梭菌是一类革兰氏阳性、严格厌氧的芽孢杆菌,在自然界中分布广泛,常见于土壤、水体、粪便以及人类和动物的胃肠道等环境中[1-2]。这类厌氧细菌因其独特的生理特性和代谢能力,在生态系统中扮演重要角色,并与工业生产以及人体健康密切相关。根据生态功能及应用价值,梭菌主要可分为工业梭菌和肠道梭菌两大类。其中,工业梭菌具有比较宽泛的底物利用能力,包括纤维素类生物质[3]、糖类化合物乃至一碳气体(CO/CO2)[4]等,并能天然合成多元化的产物,包括有机酸(如乳酸、乙酸,丁酸,己酸)[5]、有机醇(如乙醇、丁醇、己醇)[6]以及氢气[7]等。而肠道梭菌作为肠道中的优势菌群之一,具备强大的代谢食物源和药物源物质的能力,与人体的营养和健康密切相关。肠道梭菌既包含益生菌也存在致病菌。例如,丁酸梭菌(Clostridium butyricum)是人体肠道中一种有益菌,可以促进膳食纤维消化并产生丁酸和乙酸等有利于肠道免疫调节的短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)[8]。而肠道致病菌——肉毒梭菌(Clostridium botulinum)则可产生肉毒神经毒素(botulinum neurotoxin,BoNTs)导致人体麻痹和呼吸衰竭;产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)可产生多达20种酶或毒素,是导致气性坏疽的主要病原体;艰难梭菌(Clostridium difficile)分泌的毒素A和毒素B则会引发伪膜性结肠炎(pseudomembranous colitis,PMC)[9-11]。
近年来,随着分子遗传操作技术的快速发展,研究者们已经能够在基因水平对梭菌这类难操作的厌氧细菌进行深入研究。在已经开发的适用于梭菌的分子遗传改造技术中,转座子随机突变技术结合高通量筛选可以在全基因组尺度快速发掘和鉴定重要表型相关的功能基因,是确定“基因型-表型”因果关系的有效手段,也是人们系统、深入认识梭菌这类厌氧微生物特殊生理和代谢机制的主要路径。目前,多种类型的转座子(Mu、EZ-Tn5、Tn1545、Mariner和Tn916)已被证明可以在梭菌中发挥作用[12-13],并应用于梭菌的基因功能研究以及代谢工程改造[14-15],显示其重要的应用价值。基于此,本文对目前梭菌中的转座子相关技术开发以及研究进展进行了系统的梳理和总结(表1),并展望了未来发展方向,以期为这类重要微生物的基础和应用研究提供借鉴和参考。
表1 不同转座子在梭菌中的应用
Table 1 Application of different transposons in Clostridium species
转座子类型梭菌菌株转座机制特性用途Himar1(Mariner)C.autoethanogenumC.difficileC.acetobutylicumC.perfringens剪切-粘贴倾向于随机识别并插入AT靶点;转座酶活性较高,适合构建饱和突变体库;不依赖宿主的辅助因子转座,适用范围广构建突变体文库 Tn1545C.acetobutylicumC.cellulolyticum剪切-粘贴属于接合转移元件;具有相对较多的抗性,如卡那霉素、红霉素和四环素抗性等基因整合;构建突变体文库Tn916C.difficileC.perfringensC.acetobutylicum剪切-粘贴属于接合转移元件;拥有独特的滚环复制,来释放ssD-NA;在艰难梭菌中存在插入位点偏好调控基因表达;构建突变体文库EZ-Tn5C.perfringens剪切-粘贴属于复合转座子;由中间的抗性基因和两侧的插入序列(IS)组成;转座频率显著高于原始Tn5转座子;插入染色体时具有极强的随机性;携带大量抗性标记,如新霉素、博来霉素和链霉素构建突变体文库Mu transpositionC.perfringens复制-粘贴转座事件发生后会产生9 bp的重复序列;拥有极高的转座频率;需要宿主因子来参与转座过程构建突变体文库
1 转座子分类及转座机制
转座子(transposable elements, TEs)是一类能够在基因组内改变其位置的可移动遗传元件,其发现源于美国科学家巴巴拉·麦克林托克对玉米遗传变异现象的深入研究。作为基因组进化的重要驱动力,转座子主要通过以下分子机制影响宿主的生物学功能:1)作为自主性遗传单元,可携带功能性基因进行水平转移;2)通过插入或缺失突变直接介导基因变异;3)通过影响调控元件(如启动子、增强子)参与基因表达网络的动态调控[16];4)通过改变局部染色质状态影响三维基因组结构。基于这些多维度的调控功能及其广泛分布,转座子被认为是自然界中现存最丰富的功能性序列元件之一。
