酱油(又称豉油)起源于中国,是一款以大豆(或脱脂大豆)和小麦(或麸皮)为主要原料,经过发酵而成的色、香、味、体俱佳的液体调味品。它具有悠久的历史底蕴、独特的风味和鲜美的口感,深受中国民众的欢迎[1-2]。酱油的具体酿造工艺流程如图1所示,大豆、小麦等原料经过去皮、脱壳、浸泡、蒸煮等处理后,再经过制曲、发酵、淋油等工艺制作而成[3]。其中,制曲是酱油酿造过程中的关键环节,包括单一菌种制曲和混合菌种制曲2种制曲方式,其工艺流程如图2所示。制曲是指在曲料上营造合适的环境,使得米曲霉菌种充分生长繁殖产生胞内酶和胞外酶等各种酶类的过程[4]。胞内酶包括蛋白酶、淀粉酶以及纤维素酶、果胶酶、脂肪酶。其中,蛋白酶是产量最多的酶类,由酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶组成,这3种酶的协同作用是蛋白质转化及风味形成的关键[5]。酱油的制曲工艺直接决定了酶的种类和活力,进而影响酿造原料的分解程度与发酵深度,最终影响酱油的整体品质。随着经济的发展和社会观念的转变,民众对酱油的需求由基本的调味功能逐步转变为追求口味、营养及功能的综合性需求。国产酱油在制曲和发酵工艺中存在的诸多问题,导致其面临产品风味单一、质量不稳定以及营养价值偏低等挑战,严重阻碍了自身的高端化发展[6]。因此,本文以国产酿造酱油的核心环节——制曲工艺为切入点,系统分析了国产酿造酱油制曲工艺优化的3个关键因素:改良米曲霉菌种、混合菌种制曲(包括双菌种制曲和多菌种制曲)以及改善制曲原料。在此基础上,本文揭示了制曲工艺中存在的问题,并提出了相应的优化建议,旨在为国产酿造酱油制曲工艺的研究提供明确方向,同时丰富酿造酱油制曲工艺的理论体系,为酱油生产的实践提供有力参考。
图1 国产酿造酱油的制作工艺流程
Fig.1 Production process of Chinese brew soy sauce
图2 国产酿造酱油的制曲工艺流程
Fig.2 The koji-making process of Chinese brew soy sauce
1 改良米曲霉
1.1 自然选育
米曲霉(Aspergillus oryzae)属于曲霉属菌种,是酱油发酵的起始菌株,米曲霉菌株的发酵性能对酱油最终品质的形成具有决定性作用[7-8]。在传统发酵中,自然培养通常指利用自然环境中的微生物群落(如空气、原料表面的野生菌)进行培养。在古法酿造酱油中,混合后摊晾的蒸煮大豆与面粉是依靠自然落菌形成以米曲霉菌株为主的“酱醅”。尽管自然培养的米曲霉菌群具备多样性优势,但其菌种质量不稳定,且易受季节变换及环境温湿度的影响,导致其可控性较差,进而使得发酵结果呈现出一定的波动性。因此,为了稳定米曲霉的活性并确保发酵质量,必须对菌种进行定期的复壮与选育。鉴于此,筛选高活力米曲霉菌种的自然选育方法,逐步取代了传统的自然培养方式[9-10]。自然选育通过多代自然培养,利用环境压力(如温度、湿度、原料成分等)筛选出适应性更强、发酵性能更优的米曲霉菌株[11]。19世纪60年代,筛选出产酶性能优良的米曲霉AS3.863,其蛋白酶活力高达95.1 U/g[12]。该菌株是米曲霉的最早菌株,如今被广泛应用于酱油酿造行业的沪酿3.042米曲霉就是在该菌株基础上诱变来的。自然选育技术能够有效分离出在野生环境中分泌蛋白酶能力突出、具备抗杂菌特性以及环境耐受力强的米曲霉菌株,因而成为一种经典的育种方式。
1.2 诱变育种
在酱油酿造生产中,自然选育的米曲霉在生产酶活力、生长速度、安全性、抗菌性等方面优势明显,其代表性菌种——米曲霉AS3.863是酿造商品化酱油的常用菌株[13]。然而,随着时间的推移,采用自然选育方法培育的纯种米曲霉菌株所存在的问题也逐渐暴露出来。例如,在自然环境中,米曲霉菌株的自然突变概率较低,且变异方向具有不确定性;此外,其繁殖周期较长,所需工作量大,且状态控制难度较大[10]。因此,采用诱变育种技术处理自然选育的米曲霉菌株,以培育出性状更为优良的菌株,成为该研究领域的新兴趋势。诱变育种是指运用物理或化学的方法,促使米曲霉的遗传特性发生改变,再从改变的米曲霉群体中挑选出满足人们特定需求的米曲霉,将其培养成为新菌种的育种方法[14]。诱变育种包括物理诱变、化学诱变及生物技术诱变。紫外诱变因其操作方便、价格低廉、安全性高以及效果显著等优势,成为最常规且最普遍的物理诱变方法[15]。1976年,上海市粮油工业公司对米曲霉AS3.863进行紫外诱变,经过长期的分离和筛选,培育出沪酿3.042米曲霉[16]。沪酿3.042米曲霉菌株比原菌株蛋白酶活力提高了33%,促进原料蛋白的利用效率从约50%提升至约80%[10],实现了酱油大规模产业化生产,成为商业化酱油制曲的必用菌种。
经过紫外诱变得到的沪酿3.042米曲霉,其性能得到了显著提升,但其酶系不全面且糖化酶、酸性蛋白酶活力低,导致其依旧无法适应酱油发酵后期的高盐和低酸性环境,进而影响原料利用率和酱油风味[17]。因此,众多学者在沪酿3.042米曲霉菌种(或其他米曲霉菌种)基础上,继续利用紫外诱变技术不断进行探索,以期获得性能优良的新菌株。然而,紫外诱变培育的菌株诱发易突变且缺乏定向性,经过长久的诱变后又很难获得具有特定性状及高酶活力的新型菌株。因此,离子注入诱变、常压室温等离子体诱变以及原生质体融合诱变等新型诱变技术,也逐步被应用于提升米曲霉菌株性能的研究领域[18]。新型诱变技术通过编辑遗传信息,改变结构,培养了酶活力更高的米曲霉菌株,实现了改善菌株功能的目的,最终提升了酱油的品质。新型诱变育种技术的优势和劣势明显,如表1所示。结合各种技术的优势而突破限制以培育出性能优秀的新菌株是未来研究的趋势。沪酿3.042米曲霉经过诱变后的菌株性能在各方面均有不同程度的提升,如表2所示。
表1 米曲霉菌株育种方法优劣势对比[10, 19-20]
Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of Aspergillus oryzae strain breeding methods
方法优势劣势自然选育降低杂菌混入,提升曲的品质,缩短制曲周期自发突变几率较低,菌株的性状难以控制,育种周期较长、工作量大紫外诱变设备简便、高效,无次生污染,风险小、诱变随机性大诱变频率高,不易发生回复突变,持续使用易产生耐受性,突破性变异性状难获得常压室温等离子体诱变高突变,操作安全,无污染设备专业度高,突变的方向以及,性质不受控制离子注入诱变诱变几率较高,突变类型丰富,适合定向筛选特定性状设备复杂、专一,成本高,突变具有随机性,需大规模筛选原生质体融合突破生殖隔离,高效重组,定向育种,遗传物质传递更完整技术难度高,融合体再生率低,融合诱导剂存在毒性,遗传稳定性差复合诱变基因变异点增多,有利变异几率大,劳动量减少、诱变时间缩短细胞毒性累积,突变不可预测,技术要求高
