龙安柚源于四川省广安市,是一种富含维生素C、黄酮、矿物质等营养成分的柑橘类水果,因其具有调节人体新陈代谢、消食醒酒、降低血压等功效而广受消费者青睐,有较高的市场价值和研究价值。然而,龙安柚采后水分显著流失,易被病原菌感染腐败,因此其采后的贮藏保鲜是一项重大挑战。
目前国内外的柚子贮藏保鲜技术包括热处理[1]、低温贮藏[2]、可食性涂膜保鲜技术[3]等。但热处理可能导致表皮细胞受损,引发褐变,影响龙安柚的感官评价。龙安柚作为亚热带柑橘类水果,低温处理易使细胞膜透性增加,加速细胞衰老,使果皮凹陷。以上处理方法对保鲜后龙安柚的品质有一定损伤,影响其表皮外观,而可食性涂膜可阻隔病原菌侵染,在龙安柚表面形成致密保护层,降低机械损伤风险,因此可食性涂膜保鲜技术具有较大发展前景。
拮抗菌能形成生物膜抵抗病原菌的侵入,还能作为生物激活因子诱导植物的抗病性,目前已成为一种新兴的保鲜方法应用于果蔬贮藏[4]。然而,拮抗菌直接应用时存在一定局限性,由于果实表面营养物质匮乏及环境条件波动,拮抗菌抑菌活性难以维持。为提高其稳定性和作用效果,可采用包埋技术将拮抗菌固定于可食性涂层基质中。该法不仅能有效保护拮抗菌的活性,还能延长其作用时间并扩大应用范围[5]。吴斌娥等[6]提取淀粉芽孢杆菌GSBa-1作为拮抗菌包埋于壳聚糖形成保鲜膜,对芒果保鲜效果良好。
LU等[7]的研究表明,枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)不仅能抑制蓝莓灰霉病,还可诱导果实产生系统性抗病性。说明该菌株本身即可作为植物免疫激发子,增强宿主对病原真菌的防御能力。基于此,本研究拟将B. subtilis作为拮抗菌包埋于聚合物涂层中,进一步探究其对龙安柚果实抗病性的诱导效应。制备不同浓度的海藻酸钠(sodium alginate,SA)、壳聚糖(chitosan,CS)、魔芋葡甘露聚糖(konjac glucomannan,KGM)、羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose,CMC-Na)作为B.subtilis的涂层,分别进行性能测定以筛选出最合适的涂膜液并测定其水蒸气透过率、机械强度等,探究承载B.subtilis的可食性涂膜液对龙安柚的贮藏保鲜效果。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
SA(食品级),连云港天天海藻工业有限公司;CS(食品级),郑州铭泽生物科技有限公司;KGM(食品级),浙江天禾食品生物有限公司;CMC-Na(食品级),上海长光企业发展有限公司;龙安柚,四川省广安市龙安柚母本园;马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基、LB培养基,均为分析纯,青岛海博生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
ThermoBR4i冷冻离心机,赛默飞世尔科技有限公司;JA1003分析天平,上海舜宇恒平科学仪器有限公司;HJ-6A多头磁力加热搅拌器,常州国华电器有限公司;SPX-250B数显生化培养箱,常州金坛良友仪器有限公司;BC-46A恒温恒湿冷藏柜,中山市美尼亚电器有限公司;102e旋转流变仪,安东帕商贸有限公司;GY-4果实硬度计,乐清市艾德堡仪器有限公司;SD-201测厚仪,深圳市源恒科技有限公司;TD-45手持式数字糖量计,上海仪电物理光学仪器有限公司;JSM-5600LV扫描电子显微镜,日本日立有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 涂膜基质及B.subtilis最佳抑菌浓度的筛选
1.3.1.1 涂膜基质的筛选
采用FAN等[8]的方法并适当改动制作SA涂层,称取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g的SA和2.0 g甘油分别加入100 mL蒸馏水中搅拌均匀以制得SA溶液。参照杨穗珊等[9]的方法稍作改动制作CS涂层,采用不同质量梯度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g)进行CS溶液的配制,以体积分数为1%的冰醋酸水溶液为溶剂,添加质量分数为1%的甘油作为增塑剂,将不同质量的CS分别加入其中,最终用相同浓度的冰醋酸溶液定容总体积至100 mL。将混合溶液置于40 ℃水浴中持续搅拌使其充分溶解,最后进行超声波脱气处理以消除残留气泡。