转座子通常由转座酶和转座序列2部分组成[17]。根据编码序列的特点,转座子可以被分成2种类型:自主活性和非自主活性转座子。自主活性转座子自身可以编码转座酶,因此能够独立完成转座过程;而非自主活性转座子缺乏编码转座酶的能力,所以不能独立完成转座过程,它们需要依赖同一家族中的自主活性转座子提供转座酶来完成转座。此外,转座子还可以根据转座模式的不同被分为2类,即逆转录转座子和DNA转座子。逆转录转座子又被称为反转座子,它们通过DNA转录为RNA后,再经逆转录成为cDNA并插入到宿主基因组上[18];而DNA转座子自身可编码转座酶,进而通过“剪切-粘贴”或“滚环复制”(helitrons转座子)方式实现转座[19]。根据现有研究,细菌中的转座子通常属于DNA转座子,主要包括插入序列、复合型转座子、接合转座子和噬菌体来源的Mu转座子。
2 微生物中转座子的主要功能和应用
2.1 转座子介导的基因水平转移
转座子作为一种高效的基因水平转移载体,其功能机制广泛地影响着宿主微生物的基因组可塑性与适应性进化[20](图1)。在细菌中,复合型转座子(如Tn家族)通常携带抗生素抗性基因,可通过质粒接合转移或噬菌体转导实现跨物种传播,从而导致抗生素抗性基因和毒力因子的扩散,引起抗生素耐药菌的蔓延。而在真核微生物中,逆转录转座子通过编码的结构蛋白和多聚酶将自身mRNA包装成病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs),随后通过膜融合机制进入宿主细胞,再经逆转录生成cDNA后整合至新基因组位点,从而实现跨物种基因水平转移。这种类病毒转座模式已被证实是真核微生物突破有性生殖限制的重要进化驱动力。此外,研究者甚至发现陆地植物能够获取内生真菌的转座子衍生序列,进化出调控干旱应激响应的长链非编码(RNA lncRNA),从而揭示了转座子可以实现跨界转移[21]。
图1 微生物中转座子的主要功能和应用
Fig.1 The functions and applications of transposons in microbes
2.2 转座子介导的基因表达调控
转座子在调控微生物基因表达中也发挥重要作用(图1)。通常情况下,转座子可插入基因编码框内或上游的启动子内部来影响基因的表达,进而改变宿主微生物的性状和表型。值得一提的是,转座子在宿主菌染色体上的随机插入也能激活或增强邻近基因的表达。例如,脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)是人类肠道中的一种厌氧病原体,其基因组中含有碳青霉烯酶编码基因cfiA,但并不表达。研究者在一些耐药菌株中发现cfiA基因上游插入了1.3 kb的序列IS1186,而IS1186序列中含有一个外向型启动子,该启动子激活了cfiA的表达,导致碳青霉烯酶表达量显著提高,从而使得突变株产生耐药性[22]。此外,Tf1是裂殖酵母中一种高温诱导型逆转录转座子,其编码基因具有热响应的转录特性。研究发现,Tf1插入到热休克蛋白基因ssa1的启动子上游可显著增强该基因的转录水平,暗示Tf1序列具有类似增强子的功能,可通过提高邻近基因启动子的转录效率来促进其表达[23]。
2.3 转座子介导的染色体上基因整合
在微生物宿主中超量表达特定功能基因或基因簇是构建微生物细胞工厂最主要的手段之一(图1)。由于实验室常用的基于复制型质粒的基因过量表达在遗传稳定性上存在不足,因此研究者在实际的应用中更倾向于将基因或基因簇整合至宿主菌的染色体上实现稳定表达,而转座子在这方面发挥着重要作用。例如,研究人员利用mini-Tn5转座子搭载有机磷农药降解酶基因mpd(编码甲基对硫磷水解酶)和oph(编码对氧磷水解酶)以及mini-Tn7转座子携带β-半乳糖苷酶基因(lacZ)和荧光素酶基因(lux)在多种细菌的染色体上实现整合[24-25]。在乳球菌中,研究人员利用II类内含子(Ll.ltrB,工程化逆转录转座子)携带多个异源基因插入宿主菌的染色体上,从而构建了遗传性状稳定的工程菌[26]。
3 转座子在梭菌中的应用
3.1 Mariner转座子
Mariner转座子是自然界分布最广的自主性DNA转座元件之一,其最初是在毛里求斯果蝇中被发现,后续的研究进一步揭示其广泛存在于脊椎动物、节肢动物及线虫等生物类群中。Mariner转座子的转座机制遵循典型的“剪切-粘贴”模式(图2):转座酶特异性识别两侧的末端反向重复序列,在外侧切割形成黏性末端,随后随机选择二核苷酸作为靶位点进行整合,最终由宿主DNA修复系统完成插入位点修复。Mariner转座子比较突出的一个特点是其转座的发生仅依赖于相应的转座酶,因此适用性比较宽泛,目前已经在大量的微生物中得到应用。此外,Mariner转座子通常在宿主菌染色体上不存在热点插入的问题,因此显示出良好的随机性。
