基于LC-MS/MS分析发酵型与非发酵型火锅底料中非挥发性代谢物的差异

火锅是中国饮食文化的重要载体,考古发现其雏形可追溯至商周时期的青铜温鼎,该器具兼具锅、热源与就锅而食等现代火锅的核心特征,迄今已有3 000多年的历史[1]。在长期地域化发展过程中,火锅已演变形成多种各具特色的流派,其中川渝火锅最具代表性,其滋味麻辣鲜香,色泽红润油亮,但油而不腻,还能够解郁除湿、促进食欲,受到国内外消费者的广泛青睐。有数据显示,2024年全国火锅市场规模已达6 175亿元,同比增长5.6%,预计2025年突破6 500亿元[2],尽管火锅行业发展态势良好,但仍面临着转型升级的紧迫挑战。

火锅底料作为制作火锅的关键调味品,赋予了火锅独特的风味口感。传统川渝火锅底料以食用油脂及糍粑辣椒酱为主要原料,配以花椒、豆瓣、姜、蒜、香料等,经高温炒制而成,其中油脂及辣椒用量高达半数以上,带来特殊风味的同时也使火锅重辣、重油、重盐,经常食用容易产生刺激人体胃肠道黏膜、消化不良、腹泻等不利影响[3-4]。国内外对此也有相关研究,ZHANG等[5]指出部分火锅底料为追求浓郁的口感会大量使用动物油脂,过量摄入油脂易引发消化不良,进而导致脂肪泻;AGAH等[6]研究了膳食常量营养素摄入与消化不良之间的关系,发现高脂肪摄入会加重肝胆和胰腺负担,增加消化不良风险及餐后饱胀感。为增加鲜香味以提高食欲,火锅底料中加有大量的辣椒、花椒、胡椒等原料,这些食物中含有高浓度的具有刺激性的辣椒素、花椒素等,叶敏等[7]和刘芸等[8]分别对大鼠灌胃辣椒总碱和花椒麻味物质,发现高剂量的辣椒总碱和花椒麻味物质会使得大鼠肠道pH值升高并扰乱菌群平衡,导致肠道黏膜受损。因此,研发健康、安全、对胃肠道友好的火锅底料势在必行。

项目团队以发酵和未发酵的糍粑辣椒酱为主要原料,采用相同的配料与工艺条件制得2种火锅底料,经消费者反馈发现发酵型火锅对胃肠道刺激更温和,但目前尚缺少明确阐释该现象影响机理的相关研究资料。本研究通过LC-MS/MS代谢组学技术分析上述两种火锅底料油相、水相中非挥发性代谢物组成的差异,为“胃肠道友好型”火锅底料的研发提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发酵型糍粑辣椒酱火锅底料,四川漫味龙厨生物科技有限公司自制:将干辣椒煮制、破碎后,添加白酒、生姜、甜瓣子等辅料制作成糍粑辣椒酱,再接种直投式植物乳植杆菌粉,装入发酵坛密封发酵120 d,最后按照发酵型糍粑辣椒酱与牛油质量比1∶1进行高温炒制,制成发酵型火锅底料。

非发酵型糍粑辣椒酱火锅底料,四川漫味龙厨生物科技有限公司自制:采用相同配比但未经发酵的糍粑辣椒酱为基料,以同样的方式制备成非发酵型火锅底料。

直投式植物乳植杆菌(蔬菜发酵剂Ⅰ型,活菌数≥1.0×1010 CFU/g),四川高福记生物科技有限公司;干辣椒、甜瓣子、白酒、生姜等原辅料,市售;牛油,广汉市迈德乐食品有限公司。

2-氯-L-苯丙氨酸(98.0%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲酸铵(99.9%),西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;甲醇(≥99.0%)、乙腈(99.9%),赛默飞世尔科技公司;甲酸(色谱纯),梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。

