食品中蛋白质共价交联类型、机理及应用研究进展

蛋白质是食品中的重要组分,在食品加工过程中,蛋白质分子内、分子间或蛋白质与其他分子间会产生共价和非共价交联。蛋白质共价交联包括二硫键交联、美拉德反应交联、脱氢蛋白质衍生交联、异肽键交联和二酪氨酸交联等[1]。相较于非共价交联,共价交联对食品品质影响更显著,JIANG等[2]采用不同比例的大豆分离蛋白和谷朊粉制备植物蛋白肉,发现二者的质量比为9∶3时,植物蛋白肉中二硫键含量最高(86.12%),非共价键(氢键+离子键+疏水相互作用)含量最低(13.88%),此时植物蛋白肉表观黏度最高,纤维形态最明显。部分情况下,共价和非共价交联可协同调控食品品质,如脂肪酶可促进脂质氧化生成丙二醛,丙二醛进而氧化蛋白质,JIAO等[3]利用不同浓度脂肪酶处理鲶鱼鱼糜凝胶,发现脂肪酶含量增至7.5 g/kg时,蛋白质氧化程度最高(羰基含量 5.75 nmol/g),此时蛋白质内的疏水相互作用和二硫键含量亦分别增至(8.97±0.55) g/L、(43.30±0.90) μmol/g,成为介导凝胶形变的主要作用力,引起凝胶强度最强。

随着食品加工条件的改变,在蛋白质内部主导的共价交联类型也在发生变换[4]。如CARDOSO等[5]以60 ℃、相对湿度65%加热α-乳白蛋白体系48 h,发现此时蛋白质共价交联以二硫键为主;引入葡萄糖后体系的二硫键占比从75%以上降至36%,但每摩尔蛋白质中美拉德反应产物果糖-赖氨酸由0增至6.53 mol,羧甲基赖氨酸[Nε-(carboxymethyl)-lysine,CML]、羧乙基赖氨酸[Nε-(carboxyethyl)-lysine,CEL]分别增长20倍、14倍,此时美拉德反应交联主导蛋白质共价交联,引发乳清蛋白聚集,形成不溶性聚集体。

值得注意的是,部分蛋白质共价交联产物的有害性不可忽视。如美拉德反应的晚期糖基化终末产物(advanced glycation end-products,AGEs),在大多数组织中积累会导致各种慢性疾病的发生,例如糖尿病、心血管疾病和慢性肾功能衰竭[6]。此外,脱氢蛋白质衍生物赖丙氨酸(lysinoalanine,LAL)会引起食品中必需氨基酸含量下降,干扰人体消化功能,甚至可能促使机体肾细胞病变[7]。

基于此,该文对食品加工过程中蛋白质的共价交联类型、机理和应用进行探讨和综述,以期为调控蛋白质共价交联、靶向改造蛋白质结构,提升蛋白质的功能性和应用性,开发更美好的蛋白食品提供理论参考,为更安全高蛋白食品的创制提供思路参考。

1 食品中蛋白质共价交联类型及应用

食品中蛋白质共价交联主要包括二硫键交联、美拉德反应交联、脱氢蛋白质衍生交联、异肽键交联和二酪氨酸交联等,基于中国知网和Web of Science数据库,对不同蛋白质共价交联类型中英文文献分别进行关键词检索(二硫键、美拉德、脱氢丙氨酸、异肽键、二酪氨酸;Disulfide bond、Maillard、Dehydroalanine、Isopeptide bond、Dityrosine)。如图1所示,二硫键交联相关文献报道最多,研究热度最高;美拉德反应交联研究热度次之;脱氢蛋白质衍生交联、异肽键交联和二酪氨酸交联相关研究报道数量较少,关注度相对较低。研究热度差异源于各交联类型的不同特点,二硫键交联普遍存在、应用广泛且检测技术成熟,美拉德反应交联因其产物复杂性研究热度低于二硫键交联,其他类型交联则受限于形成条件、检测难度或应用范围,未来这些挑战有待取得新突破。

1.1 二硫键交联

二硫键交联是天然蛋白质中最常见的交联类型,形成途径有2种:通过氧化2个空间邻近的还原态半胱氨酸残基形成(图2-a);通过巯基-二硫键交换反应形成(图2-b),巯基蛋白中的硫阴离子对二硫化物的硫原子进行亲核攻击,破坏旧二硫键,形成混合二硫化物,巯基蛋白中的硫阴离子继续亲核进攻混合二硫化物中的二硫键,最终在蛋白质分子间或分子内形成新的二硫键[8]。