表2 米曲霉菌株诱变前后性能对比分析
Table 2 Comparative analysis of the performance of A. oryzae strains before and after mutagenesis
方法诱变前菌种诱变后菌种性能提升参考文献紫外诱变米曲霉RIB40突变株F6酸性蛋白酶活力提高5.6倍[21]米曲霉CICC2066突变株UY-20氨肽酶活力提高1.54倍,中性蛋白酶活力提高7%[22]米曲霉沪酿3.042米曲霉A3-U12蛋白酶活力1 304.67 U/g,糖化酶活力867.19 U/g[23]米曲霉JN1-3米曲霉JN1-3-4淀粉酶活力提高2.69倍,蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶的酶活力不同程度提高[19]常压室温等离子体诱变米曲霉AS3.951突变株ZA189蛋白酶活性从2 568 U/g增至32 102 568 U/g,淀粉酶、谷氨酰胺酶均有不同幅度提升[24]米曲霉沪酿3.042突变体H8中性蛋白酶、碱性蛋白酶和天冬氨酸肽酶活性提升,耐盐碱蛋白基因和天冬氨酸肽酶基因表达量分别增长了约30%和27%[25]米曲霉沪酿3.042突变菌株B-2酸性蛋白酶(117.9 U/g)与中性蛋白酶(407.5 U/g)活性分别增长了54.7%和17.3%[26]米曲霉沪酿3.042菌株H34蛋白酶活力提高145.6%[20]米曲霉沪酿3.042米曲霉D3发酵性能提升,利于酱油形成良好风味[27]离子注入诱变米曲霉沪酿3.042菌株A100-4纤维素酶与蛋白酶活力分别比原始菌株提升了40%和30%[28]米曲霉沪酿3.042突变株A100-8酸性蛋白酶活力达2 834.6U/g,提高了44.1%[29]菌株UV7米曲霉N11曲酸产量提高了30.38%[30]原生质体融合米曲霉沪酿3.042和菌株CICC2339融合体EF113生长速度快且蛋白酶活力高,酶活力高达7 680 U/g[31]黑曲霉和米曲霉融合子F76产酸性蛋白酶活力接近1 500 U/g,提供率高达82.19%,培养条件优化后酶活力提升至1 936 U/g[32]突变体UV-11和UV-76突变体RIII-7果糖基转移酶活力提高2倍;经发酵条件改进后,酶活力提高3.4倍[33]复合诱变米曲霉沪酿3.042突变株A11蛋白酶活力由3 447 U/g增长至3 668 U/g,增长了6.41%[34]米曲霉沪酿3.042FII-41中性蛋白酶活力达7 412 U/g,比原始菌株提高1.76倍[35]曲霉CS3.03突变株P7蛋白酶的干基活力提升了173.92%,酱油酿造的氨态氮含量和全氮利用率明显提升[36]米曲霉沪酿3.042诱变菌株ASQ-1琥珀酸产出提高的294倍[37]
2 混合菌种制曲
米曲霉单一菌种制曲会导致成品酱油在口味、香气和色泽等方面表现不佳,同时还会引起原料利用率低等问题[37]。虽然诱变育种技术显著地提升了沪酿3.042米曲霉的性能,但上述问题并未得到彻底解决。自20世纪80年代起,采用米曲霉与其他菌种共同作用的协同制曲技术逐渐兴起,形成了混合制曲的新工艺。混合菌种制曲提高了原料的利用率,且改善了酱油成品色泽、风味,具有广泛的应用前景[38]。根据制曲混合菌种的数量,混合菌种制曲分为双菌种制曲和多菌种制曲。米曲霉是混合菌种制曲的主要菌种,黑曲霉、红曲霉是常用的辅助菌种。此外,酱油曲霉、木霉、根霉等菌种也被用于混合菌种制曲工艺过程中。
2.1 双菌种混合制曲
2.1.1 米曲霉双菌种制曲
米曲霉双菌种制曲将2种具有互补特性的米曲霉菌株进行合理的配比,使得两者在制曲过程中能够相互协同,共同作用于原料,改善了单一菌种制曲中存在的问题。该方法既保留了传统米曲霉的发酵性能,也提高了酱油的品质。张艳芳[39]研究发现组合双菌种混合制曲缩短了单菌种制曲时间,筛选出优于单菌及AS.3042酶系的组合C1B1、C2B2、C2B3,进一步研究其发酵酱油的质量,发现组合菌种发酵所得酱油的全氮、氨基态氮、还原糖、谷氨酸的含量较AS3.042均得到一定程度的提高。颜喆[40]从用于企业制作酱油的6株米曲霉菌种筛选综合效果较好的3株菌种(C、E、F),对其进行双菌种制曲研究,从酶、还原糖以及氨基态氮等指标综合判断,发现蛋白酶、淀粉酶等酶活性经过米曲霉双菌种混合制曲后得到了显著的提高,最高可提升38%,产生了可观的经济效益。李鹏等[41]以中性蛋白酶和氨肽酶活性为指标得到米曲霉最优组合A6B4(CICC 2339,CICC 2066),发现酱油酿造过程中2株米曲霉菌株叠加制曲使得制曲时间进一步缩短,氨肽酶和中性蛋白酶活力也得到了提升。路怀金等[42]研究米曲霉SWJS-AO-K和SWJS-AO-D的特色酶系对酱油理化指标以及品质的影响,结果表明降解碳水化合物酶类具有优势的米曲霉对发酵酱油的鲜味、甜味物质生成有积极影响。
综上可知,米曲霉双菌种制曲充分利用了米曲霉的酶系特性,高效地对酿造原料进行了分解和转化,既提高原料利用率和酶活性,也提高了酱油的滋味、风味、营养等品质,具有显著的经济效益和市场前景。尽管米曲霉双菌种制曲弥补了单一菌种制曲的缺陷,但也产生了新的问题。罗雯等[43]研究产孢量少的2株AS3.042诱变菌株A2、B2复合发酵制曲(A2∶B2=1∶9,质量比)对酱油品质的影响,发现成曲淀粉酶活力和还原糖含量不如单菌株制曲,推测可能是因为双菌株之间存在相互抑制作用,或者是混合制曲对酶特性产生了影响。为了避免混合制曲中菌株间的相互干扰而影响米曲霉的特性,因此,探寻更适用于混合制曲的菌株将成为未来研究的新趋势。
2.1.2 米曲霉-黑曲霉混合制曲