采用韦巧艳等[10]的方法,将0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g的KGM精粉分别溶解于300 mL的蒸馏水中,经58 ℃恒温水浴搅拌40 min使其充分溶解,然后超声波处理去除气泡,最终制备得到不同系列浓度的KGM涂膜液。参照吕宝东[11]的方法稍作改动制作CMC-Na溶液,将不同质量梯度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g)的CMC-Na溶解于100 mL的蒸馏水中,经磁力搅拌器充分混匀制得溶液。将4种不同基质制备的涂膜液分别与浓度1×108 CFU/mL的B. subtilis菌悬液按体积比9∶1混合。在常温贮藏条件下,每隔10 d移取1 mL混合样液,进行梯度稀释后接种于LB平板,37 ℃培养48 h后计数。通过比较不同基质中活菌数的变化趋势,评估各涂膜基质的生物相容性,进而筛选出最适涂层基质。
1.3.1.2 不同涂膜基质对B.subtilis形态的影响
将上述经过生物相容性测定后的B.subitlis菌落重新在新的LB平板上进行划线后37 ℃培养48 h至长出菌落。在LB液体培养基中接入B.subitlis,在37 ℃、120 r/min,培养24 h后静置,使其在液体表面形成菌膜。
1.3.1.3 B.subtilis最佳抑菌浓度的筛选
a)最佳体外抑菌浓度的测定:对B. subtilis菌悬液进行梯度稀释后,移取100 μL稀释液均匀涂布于PDA平板表面,空白对照组加入等量无菌水。使用无菌打孔器在平板中心处打孔,将预先制备的病原菌菌饼(直径5 mm)接种于孔内。28 ℃培养4～5 d,采用十字交叉法测量菌落直径,测量抑菌率,按公式(1)计算抑菌率:
抑菌率
(1)
b)最佳体内抑菌浓度的测定:在龙安柚果皮正反两面用打孔器制备2个直径5 mm、深度4 mm的伤口。将1×108 CFU/mL的B.subtilis菌悬液取10 μL接种于伤口处,待其晾干后,再接入10 μL意大利青霉菌(Penicillium italicum)孢子悬液(1×105 CFU/mL)。伤口经保鲜膜密封后,在(15±1) ℃,相对湿度75%～85%条件下,将果实置于控湿培养箱中培养。每日监测伤口发病情况,空白对照组用无菌水替代菌悬液进行相同处理。
1.3.2 不同浓度SA涂膜及B.subtilis/SA涂膜的性能表征与测试
1.3.2.1 水蒸气透过率
参照GB/T 1037—2021《塑料薄膜与薄片水蒸气透过性能测定 杯式增重与减重法》标准,测试不同浓度SA薄膜的水蒸气透过性能。把样品制成直径80 mm的圆形试片,在(25±1) ℃、相对湿度(50±2)%的恒温恒湿环境中平衡24 h,保证样品达到吸湿平衡状态。
1.3.2.2 机械强度的测定
参照GB/T 1040.2—2022《塑料 拉伸性能的测定 第2部分:模塑和挤塑塑料的试验条件》,对不同浓度SA薄膜的拉伸强度及断裂伸长率进行测试。将待测膜样品按标准尺寸裁切并筛选完整试样,将筛选出的样品固定于测试夹具。随机选取5个测量位点,使用膜厚仪测定厚度并取平均值。拉伸速率设定为50 mm/min。最终取两者的平均值作为该膜的力学性能指标。按公式(2)、公式(3)计算相应指标:
拉伸强度
(2)
断裂伸长率
(3)
式中:F,试样在拉伸断裂瞬间所能承受的最大载荷值,N;A,试样横截面积,mm2;L,试样断裂时的长度,mm;L0,试样的原始长度,mm。
1.3.2.3 微观形貌表征
参照吴方方[12]的方法,稍作改动。使用手术刀从龙安柚果实表面切取1 cm2表皮样品,放入液氮中速冻,真空冷冻干燥后进行喷金处理,再用扫描电镜观察。
1.3.2.4 B.subitlis在SA涂层贮存过程中的细胞活力的测定
在制备后和60 d的贮存期内定期(每10 d)在不同SA薄膜中评估的细胞活力。在(8±1) ℃和相对湿度75%～85%贮存在气候室内培养皿中的生物活性膜,无菌去除并置于含有100 mL质量分数为0.9%无菌生理盐水的无菌塑料袋中,然后均质化2 min,进行梯度稀释,吸取0.1 mL适当稀释液涂布到LB平板上。37 ℃培养48 h后对菌落进行计数。
1.3.3 B.subtilis/SA涂膜对龙安柚的采后保鲜实验
选用大小均匀、表皮完好的龙安柚果实,用200 mg/L NaClO溶液清洗果实表面,放在通风处晾干。再将果实分别浸入质量分数为2.0%的SA溶液、B.subtilis悬液(108 CFU/mL)及B.subtilis/SA复合涂层液处理组中30 s,空白对照组使用无菌水处理,每组处理25个果实。再额外取10个果实做相同处理后单独包装,用于失重率测试。所有处理后的果实置于(8±1) ℃、相对湿度75%～85%的环境中贮藏90 d。每7 d随机抽取3个果实,测定其生理品质和生化指标。