氧化剂或酶处理可使蛋白质生成由二硫键连接的单体、寡聚体及异聚体,反之,还原反应可抑制和破坏二硫键交联。如刘昌棋等[9]发现植物蛋白肉在高水分挤压过程中,氢键和二硫键主导挤出物结构的形成;在湿法纺丝和剪切过程中通过巯基-二硫键交换反应形成新的二硫键,新形成的二硫键有利于多肽链紧密聚集形成纤维结构。蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)是二硫键形成反应的专用催化剂,GAO等[10]指出PDI可特异性识别含3个半胱氨酸残基的小麦谷蛋白亚基1Dx5-NTD,介导二硫键交联,促进面筋网络的形成。

此外,施加高温、高压等物理手段可改变蛋白质的空间结构,使原本因空间位阻无法参与反应的半胱氨酸残基被氧化,或与胱氨酸加合物反应形成新的二硫键[11]。如YAO等[12]采用不同高静水压(200、300、400、500 MPa)处理30 g/L的小麦面筋悬浮液20 min,发现高静水压处理组的游离巯基含量(2.0～4.5 μmol/g)均显著低于对照组(6.0～6.5 μmol/g),并指出高静水压处理改变了面筋蛋白的二级结构,面筋蛋白通过疏水相互作用和二硫键形成蛋白质聚集体,此时部分抗原表位被破坏或隐藏,面筋蛋白致敏性降低。

可对蛋白质样品进行还原处理,并借助SDS-PAGE来表征还原前后蛋白条带的消失数,以鉴定二硫键交联聚合物数量。

二硫键与游离巯基间可相互转变,当二硫键形成时,不同区域的氨基酸残基靠拢,肽链折叠,同时形成局部疏水中心,得到较稳定、有序的空间结构;当二硫键断裂时,蛋白质结构较松散[13]。对于面筋蛋白来说,巯基和二硫键的平衡对面团的强度和延展性起关键作用,高含量的二硫键可能导致蛋白质网络过于紧密,无法进行有效的结构调整;当加入还原剂Na2SO3后,部分二硫键被破坏,随着游离巯基/二硫键比值的增大,面筋蛋白的持水性和延展性都有所改善[14]。如LI等[15]利用Na2SO3改性后的面筋制作面条,煮熟后发现改性面条的弹性、黏合性、咀嚼度、拉力等质地参数显著降低,红外光谱结果显示改性面筋中硫醇基团拉伸振动峰峰值强度显著增加,并指出二硫键是优质面条形成的关键,Na2SO3还原二硫键后造成面筋网络结构破坏,因此导致熟化后的面条质构特性变差。蛋白质在热处理过程中形成分子间二硫键的能力也是乳类、肉类、大豆、蛋类中形成凝胶的必要条件,如二硫键主导乳清蛋白的聚集过程,其交联程度显著影响乳清蛋白水凝胶的质地[16];烹饪过程中肉类质构特性的变化也与蛋白质分子间二硫键交联网络的形成密切相关[17]。

1.2 美拉德反应交联

美拉德反应是蛋白质、肽和氨基酸等化合物的氨基与还原糖的羰基发生氧化、环化及聚合等反应,生成一系列中间产物与美拉德色素的过程[18]。如图3所示,美拉德反应可分为3个阶段:

初期阶段主要包括糖胺缩合和分子重排,糠氨酸作为美拉德反应初期阶段的代表性产物被多篇文献报道[19-21]。中期阶段主要包括糖脱水、糖裂解及Strecker降解,其中部分Amadori化合物和糖脱水产物进一步发生糖裂解,核心原理即逆羟醛缩合。Amadori化合物在低pH下通过糖脱水形成的5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,5-HMF)可作为中期阶段典型性代表物。末期阶段反应较复杂且机理仍较模糊,主要包括羟醛缩合和醛胺缩合2个阶段[22],末期阶段的代表性产物即AGEs。

具有邻近二羰基的化合物无需酶催化,即可与氨基发生醛胺缩合反应。如图4-a所示,美拉德反应中期阶段的多种α-二羰基化合物,如乙二醛(glyoxal,GO)、甲基乙二醛(methylglyoxal,MGO)、Amadori中期产物等均可与赖氨酸(lysine,Lys)的ε-氨基、精氨酸(arginine,Arg)的胍基发生醛胺缩合反应生成AGEs[23]。

在蛋白质中主要是侧链含氨基的Lys残基和Arg残基主导AGEs的生成,如图4-b所示,可依据参与反应的氨基酸残基种类不同将AGEs分为Lys修饰的AGEs、Arg修饰的AGEs和Lys+Arg共同修饰的AGEs三类[24],其中CML、CEL常作为AGEs形成的标志物[25]。目前已发现的AGEs超过40多种,在人体组织中已检测到十余种[26-27]。