黑曲霉(Aspergillus niger)以其独特的酶系和代谢产物,为酱油增添丰富的风味层次。将米曲霉和黑曲霉进行混合制曲,不仅可以充分利用米曲霉的产酶优势,还能借助黑曲霉的风味贡献,实现酱油品质的全面提升[44]。其中,黑曲霉AS3.350是混合制曲的常用菌株。李保英[45]采用AS3.042米曲霉与AS3.350黑曲霉混合制曲,发现单一菌种制曲与混合制曲的成曲总蛋白酶活力基本相当,但混合制曲显著改善了糖化酶与酸性蛋白酶的活力。程世杰[46]将米曲霉沪酿3.042诱变菌株GZY01与黑曲霉AS3.350混合制曲,探究酱油的理化性质。结果表明,当两者以4∶1质量比例进行复合制曲发酵时,在30 d的发酵期内,全氮利用率可达82.21%,比米曲霉单菌种制曲发酵高出35%。其中,混合曲的发酵产物中氨基酸态氮的含量达到1.162 g/100 mL,较单菌种提高了7.8%。郑博[47]将米曲霉沪酿3.042的突变株B-2与黑曲霉FND-A47按4∶1质量比例进行接种制曲,并与B-2单菌种制曲进行对比。结果表明,混合曲与米曲霉B-2的蛋白酶在酸性、中性和碱性条件下的活性变化趋势虽呈现一致性,但是在36 h的大曲培养过程中,对比于米曲霉B-2,混合曲的酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的活性分别增加了27.17%、38.72%和27.18%;而在42 h,两者的3种蛋白酶活力则基本相当。HU等[48]也采用米曲霉与黑曲霉混合制曲的方法展开研究,结果显示,混合曲中二肽、不饱和脂肪酸、黄酮类、酚类及吲哚类物质的含量相较于单菌种制曲显著提高。由此可见,米曲霉、黑曲霉混合制曲对提升酱油酶活力作用明显,提升酱油品质效果甚佳,具备很大的发展潜力。随着研究的深入,米曲霉与黑曲霉混合制曲的研究方向从简单的酶活性测定转向深入的机制和通路研究。胡文康[49]则从代谢组学的角度切入,对比高盐稀态酱油多菌种酿造,单菌种米曲霉与混合菌种在制曲和发酵阶段的代谢产物及其代谢途径的变化规律。结果表明,在制曲过程中米曲霉和黑曲霉的混合,明显影响了代谢产物的产生,改变了挥发性风味物质的生成,从而促使酱油的风味发生变化。郑二帅等[50]将米曲霉和黑曲霉进行联合制曲,对比单菌株米曲霉发酵,发现混合大曲的总蛋白酶和消化率分别提升10%、5%。综上所述,从代谢等研究视角切入,为酱油酿造领域开辟了全新的研究路径。
米曲霉与黑曲霉混合制曲,效果显著。然而,黑曲霉并非完全有助于提升酱油的品质。研究表明,在混合菌种制曲过程中加入黑曲霉,可能无法提升酱油的风味,反而生成有害物质,降低酱油的色泽和香气质量。李荔等[51]发现米曲霉与黑曲霉混合制曲时,黑曲霉的黑色孢子会污染环境,而米曲霉与酱油曲霉混合制曲则有效改善污染问题。尽管米曲霉与黑曲霉混合制曲存在一些争议,但两者混合制曲的研究仍具有重要参考意义。未来,随着科技的发展,发酵生产设备的改良(智能调节温度、湿度及时间),减少米曲霉与黑曲霉混合制曲时潜在有害物质生成,是推动混合制曲技术创新的重要方向。此外,揭示二者在共发酵过程中的作用机制,可为优化混合制曲工艺、提升酱油品质提供科学依据。
2.1.3 米曲霉-糖化增香曲混合制曲
糖化增香曲是一种专门用于酱油酿造的复合曲种,包括烟灰红曲霉(Monascus ruber)菌种和紫红曲霉(Monascus purpureus)菌种。该曲种具备较强的糖化力、酯化力及增色能力,凭借其独特的酶系和风味物质,为酱油增添了丰富的香气和口感。米曲霉与糖化增香曲的混合制曲为酱油酿造品质的提升提供了新的可能性,也为传统酿造工艺的创新提供了有力支持。姚继承等[52]采用糖化增香曲与复合制曲技术,成功生产出低盐固态酱油。该研究发现,在制曲过程中使用糖化增香曲时,酱料于30～38 h开始释放香气,此时醇香尤为显著。随着时间的推移,酯香愈发浓郁,产品色泽也变得更加鲜亮。王素珍等[53]研究米曲霉和糖化增香曲混合制曲在低盐浇淋酱油中的作用,结果表明糖化增香曲及红曲粉能显著提高酱油的黄色指数,这为消除酱油黑底色提供了新的途径。糖化增香曲的混合制曲工艺,在低盐固态发酵过程中得到广泛的应用研究后,有学者尝试将研究的对象转向高盐稀态酱油。徐欢欢等[54]利用米曲霉与糖化增香曲混合制曲,探究生产高盐稀态酱油保温发酵过程的理化指标变化情况。结果表明,与纯种制曲相比,发酵58 d时混合制曲的发酵酱油全氮含量提高了12%,氨基酸态氮和氨基酸生成率分别提高了14%和9%,还原糖含量提高了5%,酱油的红色指数和黄色指数也得到了一定程度的提高。
合理调控米曲霉与糖化增香曲的混合比例,对优化发酵过程、提升酱油的整体品质具有重要意义。在此过程中,针对混合制曲环节中的酶活力变化、风味物质生成以及微生物相互作用等进行深入研究,有利于揭示其作用机制。陈之瑶等[55]侧重混合制曲菌种的比例确定,研究沪酿3.042米曲霉曲精和糖化增香曲不同比例混合制曲下酱油的理化特性,明确了全氮与氨基酸态氮呈显著正相关性(P<0.01),总酸分别与DPPH自由基清除力、总氮呈负相关和正相关(P<0.05),但是不同比例下高盐稀态工艺发酵酱油中的酸性蛋白酶活力和中性蛋白酶活力、全氮、氨基酸态氮、总酸、DPPH自由基清除能力等各有优劣,并不统一。因此,后续研究可聚焦于优化米曲霉与糖化增香曲混合比例,通过更精细的调控,以获得最佳的发酵效果和酱油品质。
2.1.4 米曲霉-红曲霉混合制曲
红曲霉(Monascus)作为一种传统发酵菌种,具有较良好的糖化力、酯化力和产色素能力,为酱油增添独特的色彩和香气。紫红曲霉隶属于红曲霉属,是一种具有独特风味和色泽的微生物,酱油酿造领域的应用亦逐渐受到广泛关注。米曲霉与红曲霉混合制曲是一种创新的酱油制曲工艺,旨在结合两者的优势,混合后能够改善大曲中酶系的种类和活力,提高酱油的口感与风味,增强酱油的色泽。张翀等[56]在高盐稀态酱油发酵过程中添加红曲霉菌复合制曲,运用顶空固相微萃取-色谱-质谱联用技术对稀醪中的挥发性风味物质进行分析,发现红曲酱油挥发性物质中酯类的含量与种类最为丰富,加强了酱油的酯类风味,改善了酱油风味。陈之瑶[57]研究红曲霉(糖化曲中分离出)、米曲霉混合制曲工艺酿造酱油对酱油品质的影响,通过GC-MS技术、气相色谱-嗅闻技术以及感官分析进行结合分析,发现混合制曲酱油的关键滋味和香气物质优于单菌种制曲。米曲霉沪酿3.042与红曲霉混合制曲过程中,不同研究结果显示大曲的酸性蛋白酶活力和中性蛋白酶活力存在显著差异。林涵玉[58]在确认紫红曲霉与米曲霉混合制曲以及米曲霉单独制曲均能显著增强高盐稀态酱油香气的基础上,通过感官分析、核磁共振、GC-MS技术结合衍生化方法,深入研究了混合制曲改善酱油香气的机制。研究表明,米曲霉成曲与混合成曲在非挥发性风味物质上存在显著差异(P<0.05),其中混合成曲的酸类化合物含量较低,但其酶系活性及代谢产物显著高于米曲霉成曲(P<0.05)。在制曲初始阶段,氨基酸、脂肪酸、糖类、糖醇和生物胺等非挥发性化合物的含量呈现上升趋势,随后逐渐下降;与此同时,有机酸及其他类化合物的含量则持续增加。相较于米曲霉大曲,混合大曲在葡萄糖代谢方面展现出更为显著的积极作用。此外,米曲霉成曲中参与糖酵解的关键化合物,以及苯丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等重要香气前体物质的含量,均明显低于混合成曲。该研究不仅揭示了制曲过程中代谢物质的变化规律,还阐明了酱油香气的形成机制,为高盐稀态酱油风味提升的理论研究做出了重要贡献。
