏α-螺旋与β-折叠并转为无规卷曲,降低结构稳定性,暴露内部疏水残基,增强MP的疏水相互作用[21]。BHT组与Ox-0%组β-折叠及β-转角无显著差异(P>0.05),这可能与BHT的溶解性有关。随着Tax的添加,α-螺旋和β-折叠的含量显著增加(P<0.05)。α-螺旋由肽链中的氢键进行稳定,β-折叠由肽链之间的氢键稳定,均代表蛋白的稳定程度。对比Ox-0%组,Ox-0.2%组与Ox-0.8%组的α-螺旋比例分别增加了21.31%及25.56%。然而,加入质量分数1.5%的Tax,蛋白质α-螺旋含量急剧降低(P<0.05)。HUANG等[10]也得到了类似结果,证明中等浓度的多酚可以加强氢键,从而导致氧化过程中α-螺旋含量增加,而过量多酚氧化成醌将导致α-螺旋含量的降低,醌攻击MP中的—NH或—SH基团,并且破坏MP氢键[31]。
图9 Fenton氧化下不同处理组MP的二级结构变化
Fig.9 Changes in FTIR spectra of MP solutions under different treatment groups in Fenton oxidation
3 结论与讨论
Tax在减缓自由基氧化诱导的蛋白质结构改变方面,展现出与植物提取物相当的蛋白质保护作用[17, 24]。不同剂量的Tax对·OH诱导的牦牛肉蛋白质氧化损伤具有差异化的保护作用。在较低质量分数范围内(0.2%～0.8%),Tax能够有效缓解·OH诱导的蛋白质氧化损伤;然而,当其质量分数升高至1.5%时,则会加剧蛋白质的氧化反应并促进其聚集现象的发生。本研究结果表明,质量分数为0.8%的Tax在抑制蛋白质氧化反应及蛋白聚集现象方面表现出最优效应,可以从羰基、巯基、游离氨、zeta电位及二级结构等数据得以证实。这些结果表明Tax可以有效防止蛋白质氧化,保持蛋白质原有结构并减少氧化应激下的蛋白质聚集,该研究成果为Tax在蛋白加工工业领域的应用提供了理论参考。
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