1.3.4 龙安柚品质指标的测定
1.3.4.1 感官评价
参照赵镭等[13]的方法稍作改进,从实验室中随机挑选20名评价员,男女各一半,根据感官评价方法和原则对龙安柚的外观、质地、风味和口感进行评分。采用何义仲等[14]的方法结合实验室条件建立出评分标准(表1)。
表1 感官评分标准
Table 1 Sensory scoring criteria
分值/分项目外观风味质地口感9～10色泽明亮,能够引起评价员食欲香味浓郁颗粒完整,质地饱满汁水饱满,脆嫩爽口,滋味浓郁,咀嚼性好7～8色泽较明亮,评价员愿意食用香味较浓颗粒较完整,质地较饱满多汁,较爽口,滋味较好,咀嚼性较好5～6色泽微暗,评价员对果实外观尚可接受香味较淡,发酵味淡颗粒有轻微破损,质地微韧或微绵果肉汁液较少,具有一定的滋味,咀嚼性一般3～4色泽暗淡,评价员对果实外观勉强接受香味淡,发酵味较明显颗粒破损,质地韧或发绵无明显甜味,咀嚼性略差1～2褶皱畸形,色泽暗淡无光,评价员对果实外观不可接受基本无香味,有明显发酵味颗粒不成形,质地绵软口感发绵,汁水少,咀嚼性差
1.3.4.2 果皮色差
用色差仪在果实表面随机选择3个点测定a*值、b*值和L*值。
1.3.4.3 硬度、失重率
a)硬度:每组柚子随机取5个部位,切去外皮露出果肉,用果实硬度计测量果肉的硬度(kg/cm2),结果取平均值。
b)失重率:指果蔬在特定贮藏条件下因蒸腾作用导致质量损失的相对比例,按公式(4)计算:
失重率
(4)
式中:m0,贮藏前质量,g;mt,贮藏后质量,g。
1.3.4.4 可溶性固形物、总酸的测定
a)可溶性固形物:取可食部分果肉组织经匀浆处理后,称取250 g样品,通过4层无菌纱布过滤获得澄清果汁。采用手持式数字糖量计测定可溶性固形物含量。
b)总酸:依据GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定(含第1号修改单)》,测定龙安柚果肉的可滴定酸含量。称量200 g的果肉样品,加入等量蒸馏水在研钵中充分研磨成匀浆。称取25.0 g匀浆液加入到锥形瓶中,在加入200 mL蒸馏水混合后封口,100 ℃水浴30 min,中途摇晃避免CO2干扰。冷却转移到250 mL的容量瓶中用蒸馏水定容后过滤。移取50 mL滤液至锥形瓶,空白对照采用等量蒸馏水代替。滴加质量分数为1%酚酞2滴,用0.1 mol/L NaOH标准溶液进行滴定,直至溶液变为微红色且30 s内不褪色时停止滴定。总酸含量结果按公式(5)计算:
总酸
(5)
式中:C,标准NaOH溶液的浓度,mol/L;V1,NaOH标准滴定样液消耗的体积,mL;V2,NaOH标准滴定空白消耗的体积,mL;F,样液稀释倍数;m,样品取样量,g或mL;K,酸的换算系数(柠檬酸K=0.064)。
1.3.4.5 类黄酮、丙二醛的测定
a)类黄酮:称取2.0 g经液氮速冻研磨成的果皮粉末样品,加入已经预冷过的20 mL的体积分数为1%的HCl-甲醇溶液,混合均匀,避光处理后放置在-4 ℃冰箱中提取20 min,提取过程中多次摇匀,过滤后在325 nm处测量滤液吸光值,以体积分数为1%的HCl-甲醇溶液调零。结果以OD325/g FW表示。
b)丙二醛:参照KOU等[15]的方法并作适当优化,采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)比色法对丙二醛含量进行定量分析。精确称量经液氮超低温处理后的果皮样品1.0 g,置于预冷研钵中研磨成粉状,转移到离心管后添加10 mL 0.05 mol/L的磷酸缓冲液。经充分提取后,6 000 r/min离心15 min,精确移取2 mL上清液至新离心管,加入等体积质量分数为0.5%的TBA溶液,充分混匀后100 ℃水浴中加热30 min。水浴结束后,立即将离心管放入冰水中快速冷却,随后以3 000 r/min离心20 min,最终在600、532、450 nm波长处测定获得上清液的吸光值,以质量分数为0.5%的TBA溶液作为空白对照进行基线校准。按公式(6)、公式(7)计算丙二醛含量:
c/(μmol/L)=6.25×(OD532-OD600)-0.56×OD450
(6)
丙二醛含量
(7)
式中:c,反应液中丙二醛浓度,μmol/L;VS,样品提取液总体积,mL;V,测定时所取样品提取液体积,mL;m,样品质量,g。
1.3.4.6 番茄红素、木质素的测定