然而,米曲霉与红曲酶的混合比例、制曲条件以及后续的发酵工艺等参数并未得到精细的调控和优化。因此,后续研究应聚焦于这些关键参数的优化,通过大量的实验和数据分析,找到最适合的混合比例和制曲条件,以获得最佳的发酵效果和酱油品质。
2.2 多菌种混合制曲
双菌种制曲在提升全氮、氨基酸态氮、风味等酱油核心品质指标以及原料利用率方面具有明显的优势。但相较于双菌种制曲,多菌种混合制曲能够引入更多样化的微生物群落,显著地提高酱油的风味成分。张艳芳[39]在双菌协同制曲后进一步筛选出综合酶活力表现优异的C1B1、C2B2和C2B3组合开展3种菌协同制曲研究。深入分析发现,多菌株共培养体系能诱导米曲霉代谢途径的调整,促使酶系组成发生特异性改变。这种生物协同效应产生的复合酶系统展现出优于单一菌株酶活性简单叠加的增效作用,证实菌群互作引发的酶系重构才是提升制曲综合酶效的关键驱动因素。李莉[59]探究了不同菌种的配比对酱油氨基酸态氮和总氮的影响,结果表明,当米曲霉∶黑曲霉∶木霉为3∶1∶1(质量比)时,酱油的氨基酸态氮和总氮含量比对照单一菌种种曲有明显提高。靳文生[60]将米曲霉3.042、黑曲霉3.350、根霉3.010混合制曲,研究不同比例、制曲温度、制曲时间对蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶活力的影响,研究发现米曲霉、黑曲霉、根霉比例为3∶2∶0.5(质量比)、制曲温度为36 ℃、制曲时间为48 h时,制曲酶系丰富,酶活力高,蛋白酶、淀粉酶、纤维酶分别达3 830、630、1 800 U/g。耿娜[61]以米曲霉为主坯,添加一定量的黑曲霉成曲、红曲米混合制曲,对3组菌株(a组为米曲霉;b组为米曲霉:黑曲霉=3∶1 质量比;c组为米曲霉:黑曲霉=3∶1 质量比,混合时添加其原料重量的8%的红曲米)的蛋白酶活力以及理化指标进行测定分析,发现米曲霉与黑曲霉双菌种混合制曲后蛋白酶活力、氨基酸生成量、总酸、pH等理化指数结果较优,酱油质量整体优于其他2组。而c组米曲霉、黑曲霉、红曲霉混合制曲还原糖含量和红色指数结果较优,但其产生的氨基酸态氨含量不足。因此,在不影响蛋白质分解的基础上,可以在酱油酿造中添加少量红曲霉。此外,袁圆等[62]在米曲霉沪酿3.042加入糖化增香曲、曲精进行混合制曲,研究混合制曲对酶活性和理化指标的影响。结果显示,与单菌株制曲相比,多菌株组合混合制曲并未提升成曲的中性蛋白酶活力,淀粉酶活力也未见显著提高,且未检测到纤维素酶活性。该研究与其他研究结果存在差异,原因可能在于制曲过程中,温度、湿度及制曲时间等环境条件不适应这些微生物生长。此外,亦不排除是多菌种间相互作用所致。因此,未来研究应深入探讨不同环境条件下多菌株混合制曲效果,寻找适宜微生物生长的条件,以及有效平衡多菌中间的生长与代谢,避免不良竞争。
酱油的制曲方式经历了由天然制曲到单一菌种制曲,再到多菌种制曲的一个演变过程。这3种制曲方式在菌种质量酶活力、原料利用率等方面存在差异,各有优劣,其详细对比如表3所示。未来利用现代生物技术手段,如高通量测序、代谢组学分析等,对多菌种混合制曲过程中的微生物群落结构、代谢途径进行深入研究,有助于揭示菌种间的相互作用机制,为优化菌种组合和制曲条件提供了科学途径。此外,结合传统酿造经验与现代科技手段,不断探索和调整多菌种混合制曲的工艺参数,也是提升酱油品质的重要途径。
表3 国产酿造酱油制曲方式对比分析[45, 47, 59]
Table 3 Comparative analysis of Chinese brew soy sauce koji-making methods[45, 47, 59]
酱油特点天然制曲单一菌种制曲混合菌种制曲菌种质量不稳定稳定稳定菌种酶活力自然环境微生物,酶活力低酶系单一,碱性蛋白酶、中性蛋白酶为主,酸性蛋白酶酶活力低多酶系,酶活力大,酸性蛋白酶、中性蛋白酶酶活力高原料利用率酶活力低,发酵能力低,原料利用率低酶活力较高,发酵较彻底,原料利用率较高酶活力高,发酵彻底,原料利用率高加工周期自然露晒,春曲夏醪秋油,发酵时间长发酵时间缩短,时间较短发酵时间大大缩短,时间短,效率高酱油品质受自然环境影响大,风味较好,质量不稳定挥发性风味物质含量低,风味单一特征性风味物质含量增加,风味多样,营养高,功能性强
3 优化制曲原料
制曲原料是影响酱油曲料基质酶系活力的重要因素,主要指提供蛋白质的大豆和豆粕以及提供淀粉的面粉和麸皮。为了探索替代原料,降低生产成本并提升资源利用效率,花生粕、菜籽粕、玉米蛋白粉、醋渣、酱油渣、豆腐渣、大米渣及动物内脏等副产品已经被应用于酱油的酿造过程中。制曲原料需要满足碳水化合物适量、蛋白质含量较高的要求,以上的替代品因处理成本较高、消化率低、或成曲的蛋白酶活性水平低等原因而未被广泛应用。然而,随着酿造技术的提升和理念的改变,这些曲料的潜力再次被发掘。
3.1 植物性材料
植物性原料是酱油酿造的传统基础材料。除了大豆、小麦等主要原料外,其他植物性原料也可用于酿造酱油中作为主要原料或作为辅助原料。蒋立新等[63]在酿造酱油中添加竹笋,发现与传统酱油相比,竹笋酱油可以提高酱油成曲中的蛋白酶活力。其中,氨基酸态氮增加15.96%,总氮增加9.24%,总酚和总黄酮分别增加4.55%和3.83%。张超等[64]在酱油制曲的过程中,采用花生粕作为蛋白质的替代原料,对花生粕与小麦麸皮的比例、米曲霉接种量、制曲温度以及时间进行优化,发现成曲的中性蛋白酶活力、酸性蛋白酶活力、糖化酶活力、淀粉酶活力、纤维素酶活力分别提高至(2 493.67±7.70)、(596.84±23.12)、(29.91±2.63)、(882.85±32.63)、(11.72±3.69) U/g。王丽娜等[65]在酱油制曲过程中添加江蓠进行工艺优化,最优条件下酸性蛋白酶活力、糖化酶活力分别为2 956.86、3 082.80 U/g(干基),而成曲的挥发性香气的种类和含量也发生了改变,其中,醇类、酮类、酯类、醛类等物质对江蓠成曲风味贡献较大。这表明,以江蓠作为发酵基料,能够提升酶系活力,对酿造酱油及其风味改变具有潜在的重要作用。赵杨杨等[66]的研究指出,在米曲霉接种量为0.8×10个/g、香菇添加量为3%(质量分数)、制曲时间为54 h、成曲润水量为54%(质量分数)的条件下发酵的香菇酱油成曲,其中性蛋白酶活性可高达4 414.31 U/g干曲。