图2 Mariner转座子的工作原理
Fig.2 Operating principles of Mariner transposon
Himar1转座子是Mariner家族的典型成员,但其转座酶活性较低。为提升其转座效率,研究人员基于角蝇的Himar1转座酶序列,筛选出关键功能位点Q131和E137,并经突变后获得了活性显著提高的突变体Himar1C9。基于该突变体的Mariner转座系统后续得到广泛应用。目前,Mariner转座子成为梭菌中应用最广泛的转座工具。
最早报道的应用Mariner转座子进行基因组随机突变的梭菌是肠道致病菌——艰难梭菌。为了解析艰难梭菌的致病机制进而筛选出治疗靶点,研究者利用Mariner转座系统构建了艰难梭菌随机突变体文库。通过对该文库进行筛选发现一个孢子形成/萌发缺陷的单菌落和一个营养缺陷型单菌落,其转座子插入位点分别位于萌发特异性蛋白酶基因cspBA和嘧啶生物合成基因pyrB[27]。此外,研究者同样利用Mariner转座系统构建了一个包含70 000多个独特突变体的艰难梭菌高密度转座子文库,并结合转座子定向插入位点测序技术鉴定了影响艰难梭菌生长的必需基因组,还确定了多个影响孢子形成的关键基因[28]。产气荚膜梭菌是另一种常见的致病性梭菌。该菌缺乏鞭毛,但具有以往被认为仅存在于革兰氏阴性菌中的IV型菌毛。为鉴定与产气荚膜梭菌滑行运动相关的关键基因,研究者利用Mariner转座子构建了突变体文库,结合生化实验筛选出24个滑行能力缺陷的突变株。其中,sagA基因存在2个独立插入位点,功能验证表明sagA基因确实参与滑行运动,其编码一种肽聚糖内肽酶,负责维持细胞形态及首尾连接[29]。
Mariner转座子也被应用于多种工业梭菌中。丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)是一种重要的工业梭菌,可天然合成丙酮、丁醇、乙醇3种重要大宗化学品[30]。为深入了解该菌的生理和代谢特性,研究者利用Mariner转座子构建了突变体库,并结合生长、耐受等表型进行了特定突变株的筛选。例如,中国科学院的研究团队建立了适用于C.acetobutylicum ATCC 824的木糖诱导型Mariner转座子系统,实现了转座子对该菌基因组的高效随机插入,并利用该转座子突变体库筛选出与梭菌产孢相关的功能基因[31]。该研究工作率先证明了Mariner转座子在工业梭菌中的有效性。随后,该团队的研究人员继续通过对突变体库的深入筛查,在C.acetobutylicum ATCC 824中发现了一个新型sRNA(sr8384),并证实其作为多效性调节因子,调控表达可改善细胞生长和溶剂合成[32]。这也是首次在产溶剂梭菌中发现功能性sRNA,为这类重要工业微生物的研究提供了新视角。此外,DELAROUZÉE等[14]则利用转座子突变体库在C.acetobutylicum DSM 792中筛选出了418个生长必需基因。这些研究为后续的菌株遗传改造提供了潜在的分子靶点。
Mariner转座子还被应用于食气梭菌中进行功能基因组学研究。自产醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)是代表性食气梭菌,主要通过伍德-永达尔(Wood-Ljungdahl)途径固定CO2和CO生成乙酰辅酶A,进而合成乙酸、乙醇及2,3-丁二醇等化学品,且目前利用工业尾气(CO/CO2)发酵产乙醇已经实现了工业化[33]。鉴于该菌基因组中约1/3的蛋白编码基因功能未知[15],为挖掘其固碳关键基因以拓宽产物谱及提升产量,研究人员采用转座子插入测序技术进行了功能基因组学研究。他们利用乳糖诱导型启动子调控Mariner转座子系统中的转座酶表达,构建了覆盖C.autoethanogenum全基因组的突变体文库,进而结合高通量测序鉴定出了该菌以CO为唯一碳源和能源生长时的一系列必需基因[15]。
此外,Mariner转座子还可被用于梭菌的代谢工程改造。近期,中国科学院的研究团队利用Mariner转座子在食气永达尔梭菌中实现了在染色体上整合外源DNA片段。他们通过转座子携带3-羟基丁酸合成途径的若干关键基因,将这些途径基因随机插入到永达尔梭菌的染色体上,获得了一个突变菌株文库。随后,通过对大量突变菌株的筛选,获得了能够有效合成新产物——3-羟基丁酸的工程菌株[34]。这一研究不仅有效拓展了Mariner转座子在梭菌中的应用范围,也为自养型食气梭菌的设计和改造提供了有效的分子工具。