a)番茄红素:龙安柚果肉经研钵研磨成匀浆。称取3.0 g果肉匀浆样品,与2 mL无水乙醇充分混合后转移至离心管。5 000 r/min离心10 min,去除上清液后,加入10 mL丙酮与10 mL石油醚的混合均匀。充分振荡后避光浸提2 h,期间每隔20 min进行涡旋混匀以促进成分提取。提取结束后,将混合物经滤纸过滤,滤液收集至分液漏斗,使用去离子水进行3次萃取洗涤以去除残留丙酮。分离获取上层有机相后,准确移取1 mL提取液至10 mL棕色容量瓶,以石油醚定容至刻度线并充分混匀。以石油醚调零后在502 nm波长处测定其吸光值。
b)木质素:参照HONG等[16]的方法并作适当改进。称取1.0 g研磨成浆的果皮样品于10 mL离心管中,用体积分数95%的乙醇溶液洗涤3次,再用95%乙醇∶正已醇(1∶2,体积比)溶液洗涤3次,60 ℃下干燥24 h。在干燥沉淀物中加2 mL体积分数25%的乙酰溴/乙酸溶液,将离心管70 ℃水浴反应30 min,之后加入0.9 mL 2 mol/L NaOH溶液终止溴化反应,再加人5 mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol/L盐酸羟胺溶液,最后用冰醋酸定容至10 mL,混匀,以冰醋酸调零后在280 nm处测定其吸光值。
1.4 数据处理
所有实验至少设置3个生物学重复,数据用SPSS 24进行统计学分析,结果以“平均值±标准差”表示。运用单因素方差分析结合Duncan多范围检验进行组间显著性比较,显著性水平设定为P<0.05。利用Origin 2025软件进行图表的绘制。
2 结果与讨论
2.1 涂膜液的筛选分析
2.1.1 不同涂层基质的生物相容性测定和对拮抗菌形态的影响
由图1-a可知,B.subtilis在不同浓度SA制成的涂层中维持了较高的活性,B.subtilis在涂层中维持的活性随着SA浓度的增加升高。由图1-b可知,B.subtilis在不同浓度的KGM制成的涂层中活性都较低,这是由于KGM分子中存在大量的羟基,极易和水分子形成氢键,低浓度时也容易与水结合后形成胶体,浓度高时可快速形成胶体[17],加入B.subtilis后不易混合均匀,导致拮抗菌在涂层中分布不均,活性不稳定。由图1-c可知,B.subtilis在不同浓度CS制成的涂层中也维持了较高的活性,浓度越高,B.subtilis在涂层中的活性越高。由图1-d可知,B.subtilis在不同浓度CMC-Na制成的涂层中活性较低,这可能是由于CMC-Na形成的溶液较浓稠,渗透压过高,浓度较高的CMC-Na溶液会使得细菌细胞内的水分子向外渗透,导致细胞脱水,从而影响B.subtilis在CMC-Na涂层中的活性。综上所述,B.subtilis在SA和CS制备的涂层中均具有稳定良好的活性。
a-SA生物相容性;b-KGM生物相容性;c-CS生物相容性;d-CMC-Na生物相容性;e-空白对照组菌落形态;f-CS组菌落形态;g-SA组菌落形态;h-KGM组菌落形态;i-CMC-Na组菌落形态
图1 不同涂层基质中拮抗菌活性和不同涂层基质对B.subtilis形态的影响
Fig.1 Determination of antibacterial activity in four different coating substrates and the influence of different coating substrates on the morphology of B.subtilis
注:不同小写字母表示显著性差异(P<0.05)(下同)。
如图1-e所示,没有接种到涂层中的B.subtilis在LB平板上形成黄白色、不透明、有隆起皱、边缘不光滑的菌落。接种到CS涂层中的B.subtilis在LB平板上形成菌落比空白对照组的菌落小、不透明、菌落边缘变得光滑(图1-f)。接种到SA涂层中的B.subtilis在LB平板上形成黄白色、不透明、菌落边缘不光滑且菌落中心存在褶皱(图1-g)。接种到KGM和CMC-Na中的B.subtilis在平板上形成的菌落形态与空白对照组相比有明显变化,菌落较为透明、呈乳白色(图1-h、图1-i)。上述结果表明SA涂层对B.subtilis形态没有造成明显的影响,CS涂层对B.subtilis的形态影响较小,KGM和CMC-Na对B.subtilis的形态影响最明显。B.subtilis的形态影响其拮抗能力,因此选用SA作为B.subtilis的涂层基质最为合适。
2.1.2 B.subitlis体内外最佳抑菌浓度的筛选