3.2 动物性材料
在探究植物性原料在酱油酿造过程中的作用时,学者们亦将研究范围拓宽至动物性材料,积极发掘其在酿造酱油中的独特潜力。舒亦雄等[67]以南美白对虾虾壳和面粉作为酱油酿造的底物,用米曲霉纯种制曲,发现成曲蛋白酶活力高达2 160.8 U/g,糖化酶活力为810.1 U/g。侯美含等[68]利用猪肉代替部分大豆,开发了高盐稀态猪肉酱油,并利用定量感官评价、常规理化分析等方法分析了猪肉对酱油风味和理化指标的影响。结果表明,相较于对照酱油,添加适量的猪肉的酱油鲜味提高了13.79%,氨基酸态含量提高了2.50%～8.64%,DPPH自由基清除能力和还原力分别提高了7.44%～22.60%和25.85%～40.18%。同时,其脂香香气的化合物及具有麦芽香、醇香、焦糖香、果香香气的化合物含量均有不同程度的提高。窦皓[69]以鱿鱼内脏为原料,对酿造的鱿鱼酱油进行工艺优化,研究发现在发酵制曲48 h时,成曲的中性蛋白酶活性达到1 366.54 U/g(干基)。添加风味蛋白酶酿造的鱿鱼酱油,其氨基酸态氮含量为1.06 g/100 mL,全氮含量为1.52 g/100 mL,可溶性无盐固形物含量为18.56 g/100 mL,达到特级发酵酱油标准。
3.3 其他
除了植物性材料和动物性材料外,鸡蛋、酱油渗透液等特殊材料技术同样被应用于酱油制曲过程中。车莹等[70]借鉴酱油的制曲工艺,采用鸡蛋、全蛋粉及麦麸作为原料,接种米曲霉进行制曲。在优化原料的熟制和制曲的工艺条件后,成曲中性蛋白酶活力达到2 970.3 U/g干曲,所制酱油感官评价得分较高。气相色谱-离子迁移谱分析结果表明,鸡蛋酱油中共鉴定出挥发性有机物87种,主要有酯类、醇类、酮类、醛类,与大豆酱油相比风味物质差异较大。该研究成果可为后续新型原料酱油的研发提供参考。此外,有学者将酱油电渗析脱盐过程中分离得到的酱油电渗析液作为浸润黄豆的介质,应用于酱油制曲过程。结果表明,该介质能够促进发酵有益菌建立菌群优势,在改善酱油风味的同时,还具有维护发酵稳态和提升酱油生物安全性的潜力[71]。总而言之,酱油在制作过程中更换蛋白质原料或添加外源性物质(如曲料添加剂),目前仍被认为是提高酱油品质的可取方案,但是仍需在实际生产中进行验证。
4 总结与展望
酱油是广东乃至全国使用最普遍的调味品,菜肴的色、香、味离不开酱油的调和作用。根据时代的发展和社会的需求不断完善改进酿造酱油的制曲技术,提高原料的利用率,酿造色、香、味、体俱全的高品质酱油关系中国的酱油发展。米曲霉是酱油制曲与发酵过程中的核心微生物,能够分泌具有功能互补性的复杂蛋白酶系,这一特性与酱油的风味和品质密切相关。本文从改良米曲霉菌种、混合菌种制曲、优化制曲原料3个方面,归纳了国产酿造酱油制曲工艺的研究进展。目前,国产酿造酱油制曲工艺在深度性、系统性和连贯性方面存在不足,具体表现如下:首先,研究方向从单一菌种筛选转向多菌种复配后,菌群协同机制、代谢调控等关键基础研究尚未形成连续性积累;其次,研究多孤立考察制曲环节,忽视了与后发酵的协同效应,且未建立适配多元工艺的评价体系;国内多菌种制曲研究主要聚焦于表观酶活性的叠加效应,而对微生物拮抗/共生机制、群体感应等分子机制的解析较为缺乏;最后,研究标准主要依赖传统的酶活性指标等生化指标,而多组学技术和规则成簇间隔的短回文重复序列等基因编辑工具的应用则相对不足。酱油制曲是一个复杂、系统性的生物、化学动态过程。因此,未来的研究需构建“菌-酶-料-环境”四位一体的系统框架,贯穿“基因机制→工艺调控→产品质构”的完整认知逻辑,对菌种进行深度探究并精准调控整个发酵过程。唯有如此,方能推动中国酱油制造业从经验依赖转向科学模型驱动的发展,真正实现国产酿造酱油的高端化升级。
[1] 熊锋, 李信, 王芸, 等.不同曲霉在高盐稀态酱油中发酵性能的研究[J].食品科技, 2025, 50(3):1-9.XIONG F, LI X, WANG Y, et al.Fermentation performance of different Aspergillus strains in high-salt liquid-state fermented soy sauce[J].Food Science and Technology, 2025, 50(3):1-9.
[2] 刘威, 董浩, 曾晓房, 等.酱油发酵过程中生物胺生成影响因素及其调控研究进展[J].中国调味品, 2022, 47(12):201-204;208.LIU W, DONG H, ZENG X F, et al.Research progress on influencing factors and regulation of biogenic amines production during soy sauce fermentation[J].China Condiment, 2022, 47(12):201-204;208.
[3] DEVANTHI P V P, GKATZIONIS K.Soy sauce fermentation:Microorganisms, aroma formation, and process modification[J].Food Research International, 2019, 120:364-374.
[4] 张洁, 黄琳琳, 王磊, 等.酱油种曲质量提升策略研究[J].中国酿造, 2025, 44(4):165-169.ZHANG J, HUANG L L, WANG L, et al.Research on strategies for improving the quality of soy sauce seed koji[J].China Brewing, 2025, 44(4):165-169.
[5] 吴日帮, 陈晨, 方博文, 等.米曲霉蛋白酶基因与酶学特性研究进展[J].中国酿造, 2024, 43(4):8-13.WU R B, CHEN C, FANG B W, et al.Research progress on genes and enzymatic characteristics of proteases from Aspergillus oryzae[J].China Brewing, 2024, 43(4):8-13.