1.2 仪器与设备

H1850-R冷冻离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;BE-2600混匀仪,海门市其林贝尔仪器制造有限公司;5305真空浓缩仪,艾本德(上海)国际贸易有限公司;0.22 μm PTFE滤膜,天津市津腾实验设备有限公司;Vanquish液相色谱仪、Q Exactive Focus质谱仪,赛默飞世尔科技公司;ACQUITY UPLC®HSS T3(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm)色谱柱,沃特世科技(上海)有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集及处理

将发酵型和非发酵型火锅底料分别与清水按质量比1∶1熬煮15 min,封上保鲜膜后置于4 ℃下冷却20 min至油层凝固,再分别取上层油相与下层水相的样品装于50 mL离心管中,置于-80 ℃冷冻备用,每种样品各制备3份。由于各代谢物在油水两相中溶解度不同、油水相具有本质区别等,后续实验及分析均基于发酵型火锅底料油相(YX-F)与非发酵型火锅底料油相(YX)、发酵型火锅底料水相(SX-F)与非发酵型火锅底料水相(SX)进行对比。

1.3.2 非挥发性代谢物的测定

参考DEMURTAS等[9]的方法并适当修改,将样品低温解冻并涡旋1 min,使其混合均匀,取适量样品于2 mL离心管中,加入400 μL甲醇溶液涡旋1 min,后于4 ℃下12 000 r/min离心10 min,取上清液浓缩干燥,再准确加入150 μL用80%(体积分数,下同)甲醇水配制的2-氯-L-苯丙氨酸溶液复溶,取上清液过0.22 μm滤膜,滤液加入到检测瓶中待测。

色谱条件:色谱柱柱温40 ℃,流速0.3 mL/min,进样量2 μL。正离子模式下流动相为0.1%甲酸乙腈(B2)和0.1%甲酸水(A2);梯度洗脱程序为0～1 min(10% B2),1～5 min(10%～98% B2),5～6.5 min(98% B2),6.5～6.6 min(98%～10% B2),6.6～8 min(10% B2)。负离子模式下流动相为乙腈(B3)和5 mmol/L甲酸铵水(A3);梯度洗脱程序与正离子模式一致,仅替换流动相。

质谱条件:采用电喷雾离子源(electrospray ionization,ESI),正负离子喷雾电压分别为3.50 kV和-2.50 kV,鞘气40 arb,辅助气10 arb,毛细管温度325 ℃;一级全扫描分辨率70 000,扫描范围m/z 100～1 000;用HCD进行二级裂解,碰撞能量30 eV,二级分辨率17 500,采集信号前三离子进行碎裂,动态排除冗余MS/MS信息。

1.3.3 定性定量方法

对原始数据进行峰检测、峰过滤、峰对齐处理,得到物质定量列表,结合MS/MS模式得到的碎片信息,在HMDB、KEGG、massbank、LipidMaps、mzclound等公共数据库及自建标准品数据库进行对照查找。采用总峰面积归一化进行数据校正,以消除系统误差。

1.4 数据分析

各样品重复3次平行试验,基于测定所得物质的相对质量进行数据分析,均采用Excel记录结果。运用Proteowizard软件库和R语言对原始数据进行预处理;基于独立样本t检验,利用SPSS Statistics 27对各对比组数据进行显著性分析;使用Origin 2024、SIMCA 14.1、MetaboAnalyst 6.0等软件对数据进行可视化处理、多元统计分析和其他相关绘图。

2 结果与分析

2.1 发酵与非发酵型火锅底料代谢轮廓差异解析

为了深入、客观地探究发酵型火锅底料和非发酵型火锅底料在消费者实际食用时的非挥发性代谢物差异情况,基于LC-MS/MS技术对2种火锅底料熬煮后的油水两相分别进行了代谢组学分析。4种样品经过一级质谱检测,在正、负离子模式下均获得了稳定的离子信号,筛选信号强度较高的前体离子进行二级质谱碎裂以获得离子碎片,将所得到离子碎片的质荷比(m/z)、保留时间、碎片离子谱图等信息在各数据库中进一步匹配注释,最终获得具有准确信息的代谢物共1 162种。其中包括核苷酸及其衍生物16种、维生素及其衍生物27种、外源性化合物31种、生物碱类50种、甾体及其衍生物51种、酯类63种、碳水化合物及其衍生物75种、多酚及黄酮类84种、氨基酸、肽及其衍生物115种、萜类及其衍生物123种、脂质及其衍生物137种、有机酸及其衍生物171种和其他化合物219种(图1)。