还原糖及氨基酸的种类、加工工艺等均能显著影响美拉德反应进程及AGEs的生成量。由于结构上的差异,相较于其他氨基酸,Lys和Arg的美拉德反应活性更高;糖中羰基的还原性越强,美拉德反应活性越高,戊糖、己糖、双糖的美拉德反应活性依次降低[28]。相较于煮,煎、烤、炒可显著提升食物中AGEs生成量[29]。降低温度、缩短时间可有效抑制CML、CEL的生成[30]。适宜的水分活度可加速美拉德反应进程;中性和弱碱性环境更有利于美拉德反应发生[31]。

适度的美拉德反应可改变蛋白质的质构、乳化性、溶解性、致敏性和抗氧化性等[32]。CHU等[33]利用燕麦β-葡聚糖改性大豆分离蛋白,发现因多糖亲水基团的引入,改性后的大豆分离蛋白二级结构变得松散,肽链展开,溶解性显著提升(P<0.05)。布冠好等[34]将葡聚糖引入大豆分离蛋白体系进行干法糖基化反应,发现引入糖链可促使蛋白质分子展开,随着反应时间延长,糖基化产物表面抗原性持续降低,反应时长为6 d时,伴大豆球蛋白及大豆球蛋白的抗原抑制率分别降低36.90%和18.12%。如图3所示,美拉德反应进程中会产生大量醛酮、类黑素等化合物,这些化合物部分具有抗氧化性,因此美拉德产物具有抗氧化性[35]。如葡萄糖的美拉德反应活性低于木糖,葡萄糖体系的抗氧化活性略低于木糖体系[28]。

美拉德反应在不同阶段均会形成有害物,如初期产物的糠氨酸、中期产物的5-HMF和末期产物AGEs、类黑素、杂环芳胺等。糠氨酸的外源性摄入和内源性积累都可能影响肾功能[20]。5-HMF对眼黏膜、上呼吸道黏膜和皮肤具有刺激性,降低食品中5-HMF的含量已成为趋势[36]。薛瑞琪等[37]对17种市售液态乳分析发现,褐色乳的5-HMF含量(褐色乳饮料42.21～54.95 mg/L、褐色酸奶8.26～15.36 mg/L)远高于普通牛乳,目前尚未出台有关褐色乳中5-HMF的限量标准。CML、CEL等AGEs与肿瘤、癌症等流行病及糖尿病、高脂血症和肥胖症等慢性代谢病存在相关性[38]。减少食物中AGEs的形成是维持健康和预防AGEs诱导的慢性疾病的必要条件[39]。

1.3 脱氢蛋白质衍生交联

如图5所示,脱氢蛋白质衍生交联分2步形成:1)蛋白质中胱氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、磷酸丝氨酸、苏氨酸残基等发生β-消除反应生成脱氢丙氨酸或3-甲基脱氢丙氨酸残基[40](图5-a);2)脱氢丙氨酸或3-甲基脱氢丙氨酸残基与其他肽链或同肽链其他位置上的赖氨酸、半胱氨酸、鸟氨酸、组氨酸等残基通过迈克尔加成反应生成LAL、羊毛硫氨酸(lanthionine,LAN)、鸟丙氨酸、组丙氨酸等共价交联氨基酸[41](图5-b)。

当前,关于脱氢蛋白质衍生物的研究主要集中于LAN和LAL,这2种交联物广泛存在于谷物制品[42]、植物蛋白产品[43]、乳制品[44]、蛋制品[45]等高蛋白产品中。相较于LAL,LAN更易形成,LAN形成所需的温度和pH均低于LAL。如弱碱条件即可诱导LAN形成[42];KOYAMA等[45]在加热蛋清蛋白过程中发现,LAN在60 ℃开始生成,LAL在80 ℃开始生成,LAN的形成量远高于LAL,100 ℃处理后LAN含量达41.8 μmol/g,是LAL的13倍。但过高的温度或pH可引起LAL的降解,如WANG等[43]报道火麻籽分离蛋白中LAL含量随着加热温度升高(40、50、60、70 ℃)而升高(1.10、3.39、7.01、10.28 mg/g),但温度升至80 ℃后LAL含量降至9.25 mg/g;AYIM等[46]在从茶渣中提取蛋白质时发现,当碱液pH值由12.08升至13.16,LAL含量由0.36 g/kg增至29.43 g/kg,pH值继续增至13.25,LAL含量降至7.37 g/kg。

LAN和LAL的形成也影响着蛋白质的结构和功能性。如KOYAMA等[45]发现蛋清蛋白在加热过程中可形成LAL和LAN交联,且LAL和LAN含量与蛋清凝胶硬度显著正相关。LAGRAIN等[47]130 ℃水热处理麦醇溶蛋白120 min,后利用含2.0 mol/L尿素、1%二硫苏糖醇的SDS缓冲液提取小麦醇溶蛋白,充分破坏二硫键后发现醇溶蛋白提取率仅77%,并指出其可能由分子间LAN交联引起。