3.2 Tn916和Tn1545转座子
Tn916是最初在粪肠球菌(Enterococcus faecalis)中被发现的一种接合转座子。Tn916大小约为18 kb,在其左侧主要包含了4个开放阅读框。其中,int-Tn负责编码整合酶,介导Tn916插入宿主染色体;xis-Tn编码切除酶,促进转座子的切除;traA是促进接合转移的激活因子;而tet基因赋予了宿主四环素的抗性。Tn916能够编码一种松弛酶并以“滚环复制”的方式释放出的一段单链DNA(ssDNA),该单链DNA在宿主细胞中进一步形成双链DNA并识别和插入到染色体上含有AT碱基的位点(图3)。而属于同一家族的转座子Tn1545则来自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae),也是通过“剪切-粘贴”的机制进行转座(图3)。相较于Tn916,Tn1545还额外编码了红霉素/卡那霉素抗性基因,这也使其长度达到了25.3 kb。
图3 Tn916/ Tn1545的工作原理
Fig.3 Operating principles of Tn916/ Tn1545 transposons
Tn916转座子因其广泛的宿主适应性,已被广泛应用于多种微生物的基因组插入突变以及染色体上的大片段DNA整合。Tn916在绝大多数已报道的宿主中呈现多位点插入特性,但有趣的是,其在艰难梭菌中则高度偏好插入att916位点[35]。Tn916在艰难梭菌中的插入位点偏好性使其在艰难梭菌中发挥转座功能时的影响范围较小[36],这就一定程度地限制了其在构建该菌随机突变体文库中的应用。目前,研究人员已利用Tn916将黏附素编码基因Cwp66的反义RNA导入艰难梭菌,抑制了黏附素合成以降低其毒性[37]。Tn916在主要肠道致病菌——产气荚膜梭菌的研究中也得到诸多应用。尽管产气荚膜梭菌是严格厌氧菌,但在有氧环境或低浓度超氧自由基和羟自由基存在的情况下,其营养细胞和静止细胞在生长停滞阶段仍能存活。这主要归因于它应对氧化应激的适应性反应,这种反应可在有氧和厌氧条件下被激活[38-39]。为鉴定参与该反应的基因,研究者通过Tn916插入诱变筛选了13个突变体对多种氧化应激的耐受性或敏感性。在12个敏感突变体中,3个携带独立插入的转座子,且均位于同一调控区——该区域包含与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ydaD和ycdF同源的2个基因(编码一种可能的NADPH脱氢酶)。互补及敲除实验证实,这些基因对产气荚膜梭菌有效抵抗氧化应激至关重要,并可能负责产生维持生长停滞细胞内氧化还原平衡所需的NADPH。此外,其他被Tn916失活的基因也被证明在氧化应激反应中发挥重要作用[39]。
在工业梭菌研究中,菌株生长及产物合成能力是核心关注点。这类梭菌普遍会在孢子形成之前的指数生长末期积累以聚葡糖颗粒为主的储备物质,并且在孢子形成过程中降解,为孢子形成和成熟提供碳源与能量[40-42]。而孢子形成与工业梭菌的溶剂产量存在一定的关联性[43]。为鉴定相关的功能基因,研究者利用Tn916转座子随机突变结合表型筛选获得了不能有效形成聚葡糖颗粒和孢子的突变体,进而定位了转座子在染色体上的插入位点,为后续的分子机制解析提供了借鉴和参考[43]。
作为与Tn916同一家族的成员,Tn1545在梭菌研究中的应用主要集中于工业菌株。丙酮丁醇梭菌易出现退化(丧失溶剂合成与孢子形成能力)[44],为提高其遗传稳定性,研究者利用Tn1545转座系统对该菌进行全基因组随机突变,并成功分离出不易发生退化的突变体A10。解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)作为嗜温纤维素降解菌,可通过分泌纤维小体高效水解纤维素并发酵生产乙醇及其他代谢物。为解析其纤维素水解机制,研究人员采用Tn1545转座子与电转化技术构建重组质粒,实现解纤维梭菌的基因转移[45]。其他研究人员还开发了适用于解纤维梭菌的Tn1545介导的双质粒递送系统,完成了该菌的随机突变文库构建,为鉴定解纤维梭菌的生物质利用关键基因及开发工程菌奠定了技术基础[46]。
3.3 Mu转座子
噬菌体Mu转座子最早在大肠杆菌中被发现,具有极高的转座频率。天然Mu转座子的体内转座过程涉及多个关键组分(图4):MuA转座酶、辅助蛋白(包括宿主编码的DNA结构蛋白HU和IHF,以及噬菌体编码的靶向蛋白MuB)、包含转座酶结合位点的末端反向重复序列(terminal inverted repeats, TIR)和DNA辅因子。MuB是一种AAA+ ATP酶,能非特异性地结合DNA,其活性由DNA和MuA共同激活(图4)。Mu转座子对插入位点存在一定偏好性,并且会在插入位点两侧产生9 bp的靶位点重复序列(target site duplication, TSD)。