由表1可知,4组样品的各类非挥发性代谢物的相对百分含量存在差异。油相对比组(YX-F vs YX)中,脂质及其衍生物,氨基酸、肽及其衍生物,核苷酸及其衍生物和维生素及其衍生物等4个类别的化合物在YX-F中的相对含量有所减少,其余类别均有增加,其中脂质及其衍生物和其他类化合物变化显著(P<0.05),甾体及其衍生物和多酚及黄酮类变化非常显著(P<0.001)。水相对比组(SX-F vs SX)中,生物碱类,酯类,碳水化合物及其衍生物,维生素及其衍生物和氨基酸、肽及其衍生物等5个类别的化合物在SX-F中的相对含量都有所提升,其余类别化合物的相对含量均有所下降,其中脂质及其衍生物,有机酸及其衍生物,甾体及其衍生物和外源性化合物的相对含量变化显著(P<0.05),萜类及其衍生物,氨基酸、肽及其衍生物,碳水化合物及其衍生物和核苷酸及其衍生物的变化极显著(P<0.01)。油水相里脂质及其衍生物在发酵后样品中总体上的显著减少,证明糍粑辣椒酱原料发酵产生的代谢物在火锅底料炒制过程中可能和牛油等发生反应,从而降低产品中脂质含量。

YX-F vs YX和SX-F vs SX中同一类代谢物的相对百分含量相差较大,且增减情况出现了一致或相反的趋势。例如2个对比组中的脂质及其衍生物都在发酵后样品中显著减少,水相中脂质的相对含量明显远少于油相,而氨基酸、肽及其衍生物在2个对比组中含量变化相反,且水相中的相对含量远高于油相,说明同类代谢物中存在一些化合物在不同介质中的溶解度、稳定性等特性具有较大差异,故需分别对比分析。

由于代谢组学数据具有多维且某些变量间高度相关的特点,传统的单变量分析无法快速准确地挖掘出潜在信息,因此对2个对比组分别进行多元统计分析。如图2-a、图2-d所示,样本整体表现为组内聚集和组间离散,YX-F vs YX中主成分1(PC1)得分值为34.8%,主成分2(PC2)得分值为21.6%,两者累积得分56.4%;SX-F vs SX中PC1得分值为40%,PC2得分值为23.3%,累积得分63.3%;表明无论是油相还是水相,前2个主成分都足够反映样本间的主要差异,发酵型底料和非发酵型底料的代谢轮廓均存在明显区别,且主要表现在PC1上。YX-F vs YX的OPLS-DA模型参数为R2X=0.542,R2Y=1,Q2=0.871(图2-b),SX-F vs SX的OPLS-DA模型参数为R2X=0.592,R2Y=1,Q2=0.927(图2-e),说明该模型的解释及预测能力较强,进一步证明2个对比组中各样本代谢产物之间差异显著。图2-c、图2-f分别为YX-F vs YX和SX-F vs SX基于200次检验的置换检验结果,其所有Q2点均低于最右侧原始的Q2点,表明2个对比组的OPLS-DA模型是较为可靠的。

2.2 关键差异代谢物聚类分析

2.2.1 YX-F vs YX差异代谢物分析

基于YX-F vs YX的OPLS-DA模型,为尽可能降低噪音影响,筛选数据中满足变量重要性投影(variable importance in projection,VIP)>1、检验P<0.05和倍性变化(fold change,FC)>2或FC<0.5的化合物作为差异代谢物。YX-F和YX中共筛选出124种关键性差异代谢物,包括4种核苷酸及其衍生物,7种外源性化合物,13种多酚及黄酮类,19种有机酸及其衍生物,7种氨基酸、肽及其衍生物,4种生物碱类,8种甾体及其衍生物,10种碳水化合物及其衍生物,1种维生素及其衍生物,14种脂质及其衍生物,14种萜类及其衍生物,6种酯类和17种其他类化合物。