由图2可知,随着B.subtilis菌悬液浓度的增加,平板中的P.italicum菌落直径逐渐减小,当B.subtilis菌悬液浓度为1×108、1×109 CFU/mL时,P.italicum菌落直径最小,抑菌率高达90%以上,与浓度为1×107、1×106 CFU/mL相比,抑菌率存在显著差异。说明B.subtilis菌株对龙安柚病原菌P.italicum在离体的情况下,起最佳抑菌效果的浓度为1×108、1×109 CFU/mL,其中最佳抑菌浓度为1×108 CFU/mL。1×104～1×109 CFU/mL的抑菌直径均明显小于空白对照组,且都与空白对照组存在显著差异(P<0.05)。结果表明,B. subtilis在离体的PDA平板上能够明显抑制P. italicum的生长,有显著的生防作用。
图2 不同浓度的B.subtilis菌悬液在体内外对病原菌的抑菌性
Fig.2 Antibacterial activity of B.subtilis suspension with different concentrations against pathogenic bacteriain vivo and in vitro
在龙安柚果实表面制造伤口接种P.italicum孢子后,各浓度的B.subtilis菌悬液处理后果实的病斑直径如图2所示。龙安柚伤口直径的变化趋势可知,随着B.subtilis菌悬液的浓度逐渐增加,龙安柚的伤口直径逐渐降低,当浓度为1×108、1×109 CFU/mL时达到最低,经计算发病率低于2%,与浓度1×107 CFU/mL相比具有显著差异(P<0.05),表明在龙安柚果实体内,B.subtilis对病原真菌P.italicum起到最佳抑菌效果的浓度为1×108 CFU/mL和1×109 CFU/mL,以浓度1×108 CFU/mL为最佳。从浓度1×104 CFU/mL到1×109 CFU/mL的伤口直径均明显小于空白对照组,且都与空白对照组存在显著差异(P<0.05),表明在龙安柚果实体内B.subitlis能够明显抑制病原真菌P.italicum有显著的生防作用。
2.2 不同浓度SA涂膜及B.subtilis/SA涂膜的性能表征
2.2.1 SA浓度对水蒸气透过率、黏度、机械强度和微观形态表征的影响
涂膜的水蒸气透过率与对水分的阻隔性能呈负相关,即水蒸气透过率越小,涂膜材料对水蒸气的阻隔效果越好,较小的水蒸气透过率对食品的新鲜程度具有一定保持作用[18]。由图3-a可知,水蒸气透过率随SA的浓度增加呈先下降后上升的趋势。这可能是由于随着SA浓度增大,涂层中SA分子间隙减小,形成的涂层更紧致,导致水蒸气透过率下降,随后由于涂膜液中的SA含量过高,在形成涂膜时,SA分子堆积在一起,使得形成的涂膜刚性增强、易破损,导致涂膜的水蒸气透过率上升,SA质量分数为2.0%时水蒸气透过率最低,有利于阻止龙安柚水分的蒸发,减缓龙安柚在贮藏期间的失重。因此SA的质量分数为2.0%是制备涂膜液的最佳浓度。同时B.subtilis的掺入对涂膜的水蒸气透过率无显著影响(P>0.05)。
a-水蒸气透过率;b-拉伸强度;c-断裂伸长率;d-B.subtilis在涂层中的活力;e-0.5% SA涂膜的扫描电镜图;f-1.0% SA涂膜的扫描电镜图;g-1.5% SA涂膜的扫描电镜图;h-2.0% SA涂膜的扫描电镜图;i-2.5% SA涂膜的扫描电镜图;j-B.subtilis/SA涂膜的扫描电镜图
图3 不同SA浓度、B.subtilis/SA的性能表征图
Fig.3 Performance characterization chart of B.subtilis/SA at different SA concentrations
拉伸强度和断裂伸长率可表征不同浓度SA膜的力学性能[19]。由图3-b可知,拉伸强度随SA浓度的增加而增强,其中质量分数为2.0%时的拉伸强度适中。而断裂伸长随着SA浓度增加而先增大后减小(图3-c),这是由于SA浓度过高时,制成的涂膜刚性较强,从而导致涂层易破碎,不利于形成完整涂层。质量分数为2.0%的SA涂膜的断裂伸长率最大,说明此浓度涂膜的柔软性能和弹性最佳。质量分数为2.0% SA涂膜中掺入B.subtilis后,对涂膜的机械强度无显著影响(P>0.05)。