图4 Mu转座子的工作原理
Fig.4 Operating principles of Mu transposon
已有研究发现,Tn916转座子易在宿主染色体上发生重复插入,这就增加了基因型-表型关联性鉴定的难度[47-49]。相比之下,Mu转座子在宿主染色体上通常只能实现单拷贝插入,因此更适合构建突变体文库用于功能基因组学的研究。例如,研究者利用Mu转座子已成功构建了产气荚膜梭菌的饱和突变体文库,其插入失活的基因覆盖率达98%,可用于许多重要表型(如毒力)相关基因的筛选和鉴定[13]。然而,Mu转座子系统仍存在一定的不足和局限性,包括插入位点存在热点区域低[13],这也一定程度地限制了它在梭菌中的应用范围。
3.4 Tn5
Tn5是一种复合转座子,最早发现于大肠杆菌中,由一个编码3种抗生素(新霉素、博来霉素和链霉素)的核心序列以及2个反向的IS50序列(IS50L和IS50R)组成。IS50具有2个19 bp长度的末端序列——外末端(OEs)和内末端(IEs),其中OEs是IS50R编码的Tn5转座酶(TnP)的作用位点。当发生转座时,转座酶会与OEs结合形成复合物发挥功能(图5)。
图5 Tn5的工作原理
Fig.5 Operating principles of Tn5 transposon
EZ-Tn5是基于Tn5转座子改造而成的人工转座子。研究发现,与上述Mu系统相比,EZ-Tn5更具优势:1)转座频率提高几十倍[12];2)在染色体上插入的随机性更好[12]。EZ-Tn5已在梭菌中得到较多应用。例如,为探究产气荚膜梭菌的毒力调控机制,研究者首先在EZ-Tn5中插入了红霉素抗性基因erm,使该转座子插入产气荚膜梭菌的染色体后便于用抗生素筛选突变事件。通过对突变菌株的鉴定,研究者发现了一个负责α毒素和溶血素(perfringolysin O,PFO)合成的基因簇。该基因簇编码Agr群体感应系统中AgrB和AgrD的类似蛋白及2个功能未明的假定蛋白[12],为深入认识产气荚膜梭菌的毒力调控机制提供了重要线索。此外,抗生素治疗易诱导病原体耐药性,而噬菌体因其宿主特异性强、可靶向清除目标菌而不破坏天然微生物群落的特点被视为极具潜力的抗生素替代品。为建立适用于产气荚膜梭菌感染的噬菌体治疗策略,研究者从动物粪便中分离到1株能够侵染产气荚膜梭菌的噬菌体CPS1。为进一步明确CPS1的宿主受体,研究者构建了产气荚膜梭菌ATCC 13124的EZ-Tn5随机转座子突变体文库,并筛选获得了抗CPS1的突变菌株。研究者进一步鉴定出该突变菌株中的转座子插入位点,确认了荚膜多糖是CPS1识别的受体[50]。该研究也是首次在产气荚膜梭菌中鉴定噬菌体的受体。
4 总结与展望
近年来,转座子技术在梭菌的基因功能研究以及菌株遗传改造方面得到了广泛应用,显著推动了该微生物的基因功能解析和菌株定向改造进程。作为一种不依赖宿主内源同源重组系统、操作简便且对插入片段大小限制较少的分子遗传操作工具,转座子系统在构建全基因组随机插入突变库、实现基因敲除、以及整合报告基因或异源表达单元等多个方面展现出显著优势。它不仅提高了梭菌的遗传操作效率,还在很大程度上弥补了传统同源重组操作的低效率、CRISPR-Cas编辑工具依赖于原间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)等局限性。
尽管如此,当前的梭菌转座子技术仍存在若干亟待解决的局限性。首先,转座子插入存在明显的位点偏好性,导致基因组覆盖度不均,影响全基因组突变文库的完整性;其次,传统转座子在基因组上的插入无法区分必需基因与非必需基因,限制了其在必需基因功能缺失表型研究中的应用;此外,CRISPR-Mu转座子系统等新型大片段DNA靶向整合技术尚未在梭菌中成功建立。
值得注意的是,上述技术缺陷可通过整合其他分子遗传工具予以一定程度的弥补。例如,CRISPR干扰技术利用核酸酶失活的dCas9蛋白与向导RNA结合,能够靶向抑制特定基因或基因簇的转录,在不完全敲除基因的前提下实现表型抑制,因此可为研究必需基因功能提供有力补充。此外,针对梭菌外源DNA转化效率低从而影响构建大容量转座子突变体文库的潜在不利因素,采用条件性启动子调控的转座酶表达、高通量测序辅助的插入位点定量分析等策略可有效提升转座系统的可控性与全基因组的覆盖度。