为了更直观地展示2组样品中代谢物的差异,通过聚类热图对筛选出的124种关键差异化合物的含量进行可视化,其中颜色越红代表化合物含量越高,越蓝代表含量越低。如电子版增强出版附图1-a(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044311)所示,124种关键差异代谢物明显被分为2个聚类,YX-F相较于YX有70种上调代谢物、54种下调代谢物,含量差异较大的物质主要涉及脂质及其衍生物、甾体及其衍生物、碳水化合物及其衍生物、有机酸及其衍生物和生物碱类等化合物。在上调代谢物中,YX-F里含量较高且发酵前后变化较大的物质主要是素Neogrifolin(新奇果菌素)、19(S)-HETE、15-HETE、酵母甾酮、左旋海松酸、2-异丙基苹果酸、3-苯乳酸、琥珀酸和染料木素等;在下调代谢物中,YX里含量较高且发酵前后变化较大的物质主要是22-羟基二十二烷酸、D-阿拉伯糖、高异柠檬酸和胡椒碱等。

2.2.2 SX-F vs SX差异代谢物分析

以相同的标准从SX-F vs SX中筛选出202种关键性差异代谢物,包含6种核苷酸及其衍生物,6种外源性化合物,14种多酚及黄酮类,29种有机酸及其衍生物,16种氨基酸、肽及其衍生物,9种生物碱类,16种甾体及其衍生物,15种碳水化合物及其衍生物,5种维生素及其衍生物,22种脂质及其衍生物,26种萜类及其衍生物,12种酯类和26种其他类化合物。

对202种差异代谢物进行聚类分析(附图1-b),同样被分为2个聚类,SX-F相较于SX有85种上调代谢物、117种下调代谢物,含量差异较大的物质主要包含在碳水化合物及其衍生物,有机酸及其衍生物和氨基酸、肽及其衍生物等化合物里。上调代谢物中,在SX-F中含量较高且发酵前后变化较大的物质主要有山梨糖醇、脱氧尿苷、3-(4-羟基苯)乳酸、半乳糖醇、3-苯乳酸、羟基异己酸和L-酪氨酸等;下调代谢物中,在SX中含量较高且发酵前后变化较大的物质主要有(1R, 2R)-异柠檬酸、半乳糖、尿苷、DL-苹果酸以及二氢辣椒素等。WANG等[10]基于UHPLC-MS/MS检测发现糍粑辣椒发酵后柠檬酸、苹果酸和辣椒素等代谢物的含量较发酵前更低,乳酸、花生四烯酸衍生物等物质含量升高,这与本研究中由发酵前后糍粑辣椒酱制备的火锅底料非挥发性差异代谢物变化情况具有较高相似性。

2.3 关键差异代谢物KEGG通路富集分析

2.3.1 YX-F vs YX代谢通路分析

为探究发酵前后火锅底料中差异代谢物对人体胃肠道的刺激作用,进一步对筛选出的差异代谢物进行代谢通路分析,以揭示其潜在的生物学功能及调控机制。采用MetaboAnalyst 6.0对油相中的124种关键差异代谢物进行代谢通路富集分析,富集方法基于超几何分布检验,拓扑分析采用中介中心性,结果见图3-a。图中每一个气泡代表一个代谢途径,气泡越大表示信号通路影响(pathway impact)越大,颜色越深表示该途径的富集程度越显著(-lg P值越大)。YX-F vs YX共注释到15条代谢通路,主要通路有3条,分别是花生四烯酸代谢、半乳糖代谢和α-亚麻酸代谢。表明糍粑辣椒酱原料的发酵与否对火锅底料产品的代谢网络具有显著影响,能够调控火锅在实际食用时油脂里的脂质及其衍生物[19(S)-HETE、15-HETE、8(S)-HPETE、白三烯A4、前列腺素C2、脂氧素B4、α-亚麻酸、茉莉酸]、碳水化合物及其衍生物(半乳糖甘油、半乳糖醇)等代谢物的含量。