[6] 陈伟波, 温雪秋, 刘威, 等.国产酿造酱油二次沉淀研究进展[J].中国酿造, 2024, 43(12):21-27.CHEN W B, WEN X Q, LIU W, et al.Research progress on secondary precipitation of domestic soy sauce[J].China Brewing, 2024, 43(12):21-27.
[7] ITO K, MATSUYAMA A.Koji molds for Japanese soy sauce brewing:Characteristics and key enzymes[J].Journal of Fungi, 2021, 7(8):658.
[8] 李婷, 李雄波, 符怡, 等.赤水河流域酱油酿造米曲霉的筛选及其发酵性能研究[J].中国酿造, 2025, 44(8):161-169.LI T, LI X B, FU Y, et al.Screening and fermentation performance of Aspergillus oryzae in soy sauce brewing in the Chishui River Basin[J].China Brewing, 2025, 44(8):161-169.
[9] ZHAO C, ZHANG Y X, LI S S, et al.Impacts of Aspergillus oryzae 3.042 on the flavor formation pathway in Cantonese soy sauce koji[J].Food Chemistry, 2024, 441:138396.
[10] 范梦雪, 贾玉晗, 王玉芳, 等.基于水解酶系均衡的米曲霉菌种复壮选育和诱变育种研究[J].鲁东大学学报(自然科学版), 2024, 40(4):354-359.FAN M X, JIA Y H, WANG Y F, et al.Rejuvenation and mutation breeding of Aspergillus oryzae based on hydrolase series balanced[J].Journal of Ludong University (Natural Science Edition), 2024, 40(4):354-359.
[11] 陆琼, 畅灵丽, 王江栓.微生物菌种选育技术的探索[J].中国食品工业, 2023(14):87-89.LU Q, CHANG L L, WANG J S.Exploration on breeding technology of microbial strains[J].China Food Industry, 2023(14):87-89.
[12] 林祖申. 关于酿造产品米曲霉菌株的诱变育种[J].上海调味品, 1982(3):11-13.LIN Z S.Mutation breeding of brewing product Aspergillus oryzae strain[J].Shanghai Seasoning, 1982(3):11-13.
[13] 冯霞, 廖云生, 张蓓蓓, 等.用于低温制曲的米曲霉菌株的诱变及筛选研究[J].中国调味品, 2025, 50(7):115-118.FENG X, LIAO Y S, ZHANG B B, et al.Study on mutagenesis and screening of Aspergillus oryzae strains used for low-temperature koji making[J].China Condiment, 2025, 50(7):115-118.
[14] 莫芳华, 何静, 邢浩然, 等.常压室温等离子体诱变选育耐盐产香酵母菌株[J].中国调味品, 2024, 49(10):39-42;49.MO F H, HE J, XING H R, et al.Breeding of salt-tolerant and aroma-producing Zygosaccharomyces rouxii strains by atmospheric and room temperature plasma mutagenesis[J].China Condiment, 2024, 49(10):39-42;49.
[15] 孙思城, 李浩然, 苏国万, 等.ARTP-UV复合诱变结合含盐平板选育产耐盐高活性蛋白酶的米曲霉[J].食品科学, 2025, 46(15):120-127.SUN S C, LI H R, SU G W, et al.Combined mutagenesis by atmospheric and room temperature plasma and ultraviolet and screening on salt containing plates of Aspergillus oryzae for high salt tolerance and activity of protease[J].Food Science, 2025, 46(15):120-127.
[16] 上海市粮油工业公司酿造实验工场. 米曲霉3.042菌株的选育[J].微生物学报, 1976, 16(1):70.GRAIN AND OIL INDUSTRY COMPANY OF SHANGHAI BREWING EXPERIMENTAL PLANT.Breeding of Aspergillus oryzae strain 3.042[J].Acta Microbiologica Sinica, 1976, 16(1):70.
[17] XU D F, LI C H, ZHAO M M, et al.Assessment on the improvement of soy sauce fermentation by Aspergillus oryzae HG76[J].Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2013, 2(4):344-351.
[18] 孟广超. 基于ARTP技术筛选高产氨肽酶米曲霉菌株及发酵和酶解条件优化的研究[D].郑州:郑州大学, 2021.MENG G C.Screening of aminopeptidase producing strains based on ARTP technology and optimization of fermentation and enzymolysis conditions[D].Zhengzhou:Zhengzhou University, 2021.
[19] 范梦雪, 王璐瑶, 陈卫卫, 等.酿造用米曲霉菌种选育的研究进展[J].食品科学, 2023, 44(5):346-354.FAN M X, WANG L Y, CHEN W W, et al.Recent progress in the screening and breeding of Aspergillus oryzae for brewing[J].Food Science, 2023, 44(5):346-354.
[20] 樊嘉训, 刘松, 陆信曜, 等.高产蛋白酶米曲霉菌株的选育及对酱油风味生成的影响[J].食品与发酵工业, 2021, 47(21):1-8.FAN J X, LIU S, LU X Y, et al.Breeding Aspergillus oryzae with high-productive protease and its influence on soy sauce fermentation[J].Food and Fermentation Industries, 2021, 47(21):1-8.
[21] MURTHY P S, KUSUMOTO K I.Acid protease production by Aspergillus oryzae on potato pulp powder with emphasis on glycine releasing activity:A benefit to the food industry[J].Food and Bioproducts Processing, 2015, 96:180-188.
[22] 李鹏, 张艳芳, 王军, 等.紫外诱变选育米曲霉氨肽酶高产菌株[J].中国调味品, 2017, 42(1):61-64.LI P, ZHANG Y F, WANG J, et al.Breeding of Aspergillus oryzae aminopeptidase-producing strains by ultraviolet induced mutation[J].China Condiment, 2017, 42(1):61-64.
[23] 万萍, 孙杰, 周琳, 等.酱油制曲工艺条件的影响研究[J].食品与发酵科技, 2018, 54(4):71-74.WAN P, SUN J, ZHOU L, et al.Studies on conditions of soy sauce koji processing[J].Food and Fermentation Sciences &Technology, 2018, 54(4):71-74.
[24] 童星, 彭勃.一株高酶活力米曲霉菌株的选育及其在酱油生产中的应用[J].中国酿造, 2018, 37(11):51-55.TONG X, PENG B.Breeding of Aspergillus oryzae with high enzyme activity and its application in soy sauce production[J].China Brewing, 2018, 37(11):51-55.
[25] GAO X L, LIU E M, YIN Y Y, et al.Enhancing activities of salt-tolerant proteases secreted by Aspergillus oryzae using atmospheric and room-temperature plasma mutagenesis[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2020, 68(9):2757-2764.
[26] SHU L, SI X G, YANG X D, et al.Enhancement of acid protease activity of Aspergillus oryzae using atmospheric and room temperature plasma[J].Frontiers in Microbiology, 2020, 11:1418.
[27] 张霖靖, 侯莎, 高苏娟, 等.酿造酱油中米曲霉及蛋白酶的研究进展[J].食品研究与开发, 2025, 46(5):196-203.ZHANG L J, HOU S, GAO S J, et al.Research progress on Aspergillus oryzae and protease in fermented soy sauce[J].Food Research and Development, 2025, 46(5):196-203.