综上所述,梭菌的转座子技术虽已取得显著进展,仍存在较大的优化空间与提升潜力。未来研究应致力于改良转座酶活性和偏好性,开发温敏或诱导型调控系统以增强转座系统的可控性,并积极探索转座子技术与CRISPR工具、重组酶系统等工具的协同应用策略。通过这些分子工具的优势互补,有望构建更高效、更全面、更精准的梭菌分子遗传操作体系,从而助力梭菌的基础和应用研究,并推动其在生物制造、能源转化及医疗应用中的进一步发展。
[1] JENSEN R O, SCHULZ F, ROUX S, et al.Phylogenomics and genetic analysis of solvent-producing Clostridium species[J].Scientific Data, 2024, 11:432.
[2] OOTSUCHI H, NAKAJIMA M, HATADA Y.Recovery of Clostridium from soil using Heat Shock enrichment technique and Agar Deeps[J].Journal of Microbiological Methods, 2025, 232:107133.
[3] AHAMED F, SONG H S, HO Y K.Modeling coordinated enzymatic control of saccharification and fermentation by Clostridium thermocellum during consolidated bioprocessing of cellulose[J].Biotechnology and Bioengineering, 2021, 118(5):1898-1912.
[4] BOTO S T, GERGES K, BARDL B, et al.Evaluation of yeast alcohol acetyltransferases for ethyl acetate production in Clostridium ljungdahlii[J].Engineering in Life Sciences, 2025, 25(1):e202400076.
[5] LIU Y Q, ZHANG Z W, JIANG W H, et al.Protein acetylation-mediated cross regulation of acetic acid and ethanol synthesis in the gas-fermenting Clostridium ljungdahlii[J].Journal of Biological Chemistry, 2022, 298(2):101538.
[6] DEVI N B, PAKSHIRAJAN K.Diversifying product portfolio of syngas fermentation in addition to ethanol production by using Clostridium species[J].Bioresource Technology, 2025, 427:132401.
[7] SIM Y B, YANG J S, KIM S M, et al.Effect of bioaugmentation using Clostridium butyricum on the start-up and the performance of continuous biohydrogen production[J].Bioresource Technology, 2022, 366:128181.
[8] CHEN Z H, YU L, LIU J X, et al.Gut microbiota dynamics and fecal SCFAs after colonoscopy:Accelerating microbiome stabilization by Clostridium butyricum[J].Journal of Translational Medicine, 2024, 22(1):222.
[9] CAMARGO A, RAM
REZ J D, KIU R, et al.Unveiling the pathogenic mechanisms of Clostridium perfringens toxins and virulence factors[J].Emerging Microbes &Infections, 2024, 13(1):2341968.