2.3.2 SX-F vs SX代谢通路分析

对SX-F vs SX的202种关键差异代谢物进行代谢通路富集分析,如图3-b所示,共富集到33条代谢途径,主要涉及途径有12条,分别是半乳糖代谢,三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环,苯丙氨酸代谢,丙酮酸代谢,嘧啶代谢,萜类主链生物合成,酪氨酸代谢,花生四烯酸代谢,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,类固醇激素生物合成,组氨酸代谢以及戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化。表明糍粑辣椒酱原料的发酵与否同样可以调控火锅在实际食用时水相里的相关代谢物含量,例如碳水化合物及其衍生物(半乳糖甘油、半乳糖、山梨糖醇、半乳糖醇、蔗糖、木糖醇)、有机酸及其衍生物(DL-苹果酸、琥珀酸、富马酸、乙酰磷酸)、核苷酸及其衍生物(尿苷、脱氧尿苷、胸苷)、甾体及其衍生物(孕酮、四氢可的松、雄酮、雌酮)、脂质及其衍生物[前列腺素G2、白三烯A4、8(S)-HPETE]、萜类及其衍生物[(R)-5-二磷酸甲羟戊酸、香叶基焦磷酸]和氨基酸、肽及其衍生物(组胺、L-酪氨酸、去甲肾上腺素)等。

本研究采用添加了甜瓣子的糍粑辣椒酱,其发酵体系类似于以蚕豆和辣椒为主的郫县豆瓣,LI等[11]对郫县豆瓣发酵前后的非挥发性差异物进行代谢通路分析,同样富集到半乳糖代谢、苯丙氨酸代谢与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成等通路。这些通路代谢物可能通过影响肠道菌群、肠道屏障、炎症反应和神经调节等多重机制,共同作用于胃肠道,例如半乳糖代谢的核心产物是益生元和功能性糖醇,可以促进肠道益生菌增殖,苯丙氨酸代谢产生的苯乳酸及其衍生物具有抗菌抗炎等活性,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸是生物活性物质前体,能够合成神经递质参与胃肠道调节[12-16]。结合附图1、图3对比,发现水相中非挥发性差异代谢物的数量、含量以及富集到的代谢通路数量均多于油相,说明糍粑辣椒酱原料发酵后产生了有机酸、氨基酸、小分子糖类等高度水溶性代谢物,使得火锅底料产品中代谢物的水溶性总体上也增强[10-12],这可能导致食用熬煮时火锅底料中的非挥发性成分更易溶于汤液中。

2.4 影响胃肠道的关键差异代谢物功能属性分析

为进一步对比研究发酵与非发酵型火锅底料在实际食用场景下对人体胃肠道的影响差异,现结合附图1中的关键性非挥发差异成分和图3的代谢通路富集信息,系统排除与辣椒发酵关联度较低或外源性的化合物,聚焦与人体胃肠道调控相关的化合物并进行归类分析。

2.4.1 有机酸及其衍生物

在4组样品中鉴定到可能来自于辣椒发酵且对人体胃肠道具有直接或间接影响的有机酸类差异代谢物主要有琥珀酸、3-苯乳酸、3-(4-羟基苯)乳酸、2-异丙基苹果酸、羟基异己酸、高异柠檬酸、乙酰磷酸、DL-苹果酸、富马酸和(1R, 2R)-异柠檬酸,其中琥珀酸、3-苯乳酸、3-(4-羟基苯)乳酸、2-异丙基苹果酸和羟基异己酸为油水相均具有的差异物,高异柠檬酸为YX-F vs YX的差异代谢物,其余为SX-F vs SX的差异物(图4)。