如图3-e所示,在未经过涂膜处理的龙安柚果实表面可以观察到分布不连续的蜡质。质量分数为0.5%的SA涂膜处理后,SA不均匀地覆盖在柚子表面,还能观察到柚子表皮的蜡质(图3-f)。质量分数为1.0%的SA涂膜处理后,SA较均匀地分布在柚子表面,但是还能观察到少量柚子表皮的蜡质(图3-g)。质量分数为2.0%和2.5%的SA涂膜处理均能够完全覆盖柚子表皮的蜡质,2.0%的SA涂膜在柚子表皮形成的涂膜相较于质量分数为2.5%的更平整(图3-h、图3-i)。B.subtilis/SA涂膜处理组中,拮抗菌填补了SA分子的间隙,形成的涂膜比质量分数为2.0%的SA涂膜表面更加平整,并且涂层表面分布着均匀的微小突起(图3-j),说明B.subtilis均匀地分散在涂层中。
2.2.2 贮藏过程中B.subtilis在涂层中的活力
如图3-d所示,涂层中的B.subtilis在贮藏60 d时,活力仍高于106 CFU/g,并且在整个贮藏过程中活力没有出现很大的变动。而空白对照组的B.subtilis活性随着贮藏天数的增加逐渐降低,第20天时,B.subtilis的活力低于107 CFU/g,第60天时B.subtilis的活力降低到105 CFU/g以下。说明B.subtilis在涂层中能够保持较高的活性,这可能是由于SA涂层为B.subtilis提供稳定的生存环境和营养物质。FERNANDES等[20]将乳酸菌装载到SA涂层,其可控制番石榴炭疽病的发生,贮藏15 d后涂层中的乳酸菌仍然具有较高的活性。说明SA涂层可为包埋于其中的拮抗菌提供营养环境,使拮抗菌活力保持在较高水平。
2.3 B.subtilis/SA涂膜对龙安柚的保鲜实验
2.3.1 不同处理下龙安柚的感官评价
如图4所示,在前30 d内,各处理组和空白对照组在外观、风味、质地和口感等方面的感官评价结果无显著差异(P>0.05),但从第45天开始,空白对照组的评分开始低于其他处理组,其中含拮抗菌涂膜处理组的评分显著高于处理组(P<0.05)。贮藏90 d时,空白对照组的龙安柚果皮表皮皱缩,出现果柄处出现明显褐变腐烂的现象,果肉颗粒发生溃烂,颗粒不完整,并且伴有强烈的酒精发酵的味道;B.subtilis菌悬液处理组的龙安柚果皮也发生了皱缩,严重失水,果柄处也出现褐变腐烂现象,果肉颗粒不完整,并伴有轻微酒精发酵的味道,说明B.subtilis不能长时间抑制龙安柚表面病原真菌的侵染;质量分数为2%的SA涂膜处理组龙安柚表面发生轻微皱缩,果肉颗粒较完整,而B.subtilis/SA涂膜处理组的龙安柚在外观上仍具有较高的感官评分,果皮光滑并具有光泽,果肉水分充足颗粒饱满,无不良气味,说明B.subtilis/SA涂膜处理处理能够延长龙安柚的贮藏期,并在贮藏期间维持较良好的食用品质。
a-贮藏0 d;b-贮藏15 d;c-贮藏30 d;d-贮藏45 d;e-贮藏90 d
图4 不同涂膜处理对龙安柚感官评价的影响
Fig.4 Effect influence of different coating treatments on the sensory evaluation of Long’an pomelo
2.3.2 不同处理下龙安柚果皮色差的变化
果实的颜色参数是评价其贮藏品质的重要指标。龙安柚成熟采摘时,果皮的颜色一般偏绿色,在龙安柚的采后贮藏过程中,柚子的外观会逐渐从绿色变为黄绿色最终变成黄色,随着柚子果皮颜色的变化,果皮的色泽逐渐降低,新鲜度逐渐降低。如图5所示,贮藏结束时,空白对照组L*值从52.34急剧下降到48.73,SA处理组和B.subtilis处理组L*值分别下降2.02、3.93,B.subtilis/SA涂膜处理组的L*从53.24逐渐下降到52.89,下降趋势相较于3组处理组更缓。4个处理组的果皮b*值(黄度)都逐渐升高,从第0天到第90天,空白对照组的b*值从36.57上升到45.89,SA处理组和B.subtilis处理组b*值分别上升2.68、8.38,而B.subtilis/SA涂膜处理的b*值从40.85上升到42.99,上升趋势缓慢。实验结果表明,B.subtilis/SA协同处理能有效抑制龙安柚果皮的b*值的升高和L*值的降低,这可能是由于果实表面的涂层可以调节水果的微环境,作为气体和湿度的屏障,降低呼吸强度和营养物质的消耗,减缓酶促反应引起褐变。从图5-c也可观察出涂膜处理抑制了果皮转色,减缓果皮变黄的速度。果皮褐变还会受各种生理和病理因素的影响,基因表型、果实的成熟度、采后生理状况、运输贮藏环境都会引起不同程度的水果褐变[21]。
a-L*;b-a*;c-b*
图5 不同涂膜处理对龙安柚采后贮藏期间外观色差的影响
Fig.5 Effect of different coating treatments on the appearance color difference of Long’an pomelo during post harvest storage