[10] MA W T, WANG L L, TAN X M, et al.A novel RRGW derived peptide is a promising inhibitor of BoNT/A[J].Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 2023, 38(1):2203878.
[11] PERITORE-GALVE F C, SHUPE J A, CAVE R J, et al.Glucosyltransferase-dependent and independent effects of Clostridioides difficile toxins during infection[J].PLoS Pathogens, 2022, 18(2):e1010323.
[12] VIDAL J E, CHEN J M, LI J H, et al.Use of an EZ-Tn5-based random mutagenesis system to identify a novel toxin regulatory locus in Clostridium perfringens strain 13[J].PLoS One, 2009, 4(7):e6232.
[13] LANCKRIET A, TIMBERMONT L, HAPPONEN L J, et al.Generation of single-copy transposon insertions in Clostridium perfringens by electroporation of phage mu DNA transposition complexes[J].Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(9):2638-2642.
[14] DELAROUZÉE A, LOPES FERREIRA N, BAUM C, et al.Gene essentiality in the solventogenic Clostridium acetobutylicum DSM 792[J].Applied and Environmental Microbiology, 2024, 90(7):e00282-e00224.
[15] WOODS C, HUMPHREYS C M, TOMI-ANDRINO C, et al.Required gene set for autotrophic growth of Clostridium autoethanogenum[J].Applied and Environmental Microbiology, 2022, 88(7):e02479-e02421.
[16] ABRAHAM L N, OGGENFUSS U, CROLL D.Population-level transposable element expression dynamics influence trait evolution in a fungal crop pathogen[J].mBio, 2024, 15(3):e02840-e02823.
[17] SANDOVAL-VILLEGAS N, NURIEVA W, AMBERGER M, et al.Contemporary transposon tools:A review and guide through mechanisms and applications of sleeping beauty, piggyBac and Tol2 for genome engineering[J].International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(10):5084.
[18] WARKOCKI Z.An update on post-transcriptional regulation of retrotransposons[J].FEBS Letters, 2023, 597(3):380-406.
[19] FESCHOTTE C, PRITHAM E J.DNA transposons and the evolution of eukaryotic genomes[J].Annual Review of Genetics, 2007, 41:331-368.
[20] TOKUDA M, SHINTANI M.Microbial evolution through horizontal gene transfer by mobile genetic elements[J].Microbial Biotechnology, 2024, 17(1):e14408.
[21] WANG H, XU Z L, ZHANG Z H, et al.Horizontal transposon transfer during plant terrestrialization[J].Journal of Integrative Plant Biology, 2025, 67(1):15-18.
[22] PODGLAJEN I, BREUIL J, COLLATZ E.Insertion of a novel DNA sequence, 1S1186, upstream of the silent carbapenemase gene cfiA, promotes expression of carbapenem resistance in clinical isolates of Bacteroides fragilis[J].Molecular Microbiology, 1994, 12(1):105-114.
[23] FENG G, LEEM Y E, LEVIN H L.Transposon integration enhances expression of stress response genes[J].Nucleic Acids Research, 2013, 41(2):775-789.
[24] LI R, WANG G L, SHEN B, et al.Random transposon vectors pUTTns for the markerless integration of exogenous genes into gram-negative eubacteria chromosomes[J].Journal of Microbiological Methods, 2009, 79(2):220-226.
[25] ROOS K, WERNER E, LOESSNER H.Multicopy integration of mini-Tn7 transposons into selected chromosomal sites of a Salmonella vaccine strain[J].Microbial Biotechnology, 2015, 8(1):177-187.
[26] RAWSTHORNE H, TURNER K N, MILLS D A.Multicopy integration of heterologous genes, using the lactococcal group II intron targeted to bacterial insertion sequences[J].Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(9):6088-6093.
[27] CARTMAN S T, MINTON N P.A mariner-based transposon system for in vivo random mutagenesis of Clostridium difficile[J].Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(4):1103-1109.
[28] DEMBEK M, BARQUIST L, BOINETT C J, et al.High-throughput analysis of gene essentiality and sporulation in Clostridium difficile[J].mBio, 2015, 6(2):e02383-e02314.
[29] LIU H L, BOUILLAUT L, SONENSHEIN A L, et al.Use of a mariner-based transposon mutagenesis system to isolate Clostridium perfringens mutants deficient in gliding motility[J].Journal of Bacteriology, 2013, 195(3):629-636.
[30] OEHLENSCHL
GER K, HENGSBACH J N, VOLKMAR M, et al.From pre-culture to solvent:Current trends in Clostridium acetobutylicum cultivation[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2025, 109(1):47.