[28] 杜冰冰. 采用离子注入法诱变酱油酿造用米曲霉的研究[D].天津:天津科技大学, 2005.DU B B.Study on mutation and breeding of soy brewing Aspergillus oryzae by ion implantation[D].Tianjin:Tianjin University of Science &Technology, 2005.
[29] ZHAO G Z, HOU L H, LU M F, et al.Construction of the mutant strain in Aspergillus oryzae 3.042 for abundant proteinase production by the N+ ion implantation mutagenesis[J].International Journal of Food Science &Technology, 2012, 47(3):504-510.
[30] 凌帅, 刘咏, 姚建铭, 等.紫外线与N+注入复合诱变选育曲酸高产菌株[J].食品科学, 2013, 34(1):234-238.LING S, LIU Y, YAO J M, et al.Mutation breeding of high-yield kojic acid-producing strains by UV irradiation combined with N+ implantation[J].Food Science, 2013, 34(1):234-238.
[31] 唐洁. 利用原生质体融合技术进行米曲霉新菌株的选育[D].成都:西华大学, 2007.TANG J.A research on screening new Strain of Aspergillus oryzae with protoplast fusion[D].Chengdu:Xihua University, 2007.
[32] XU D F, PAN L, ZHAO H F, et al.Breeding and identification of novel koji molds with high activity of acid protease by genome recombination between Aspergillus oryzae and Aspergillus niger[J].Journal of Industrial Microbiology &Biotechnology, 2011, 38(9):1255-1265.
[33] WANG S H, DUAN M J, LIU Y L, et al.Enhanced production of fructosyltransferase in Aspergillus oryzae by genome shuffling[J].Biotechnology Letters, 2017, 39(3):391-396.
[34] 邵伟, 熊泽, 唐明.沪酿3.042米曲霉菌种诱变选育研究[J].中国调味品, 2006, 31(3):21-24.SHAO W, XIONG Z, TANG M.Studies on the mutation and selecting Aspergillus oryzae-Huniang 3.042[J].China Condiment, 2006, 31(3):21-24.
[35] 潘力, 梁燕嫦, 苗小康, 等.基于基因组改组的米曲霉沪酿3.042多亲株PEG介导融合育种[J].中国酿造, 2008, 27(12):70-73.PAN L, LIANG Y C, MIAO X K, et al.Breeding of Aspergillus oryzae 3.042 by multiparental PEG-mediated protoplasts fusion based on Genome shuffling[J].China Brewing, 2008, 27(12):70-73.
[36] 叶菁, 蒋雪薇, 罗晓明, 等.高蛋白酶酶活酱油发酵用米曲霉的复合诱变选育[J].食品与机械, 2017, 33(1):7-10;15.YE J, JIANG X W, LUO X M, et al.Multiple mutation breeding of Aspergillus oryzae with high protease activity in soy sauce fermentation[J].Food &Machinery, 2017, 33(1):7-10;15.
[37] 于江. 富产琥珀酸米曲霉菌株的诱变选育及其应用研究[D].烟台:烟台大学, 2019.YU J.The mutation breeding and application of Aspergillus oryzae rich in succinate[D].Yantai:Yantai University, 2019.
[38] 张林祥, 周利南, 邢利民, 等.多菌种混合制曲生产玫瑰醋的工艺及品质研究[J].中国食品学报, 2024, 24(9):344-353.ZHANG L X, ZHOU L N, XING L M, et al.Research on the process and quality of rosy vinegar production by multi-strain mixed cranking[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2024, 24(9):344-353.
[39] 张艳芳. 多菌株制曲促进酶系优化与提高酱油质量的研究[D].无锡:江南大学, 2009.ZHANG Y F.Study on multi-strain koji-making to promote enzyme system optimization and improve soy sauce quality[D].Wuxi:Jiangnan University, 2009.
[40] 颜喆. 米曲霉菌株筛选及双菌株制曲在酱醪发酵中的应用[D].广州:华南农业大学, 2016.YAN Z.The screening of Aspergillus oryzae and application of using multi-strains during koji making[D].Guangzhou:South China Agricultural University, 2016.
[41] 李鹏, 张艳芳, 王选年.米曲霉双菌株组合制曲对产蛋白酶的影响[J].食品与生物技术学报, 2018, 37(2):206-210.LI P, ZHANG Y F, WANG X N.Effects of combination koji making of two strains of Aspergillus oryzae on proteases system[J].Journal of Food Science and Biotechnology, 2018, 37(2):206-210.
[42] 路怀金, 刘通讯, 赵谋明, 等.2株米曲霉的特色酶系对酱油理化指标及品质的影响[J].中国食品学报, 2021, 21(5):230-237.LU H J, LIU T X, ZHAO M M, et al.Effects of enzyme profiles of two different Aspergillus oryzae strains on physicochemical indexes and quality of soy sauce[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2021, 21(5):230-237.
[43] 罗雯, 郭建, 樊君, 等.酱油酿造中复合米曲霉发酵制曲研究[J].中国调味品, 2022, 47(4):164-166.LUO W, GUO J, FAN J, et al.Study on koji making by fermentation of compound Aspergillus oryzae in brewing of soy sauce[J].China Condiment, 2022, 47(4):164-166.
[44] 李思颖, 温林凤, 梁锦云, 等.黑曲霉不同发酵时间的添加对酱油风味的影响[J].食品与发酵工业, 2025, 51(13):156-162.LI S Y, WEN L F, LIANG J Y, et al.Effect of addition of Aspergillus niger at different fermentation times on the flavor of soy sauce[J].Food and Fermentation Industries, 2025, 51(13):156-162.
[45] 李保英. 多菌种酱油制曲工艺及其对酱油风味影响的研究[D].杭州:浙江工商大学, 2013.LI B Y.Study on koji-making process of soy sauce with multi-strain and its impact on soy sauce flavor[D].Hangzhou:Zhejiang Gongshang University, 2013.
[46] 程世杰. 多菌种共生发酵广式高盐稀态酱油关键技术研究[D].广州:仲恺农业工程学院, 2014.CHENG S J.Research of key technology of high-salt-diluted state of soy sauce in Guangdong areas by multi-strain fermentation[D].Guangzhou:Zhongkai University of Agriculture and Engineering, 2014.
[47] 郑博. 混菌制曲发酵对酱油品质影响的研究[D].天津:天津科技大学, 2016.ZHENG B.Study on the effect of mixed cultures fermentation on the quality of soy sauce[D].Tianjin:Tianjin University of Science &Technology, 2016.
[48] HU W K, LIU Z P, FU B, et al.Metabolites of the soy sauce koji making with Aspergillus niger and Aspergillus oryzae[J].International Journal of Food Science &Technology, 2022, 57(1):301-309.
[49] 胡文康. 米曲霉与黑曲霉混合酿造酱油的代谢组学研究[D].武汉:湖北工业大学, 2020.HU W K.Metabolomics of soy sauce brewed by Aspergillus oryzae and Aspergillus niger[D].Wuhan:Hubei University of Technology, 2020.