根据图4-a～图4-j可知,油水相中的琥珀酸、3-苯乳酸、3-(4-羟基苯)乳酸、2-异丙基苹果酸和羟基异己酸在发酵后均出现上调,YX-F中各物质含量分别是YX的4.85、8.8、17.15、7.17和10.4倍,SX-F里各物质含量分别是SX的2.57、29.12、31.52、2.58和9.32倍。琥珀酸作为TCA循环中间体,源于糖酵解增强或还原性TCA通路的激活,其在肠道中可以促进黏液分泌和屏障修复,并激活脂肪组织产热,间接改善肥胖相关代谢紊乱[17];3-苯乳酸和3-(4-羟基苯)乳酸由植物乳植杆菌代谢苯丙氨酸和酪氨酸产生,通过干扰病原体能量代谢(如抑制真菌己糖激酶、诱导线粒体凋亡)和抑制幽门螺杆菌生长来调节肠道内菌群平衡并缓解炎症[12];2-异丙基苹果酸作为缬氨酸、亮氨酸合成中间体,可间接抑制活性氧过度生成,减轻肠道氧化损伤,并促进益生菌增殖[18];羟基异己酸来自亮氨酸降解,能够促进双歧杆菌增殖并提升胰岛素敏感性,改善高脂饮食诱导的肠道菌群失调[19]。这些有机酸类化合物的增加,有助于通过强化胃肠道屏障、平衡菌群、抗炎抗氧化等多种调节方式,协同促进胃肠道健康。

如图4-k所示,高异柠檬酸是赖氨酸生物合成途径中的关键中间体,其在YX-F中含量显著下调至YX的22.76%,这是发酵过程中微生物增殖对赖氨酸的消耗量激增,同时高异柠檬酸被异柠檬酸裂合酶不断降解为琥珀酸和乙醛酸等原因所致[20-21]。高异柠檬酸的分子结构与柠檬酸类似,含量下降可能改变食品的酸负荷和轻微提高肠道内pH值,从而影响蛋白质消化以及增加肠道感染风险,但其分解代谢产生的琥珀酸、赖氨酸等物质能够促进肠道对蛋白质的消化吸收和维持肠道屏障完整性,总体上看因高异柠檬酸含量下降可能造成的负面影响,可以被其分解代谢物的积极作用所平衡。

SX-F vs SX的主要上调差异物是乙酰磷酸,在SX-F中的含量是SX中的5.55倍(图4-l);下调代谢物为DL-苹果酸、富马酸和(1R,2R)-异柠檬酸,在SX-F中的含量分别占SX的42.28%、49.42%和18.41%(图4-m～图4-o)。乙酰磷酸参与丙酮酸代谢途径,能够在肠道内快速水解成乙酸,降低局部pH值以抑制病原菌(如大肠杆菌)并促进益生菌定植,其含量上调有利于摄入后维护肠道稳定。DL-苹果酸的减少可能是其中的L-苹果酸脱羧转变为L-乳酸,在降低了肠易激风险的同时使得产品口感更柔和;富马酸具有调节胃酸分泌帮助消化的功能,其下调可能是由于酶促反应或在制备火锅底料的过程中分解或转变成其他物质;(1R,2R)-异柠檬酸能够参与TCA循环,其代谢过程中伴随NADPH产生,有助于增强产品的抗氧化能力。同时,一些有机酸类代谢物会在炒制底料的加热环境下与醇类、脂质类化合物发生酯化、水解和热分解等反应,这也是部分有机酸下调和发酵型火锅底料整体脂质类化合物显著减少的原因之一。

2.4.2 碳水化合物及其衍生物

在4组样品中鉴定到可能来自于辣椒发酵且对人体胃肠道具有直接或间接影响的碳水化合物类差异代谢物主要有半乳糖甘油、半乳糖醇、蔗糖、半乳糖和山梨糖醇。其中半乳糖甘油和半乳糖醇为油水相均具有的差异物,其余为SX-F vs SX的差异物(图5)。