[31] ZHANG Y, XU S, CHAI C S, et al.Development of an inducible transposon system for efficient random mutagenesis in Clostridium acetobutylicum[J].FEMS Microbiology Letters, 2016, 363(8):fnw065.
[32] YANG Y P, ZHANG H, LANG N N, et al.The small RNA Sr8384 is a crucial regulator of cell growth in solventogenic clostridia[J].Applied and Environmental Microbiology, 2020, 86(13):e00665-e00620.
[33] WAN S, LAI M C, GAO X Y, et al.Recent progress in engineering Clostridium autoethanogenum to synthesize the biochemicals and biocommodities[J].Synthetic and Systems Biotechnology, 2024, 9(1):19-25.
[34] WU Y W, YE W, LI R, et al.Engineering Clostridium ljungdahlii for efficient 3-hydroxybutyrate production from one-carbon gases[J].Green Synthesis and Catalysis, 2025.DOI:org/10.1016/j.gresc.2025.01.001.
[35] WANG H M, ROBERTS A P, MULLANY P.DNA sequence of the insertional hot spot of Tn916 in the Clostridium difficile genome and discovery of a Tn916-like element in an environmental isolate integrated in the same hot spot[J].FEMS Microbiology Letters, 2000, 192(1):15-20.
[36] MULLANY P, WILKS M, PUCKEY L, et al.Gene cloning in Clostridium difficile using Tn916 as a shuttle conjugative transposon[J].Plasmid, 1994, 31(3):320-323.
[37] ROBERTS A P, HENNEQUIN C, ELMORE M, et al.Development of an integrative vector for the expression of antisense RNA in Clostridium difficile[J].Journal of Microbiological Methods, 2003, 55(3):617-624.
[38] JEAN D, BRIOLAT V, REYSSET G.Oxidative stress response in Clostridium perfringens[J].Microbiology, 2004, 150(Pt 6):1649-1659.
[39] BRIOLAT V, REYSSET G.Identification of the Clostridium perfringens genes involved in the adaptive response to oxidative stress[J].Journal of Bacteriology, 2002, 184(9):2333-2343.
[40] BERG
RE J L, ROUSSEAU M, MERCIER C.An intracellular polysaccharide involved in sporulation of “Clostridium butyricum” I.Cytology, production and preliminary enzymic analysis (author’s transl)[J].Annales de Microbiologie, 1975, 126(3):295-314.
[41] ROBSON R L, ROBSON R M, MORRIS J G.The biosynthesis of granulose by Clostridium pasteurianum[J].The Biochemical Journal, 1974, 144(3):503-511.
[42] STRASDINE G A.The role of intracellular glucan in endogenous fermentation and spore maturation in Clostridium botulinum type E[J].Canadian Journal of Microbiology, 1972, 18(2):211-217.
[43] MATTSSON D M, ROGERS P.Analysis of Tn916-induced mutants of Clostridium acetobutylicum altered in solventogenesis and sporulation[J].Journal of Industrial Microbiology, 1994, 13(4):258-268.
[44] SEO H, CAPECE S H, HILL J D, et al.Butyrate as a growth factor of Clostridium acetobutylicum[J].Metabolic Engineering, 2024, 86:194-207.
[45] JENNERT K C B, TARDIF C, YOUNG D I, et al.Gene transfer to Clostridium cellulolyticum ATCC 35319[J].Microbiology, (Reading)2000, 146 Pt 12:3071-3080.
[46] BLOUZARD J C, VALETTE O, TARDIF C, et al.Random mutagenesis of Clostridium cellulolyticum by using a Tn1545 derivative[J].Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(13):4546-4549.
[47] DINGMAN D W.Functionality of Tn916 in Paenibacillus larvae[J].Archives of Microbiology, 2017, 199(3):487-493.
[48] BEAN E L, MCLELLAN L K, GROSSMAN A D.Activation of the integrative and conjugative element Tn916 causes growth arrest and death of host bacteria[J].PLoS Genetics, 2022, 18(10):e1010467.
[49] BEAN E L, SMITH J L, GROSSMAN A D.Identification of insertion sites for the integrative and conjugative element Tn916 in the Bacillus subtilis chromosome[J].PLoS One, 2025, 20(5):e0318964.
[50] HA E, CHUN J, KIM M, et al.Capsular polysaccharide is a receptor of a Clostridium perfringens bacteriophage CPS1[J].Viruses, 2019, 11(11):1002.