[50] 郑二帅, 曹猛, 梁兰兰, 等.多菌种联合发酵降低酱油二次沉淀的研究[J].食品安全导刊, 2023(18):135-138.ZHENG E S, CAO M, LIANG L L, et al.Study on reducing secondary sedimentation of soy sauce by multi-strain joint fermentation[J].China Food Safety Magazine, 2023(18):135-138.
[51] 李荔, 童星.酱油酿造中米曲霉和酱油曲霉复合制曲的研究[J].中国调味品, 2018, 43(5):145-148.LI L, TONG X.Study on mixed koji made by Aspergillus oryzae and Aspergillus sojae in soy sauce brewing[J].China Condiment, 2018, 43(5):145-148.
[52] 姚继承, 陶贵明, 屈光伟.糖化增香曲在发酵酱油和酱制品中的应用探讨[J].中国酿造, 2007, 26(3):61-65.YAO J C, TAO G M, QU G W.Preparation of glycos-esterifiable koji and its application in fermented soy sauces and pastes[J].China Brewing, 2007, 26(3):61-65.
[53] 王素珍, 刘文鹏, 陶贵明, 等.双菌种联合发酵酿制酱油应用研究[J].中国调味品, 2009, 34(4):55-57.WANG S Z, LIU W P, TAO G M, et al.Two-brewed soy sauce fermentation strains of the joint application[J].China Condiment, 2009, 34(4):55-57.
[54] 徐欢欢, 欧阳珊, 尹文颖, 等.混合制曲对酿造酱油理化特性的影响[J].食品与发酵工业, 2012, 38(7):82-85.XU H H, OUYANG S, YIN W Y, et al.Study of the impact of the mixed-koji on the physical and chemical characteristics of brewing soy sauce[J].Food and Fermentation Industries, 2012, 38(7):82-85.
[55] 陈之瑶, 冯云子, 崔春, 等.混合制曲对高盐稀态酱油理化特性的影响[J].食品工业科技, 2013, 34(15):136-139;148.CHEN Z Y, FENG Y Z, CUI C, et al.Effect of making koji with multi-strain on physicochemical properties of high-salt and diluted-state soy sauce[J].Science and Technology of Food Industry, 2013, 34(15):136-139;148.
[56] 张翀, 雷艳平, 王丹妮, 等.红曲霉菌混合制曲高盐稀态发酵过程挥发性物质的变化[J].食品工业科技, 2021, 42(13):51-58.ZHANG C, LEI Y P, WANG D N, et al.Variation of volatile substances in high-salt dilute fermentation process of Monascus mixed koji production[J].Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(13):51-58.
[57] 陈之瑶. 红曲霉与米曲霉混合制曲对发酵高盐稀态酱油影响的研究[D].广州:华南理工大学, 2014.CHEN Z Y.The effects of making koji with mixed strains on physicochemical properties and sensory evaluation of high-salt and liquid-state soy sauce[D].Guangzhou:South China University of Technology, 2014.
[58] 林涵玉. 紫红曲霉改善高盐稀态酱油风味作用及机理分析[D].广州:华南理工大学, 2020.LIN H Y.Mehanism of aroma characteristics improvement in soy sauce fermented by mixed koji[D].Guangzhou:South China University of Technology, 2020.
[59] 李莉. 三菌种混合制曲提高酱油蛋白质利用率的研究[J].中国调味品, 2010, 35(9):60-64.LI L.Study on improving the utilization ratio of protein and enhancing flavor in soy sauce brewing[J].China Condiment, 2010, 35(9):60-64.
[60] 靳文生. 酱油多菌种制曲改善酶系组成的研究[J].现代食品科技, 2011, 27(8):977-979.JIN W S.Improvement of composition of enzyme system and sauce fermentation by using multi-strain koji starters[J].Modern Food Science &Technology, 2011, 27(8):977-979.
[61] 耿娜. 酱油多菌种混合发酵工艺探究[D].长沙:湖南农业大学, 2016.GENG N.Study of multi-strain fermentation technology of soy sauce[D].Changsha:Hunan Agricultural University, 2016.
[62] 袁圆, 纪凤娣, 鲁绯, 等.多菌种制曲在原池浇淋酱油制曲工艺中的应用研究[J].中国酿造, 2010, 29(7):53-56.YUAN Y, JI F D, LU F, et al.Multi-strains koji-making in the pond of soy sauce with spraying-extraction[J].China Brewing, 2010, 29(7):53-56.
[63] 蒋立新, 葛青, 张强, 等.添加竹笋对酱油制曲以及成品酱油品质的影响[J].中国调味品, 2020, 45(2):76-84.JIANG L X, GE Q, ZHANG Q, et al.Effect of adding bamboo shoots on soy sauce koji making and quality of finished soy sauce[J].China Condiment, 2020, 45(2):76-84.
[64] 张超, 李玟君, 汪海燕, 等.花生粕酱油制曲工艺条件优化[J].中国酿造, 2021, 40(9):52-57.ZHANG C, LI M J, WANG H Y, et al.Optimization of koji-making technology of peanut meal sauce[J].China Brewing, 2021, 40(9):52-57.
[65] 王丽娜, 汪卓, 高原, 等.添加江蓠对酱油制曲及成曲品质的影响[J].食品与发酵工业, 2024, 50(10):40-47.WANG L N, WANG Z, GAO Y, et al.Effect of Gracilaria on soy sauce koji-making and its quality[J].Food and Fermentation Industries, 2024, 50(10):40-47.
[66] 赵杨杨, 于贞.香菇酱油制曲工艺的优化[J].中国调味品, 2023, 48(2):115-119.ZHAO Y Y, YU Z.Optimization of koji-making technology of Lentinus edodes soy sauce[J].China Condiment, 2023, 48(2):115-119.
[67] 舒亦雄, 徐秀芬, 李登, 等.虾壳酱油制曲条件研究[J].中国调味品, 2020, 45(7):108-113;119.SHU Y X, XU X F, LI D, et al.Study on koji-making conditions of shrimp shell soy sauce[J].China Condiment, 2020, 45(7):108-113;119.
[68] 侯美含, 张展开, 张智宏, 等.猪肉酱油开发及其风味物质分析[J].食品与发酵工业, 2025, 51(19):366-374.HOU M H, ZHANG Z K, ZHANG Z H, et al.Development of pork soy sauce and identification of its flavor compounds[J].Food and Fermentation Industries, 2025, 51(19):366-374.
[69] 窦皓. 以鱿鱼内脏为原料酿造酱油技术研究与设计[D].烟台:烟台大学, 2024.DOU H.Research and design of soy sauce brewing technology using squid offal as raw material[D].Yantai:Yantai University, 2024.
[70] 车莹, 褚彦钧, 田笑, 等.鸡蛋酱油原料熟制和制曲条件优化及挥发性成分分析[J].中国食品学报, 2023, 23(7):289-306.CHE Y, CHU Y J, TIAN X, et al.Optimization of steaming and koji-making conditions and analysis of volatile components in egg soy sauce[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2023, 23(7):289-306.
[71] 苗春雷, 朱娅媛, 黄卓权, 等.酱油电渗析液用于酱油制曲的研究[J].中国酿造, 2024, 43(11):180-186.MIAO C L, ZHU Y Y, HUANG Z Q, et al.Application of soy sauce electrodialysis brine in the koji-making of soy sauce[J].China Brewing, 2024, 43(11):180-186.