由图5-a～图5-d可知,半乳糖甘油和半乳糖醇在发酵后的油水相中均呈现上调现象,YX-F中的半乳糖甘油和半乳糖醇的含量是YX中的5.39倍和14.48倍,在SX-F中是SX的5.53倍和28.35倍,图3也显示半乳糖代谢是较为主要的代谢通路。半乳糖代谢是乳糖在β-半乳糖苷酶的作用下水解形成半乳糖和葡萄糖,半乳糖经Leloir途径进一步代谢形成肌醇、山梨糖醇,而葡萄糖则进入糖酵解途径后参与TCA循环,同时半乳糖也会在β-半乳糖苷酶催化下与甘油形成半乳糖甘油或在酵母作用下形成半乳糖醇[13-14]。半乳糖甘油是一种甘油糖脂,具有良好的抑菌效果和抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗病毒等多种生物活性;半乳糖醇作为一种低热量甜味剂,被认为对胃肠道有良好的耐受性,不易引起腹胀、腹泻等症状,还具有增加大肠内有益菌数量、改善肠道菌群结构等调节胃肠道功能的特性[14-15]。

水相差异物中,SX-F的蔗糖和半乳糖含量在发酵后下降至SX的31.63%和20.75%,山梨糖醇含量上升至SX的9.17倍,与各代谢通路中其他相关产物变化趋势吻合(图5-e～图5-g)。半乳糖本身作为一种益生元有助于肠道益生菌生长,但摄入过量可能会导致半乳糖血症或乳制品过敏患者出现消化不良、腹泻、胀气等症状,其含量的下降与山梨糖醇、半乳糖醇等的增加相对应,同时也减少了可能因食用过多造成的副作用[22-23];半乳糖在发酵时优先通过糖酵解被乳酸菌利用产生有机酸,蔗糖作为碳源被微生物水解成葡萄糖和果糖,同样驱动有机酸生成,两者含量的减少意味着有机酸及其衍生物的增加以及pH值的降低,既减少产品被污染的可能,也能够中和辣椒带来的辣味。天然甜味剂山梨糖醇的适当增加,有助于降低因血糖升高引发疾病的风险,其高纤维的特性能够在增加饱腹感的同时起到润肠通便的效果,从而改善便秘、缓解腹胀[24]。

2.4.3 其他相关差异代谢物

在4组样品中鉴定到可能来自于辣椒发酵且对人体胃肠道具有直接或间接影响的其他相关差异代谢物主要染料木素、胡椒碱、新奇果菌素、尿苷、二氢辣椒素和L-酪氨酸,其中染料木素和胡椒碱是油水相均存在的差异物,新奇果菌素是YX-F vs YX中的差异物,尿苷、二氢辣椒素和L-酪氨酸是SX-F vs SX的(图6)。

YX-F与SX-F中的染料木素含量分别增至YX和SX的9.26倍和4.82倍(图6-a、图6-b),而胡椒碱含量则分别降至0.18%和1.89%(图6-c、图6-d)。染料木素是一种广泛存在于豆科植物中的天然异黄酮类多酚化合物,糍粑辣椒酱中添加的甜瓣子(蚕豆接种米曲霉等菌种制曲、发酵而成)为其存在提供了基础,微生物发酵会释放蚕豆中的染料木素和利用生物酶水解染料木苷的糖基生成染料木素,致使其在发酵样品中的含量上调,其可以通过调节肠道菌群、促进短链脂肪酸生成、抑制炎症通路等来改善肠道屏障功能和减轻肠道炎症[25-26]。胡椒碱并非糍粑辣椒酱自身或发酵过程中产生,而是炒制时添加的香辛料带入,其含量的下降可能是与发酵代谢物(如有机酸等)发生了酸碱中和反应,在增强风味的同时也降低了胡椒碱对胃肠道黏膜的刺激性。