2.3.3 不同处理下龙安柚贮藏品质的变化
如图6-a所示,不同处理组和空白对照组的硬度随时间增长逐渐下降,贮藏结束时,空白对照组果实硬度(9.16±0.87) N,低于其他处理组,B.subtilis/SA涂膜处理组的硬度最高,为(18.62±0.55) N。在贮藏期间,不同处理组的失重率均呈现上升趋势(图6-b),其中空白对照组和B.subtilis菌悬液处理组的失重率远高于质量分数为2.0%的SA涂膜处理组和B.subtilis/SA涂膜处理组(P<0.05),B.subtilis/SA涂膜处理组的失重率最低,为(7.6±0.91)%。这是由于龙安柚的表皮较为柔软,在采摘运输途中容易产生伤口,且表面存在较大的气孔。B.subtilis/SA涂膜处理在龙安柚果实表面形成了一层薄层,在阻断外来病原真菌侵染的同时,也形成良好的屏障以抵抗水分蒸发。
a-硬度;b-失重率;c-可溶性固形物;d-可滴定酸
图6 不同涂膜处理对龙安柚采后贮藏期间品质的影响
Fig.6 Effect of different coating treatments on the quality of Long’an pomelo during post harvest storage
由图6-c可知,不同处理组和空白对照组的可溶性固形物含量都呈先增后减的波动式下降趋势。在第30天,各处理组可溶性固形物的含量达到了贮藏期间的最高值。这可能是由于龙安柚的采后后熟。龙安柚在采摘后的一段时间内仍保持一定的新陈代谢强度,使得其中各种代谢酶逐步分解内部的多糖,生成可溶性糖[22]。同时由于呼吸作用消耗的糖分少于积累的糖分,因此总体上呈现出可溶性糖增多的情况,此后由于龙安柚内部的营养物质受到自身代谢及外界环境影响而大量减少,可溶性固形物含量整体逐渐下降。从第30天到第90天,4个处理组的可溶性固形物含量均出现了不同程度的下降,其中质量分数为2.0%的SA涂膜处理组由(12.60±0.24)%下降到(10.20±0.52)%;B.subtilis菌悬液处理组由(11.98±0.21)%下降到(8.57±0.53)%;空白对照组由(11.82±0.12)%下降到(8.14±0.42)%,下降幅度最大;B.subtilis/SA涂膜处理组由(12.87±0.23)%下降到(10.62±0.53)%,下降幅度最小。说明SA在龙安柚表面形成阻隔,同时涂层中的B.subtilis抑制龙安柚外表上的病原真菌活性,对果皮起到了良好的保护作用。
在果蔬贮藏过程中,有机酸作为呼吸代谢的重要底物,参与细胞生化反应并提供关键中间代谢产物。如图6-d所示,空白对照组和处理组的可滴定酸含量整体都呈下降趋势,但SA处理组和B.subtilis/SA涂膜处理组在贮藏的90 d内,可滴定酸含量显著高于B.subtilis处理组和空白对照组。B.subtilis处理组可滴定酸含量由(0.91±0.01) mg/g下降到(0.42±0.02) mg/g,空白对照组的可滴定酸含量从(0.96±0.05) mg/g下降到(0.37±0.08) mg/g,下降最多。SA处理组可滴定酸含量由(0.91±0.03) mg/g下降到(0.7±0.02) mg/g,B.subtilis/SA涂膜处理组的可滴定酸含量从(0.93±0.06) mg/g下降到(0.76±0.05) mg/g,下降最少。结果表明B.subtilis/SA涂膜处理和SA涂膜处理相较于空白对照组均有效减缓了果实中可滴定酸含量的下降。由于SA涂层对呼吸气体具有良好的阻隔能力,可以在一定程度上抑制可滴定酸含量的降低。
2.3.4 不同处理下龙安柚果肉中类黄酮、丙二醛、番茄红素和木质素的变化
类黄酮化合物因其显著的自由基清除能力和抗氧化特性,在果蔬采后贮藏过程中展现出重要的保护效应。如图7-a所示,实验以龙安柚果皮样品中类黄酮吸光度来直接表征类黄酮的变化趋势。在贮藏期内不同处理组果肉中类黄酮的含量都呈现出了逐渐下降的趋势,并且在贮藏前30 d内,不同处理组间差异不显著(P>0.05),直到贮藏45 d时,B.subtilis/SA涂膜处理组的类黄酮含量(3.96±0.11) OD325/g FW高于空白对照组、SA处理组和B.subtilis处理组。随着贮藏时间的延长,各个处理组与空白对照组的差异越来越显著(P<0.05),在贮藏第90天时,B.subtilis/SA涂膜处理组的类黄酮含量为(3.07±0.16) OD325/g FW,是空白对照组的1.87倍。
a-类黄酮;b-丙二醛;c-番茄红素;d-木质素
图7 不同涂膜处理对龙安柚采后贮藏期间类黄酮、丙二醛、番茄红素和木质素的影响
Fig.7 Effect of different coating treatments on flavonoids, malondialdehyde, lycopene and lignin during post harvest storage of Long’an pomelo
果蔬采后衰老进程与活性氧代谢引发的膜脂过氧化反应存在密切关联。丙二醛含量累积可直接反映果实衰老程度。从图7-b可看出,各处理组果皮组织中丙二醛含量在贮藏期间均呈现上升趋势,但不同处理组间存在显著差异(P<0.05)。空白对照组在贮藏45 d后丙二醛含量急剧上升,增速显著高于其他处理组;而B.subtilis/SA复合涂膜处理组在贮藏后期的丙二醛积累量(21.37±2.48) mmol/g较SA涂膜组(23.87±1.54) mmol/g和B.subtilis处理组(28.44±2.46) mmol/g分别降低10.5%和24.8%。该现象可能与复合涂膜中SA与B.subtilis的协同抗氧化作用有关:一方面,SA涂层通过物理屏障作用减少氧气渗透;另一方面,B.subtilis分泌的次级代谢产物可能增强细胞抗氧化酶活性,从而有效抑制膜脂过氧化反应。值得注意的是,单独B.subtilis处理组在贮藏后期丙二醛含量较高,推测与菌体活性的下降导致抗氧化效能减弱密切相关。研究结果表明,B.subtilis/SA复合涂膜通过调控果实活性氧代谢,显著抑制丙二醛生成,进而延缓龙安柚果实衰老进程。
龙安柚果肉呈红色,主要是由于果肉中富含番茄红素和类胡萝卜素,随着贮藏时间的延长,果肉的颜色会逐渐变浅。由图7-c可知,不同处理组的龙安柚果肉中的番茄红素含量均在贮藏期间逐渐降低,其中空白对照组的番茄红素含量下降幅度最大,从(0.28±0.02) OD502/g FW下降为(0.07±0.01) OD502/g FW。而经过B.subtilis/SA涂膜处理后的龙安柚果肉中的番茄红素下降幅度最小。从(0.28±0.02) OD502/g FW下降到(0.11±0.01) OD502/g FW。说明B.subtilis/SA涂膜处理可减缓果肉中番茄红素的流失,维持果肉颜色鲜艳。
果皮中木质素的合成能够对植物细胞起重要的保护作用,增强植物细胞抵抗病害和逆境的能力,但是果肉中木质素的积累会果肉变硬、颜色变白、风味变淡等不良影响,造成果实食用品质的下降[23]。由图7-d可知,除B. subtilis/SA涂膜处理组外,其余处理组的龙安柚果肉中的木质素含量随贮藏时间的延长呈增加趋势,SA处理组木质素含量增长幅度缓慢,而B.subtilis处理组和空白对照组木质素含量则快速增加,其中空白对照组增幅最大。这可能是由于果实的失重率较高,果肉失去水分之后受到了胁迫,导致了果肉中的木质素含量增高。同时空白对照组较高的失重率使得果肉发生枯水,果肉组织变硬,果肉产生木质化现象[24]。而经过B.subtilis/SA涂膜处理后的龙安柚,果实中的木质素含量变化不大且含量(0.16±0.02) OD502/g FW显著低于空白对照组(0.26±0.02) OD502/g FW,结果表明B.subtilis/SA涂膜处理通过减少木质素的积累以减缓龙安柚果肉的木质化,降低了对龙安柚食用品质的影响。
3 结论
本研究制备了具有良好阻隔性和生物抑菌性的B.subtilis/SA涂层膜,并分析了该涂层膜对龙安柚采后的贮藏保鲜效果。结果表明,质量分数为2.0%的SA为最佳涂层基质,相比于其他涂层,SA具有稳定良好的生物相容性且对B.subtilis形态无明显的影响。制备的B.subtilis/SA涂膜有效降低了水蒸气透过率至(3.22±0.19) g·mm/(m2·d·kPa),增大断裂伸长率至(3.56±0.23)%,具有良好的抑菌性且菌体的掺入对涂层性能不造成影响。B.subtilis/SA涂膜处理能够保持龙安柚较好的采后品质,与单独的SA涂膜处理和B.subtilis菌悬液的处理相比,该涂膜处理组感官评价良好,L*值高且b*值低,说明涂膜处理可以抑制果皮发生酶促反应,减缓果皮变黄的速度。同时,B.subtilis/SA涂膜处理可利用涂层的阻隔性使失重率降低,而硬度、可溶性固形物和可滴定酸积累增多来保证龙安柚的食用品质,还可通过诱导类黄酮、番茄红素等抗氧化性物质积累和丙二醛、木质素的减少来防止果肉组织软化溃烂,提高对龙安柚的保鲜效果。本研究可为龙安柚的采后保鲜技术提供参考,并为拓宽B.subtilis的生物防治范围提供一定的理论依据。
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