如图6-e所示,YX-F中新奇果菌素的含量上调为YX的58倍,其主要在真菌(地花菌、多孔菌)中被发现,具有融合蛋白抑制人结肠癌细胞中KRAS表达的功能。本研究中新奇果菌素含量的大幅增加可能是原料发酵时混入了含有该物质的真菌,或是一些代谢物在发酵和炒制过程中发生转变,具体原因还需进一步验证[27-28]。

根据图6-f～图6-h可知,SX-F中的尿苷和二氢辣椒素含量下调为SX的18.88%和46.28%,L-酪氨酸的含量上升至SX的2.08倍。尿苷的减少可能源于其在发酵时被微生物作为碳氮源分解为尿嘧啶和核糖-1-磷酸,分解生成的核糖可被肠道菌群发酵为丁酸等短链脂肪酸,间接增强肠上皮屏障功能、促进肠道电解质平衡等[29]。适当摄入辣椒素类物质可缓解消化不良并调节肠道菌群,但传统火锅中过量辣椒带来的高浓度辣椒素会破坏胃肠黏膜屏障,诱发炎症反应及腹泻,从而抵消其潜在益处,二氢辣椒素的下调有助于减弱这种负面影响并产生积极作用[30-31]。实际上,油水相中的辣椒素及二氢辣椒素含量均有所下降,其中水相的二氢辣椒素变化最为显著,说明发酵过程中微生物能够有效降解辣椒素类物质以使得辣味更柔和。L-酪氨酸作为一种调节情绪和刺激神经系统的条件必需氨基酸,由苯丙氨酸羟化而来,摄入后能够帮助调节食欲、痛感和身体对压力的反应,故L-酪氨酸含量的增加也能够间接改善消化不良等症状[16]。综上,糍粑辣椒原料发酵显著改变了火锅底料产品中关键功能性代谢物的组成与含量,能够在降低传统火锅刺激性和消化负担的同时,协同增强胃肠道屏障功能、促进菌群平衡及优化免疫调节。

3 结论

本研究为探讨发酵型火锅对胃肠道更友好的原因,基于LC-MS/MS代谢组学检测实际食用场景下发酵型(YX-F、SX-F)和非发酵型(YX、SX)火锅底料的非挥发性代谢物。4组样品共检出1 162种物质,涵盖16种核苷酸类、27种维生素类、31种外源物、50种生物碱类、51种甾体类、63种酯类、75种碳水化合物类、84种多酚及黄酮类、115种氨基酸类、123种萜类、137种脂质类、171种有机酸类和219种其他化合物,且均能通过多元统计分析有效区分。YX-F vs YX中脂质类占比显著下降(P<0.05),甾体类和多酚及类黄酮上升非常显著(P<0.001);SX-F vs SX中脂质类、有机酸类、甾体类和外源物占比显著下降(P<0.05),萜类与核苷酸类极显著下降(P<0.01),碳水化合物类和氨基酸类极显著上升(P<0.01);整体上看油水相的脂质类均显著减少,说明发酵底料的油脂含量更低、消化负担更轻。YX-F vs YX筛选出124种关键差异代谢物,主要富集在花生四烯酸代谢、半乳糖代谢和α-亚麻酸代谢通路上;SX-F vs SX筛选出202种关键差异代谢物,涉及半乳糖代谢、TCA循环、苯丙氨酸代谢、丙酮酸代谢、嘧啶代谢等12条代谢通路。糍粑辣椒酱原料的发酵重构了微生物代谢网络,显著改善了火锅底料产品对胃肠道健康的影响,其中有机酸(如琥珀酸、3-苯乳酸)与益生性糖类(如半乳糖醇、山梨糖醇)等化合物的上调和刺激性代谢物(如胡椒碱、二氢辣椒素)的下调能够协同增强胃肠道防御并调节代谢稳态。研究证实,由糍粑辣椒酱原料发酵产生的代谢协同效应有助于降低传统火锅饮食引发的黏膜刺激、消化不良和腹泻等风险并共同促进肠道健康,为“胃肠道友好型”火锅底料产品的开发和宣传提供理论支撑。

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