值得注意的是,LAL的生成需要消耗赖氨酸、苏氨酸等必需氨基酸,会降低蛋白质的营养性,LAL还会影响人体消化酶作用[48]。GARCIA-MARTINEZ等[49]发现与健康对照相比,慢性肾脏病人群的血清LAN浓度高出10倍。LAL对人体健康的影响机制尚待探究。

1.4 二酪氨酸(dityrosine,DT)交联

如图6所示,DT由2个酪氨酸残基经自由基介导的氧化反应生成,是主要的酪氨酸氧化产物[1]。酪氨酸作为典型的芳香族氨基酸易受到氧化修饰,活性氧优先攻击酪氨酸的酚羟基,诱导苯氧基自由基的形成,该自由基发生分子内重排形成更稳定的碳中心自由基,最终以C—C键共价交联形成DT[50]。加热或借助酪氨酸酶、漆酶等氧化酶催化可提高其交联效率[51],而添加半胱氨酸、谷胱甘肽等自由基清除剂时,酪氨酸交联程度急剧下降[52]。DT结构稳定,耐酸、碱和水解酶,是评价组织蛋白质氧化程度的重要指标[53]。可通过酸水解使DT从蛋白质中游离出来,利用DT的325 nm激发波长和410 nm发射波长特性对DT进行荧光检测[54]。

DT广泛存在于肉类、乳制品、面粉制品中,可通过调节加工参数调控DT含量。在肉类制品中,GE等[55]发现生猪肉中DT含量为4.7 ng/g,真空包装猪肉在70 ℃和121 ℃分别烹饪1 h后,DT含量分别增至11.7 ng/g和22.1 ng/g。在乳制品中,LI等[56]研究发现煮沸后的全脂牛奶和半脱脂牛奶、未处理的新鲜牛奶中DT含量依次降低(350、300、250 pg/mg),全脂牛奶煮沸9 min或微波处理90 s后DT含量达到400 pg/mg,180 ℃喷雾干燥全脂奶粉的DT含量高达1 400 pg/mg。DT含量与加热时间、温度存在正相关关系,可通过控制加热时间、温度调控DT生成量。

DT交联天然存在于几种弹性和结构蛋白中,有利于提高其机械强度和不溶性[57]。OMAR等[58]利用强氧化剂FeCl3/H2O2处理酵母营养细胞、野生型孢子(含DT层)和dit1Δ孢子(DT层缺陷型),发现三者存活率分别降至0、60%、28.55%,表明DT交联可赋予孢子强抗氧化活性,在抗氧化材料的应用和开发中具有一定潜力。过量的DT交联不利于小麦面团的加工特性。如添加1 g/kg葡萄糖及37 U/kg葡萄糖氧化酶后,小麦面团中DT含量从1.2～1.4 nmol/g增至1.7～2.0 nmol/g,引起面团弹性下降、质地较硬、成型性差[59]。

不容忽视的是,DT交联与低密度脂蛋白胆固醇的形成正相关,不利于机体的心血管和肝脏功能[60]。

1.5 异肽键交联机理及应用研究

如图7所示,Lys的ε-NH2与谷氨酰胺和天冬酰胺的CO—NH2基团发生缩聚反应即形成异肽键交联[61]。异肽键交联需要借助特定酶催化才能实现,已有相关研究设计与表征可自催化异肽键形成的蛋白质[62]。异肽键具有良好的热稳定性和抗逆能力,而常规氨基酸分析涉及所有肽键的酸水解,无法用于鉴定异肽键[63],采用特异性蛋白酶水解也许可克服传统酸水解的劣势,实现异肽键的定量检测[1]。

在面制品加工中,热处理可诱导谷蛋白聚集,该聚集不仅由二硫键引起,亦有异肽键的作用,且异肽键的形成水平随加热时间延长而增加[63-64]。除热处理外,转谷氨酰胺酶也可催化异肽键的生成[65],但过度交联会引发蛋白质消化率降低,影响蛋白质的营养价值[66]。酶促耦合超声处理可催化蛋白质的Lys残基与谷氨酰胺残基形成ε-(γ-谷氨酰)-赖氨酸交联(异肽键交联);蛋白质分子内部的亲水性基团因交联被包埋,疏水基团暴露,蛋白质表面疏水性增加,乳化性提高[67]。

此外,异肽键优异的稳定性使其在抗菌肽[68]、蛋白质水凝胶[69]等领域均有相关应用,如陈旭等[70]以不同浓度转谷氨酰胺酶与白鲢鱼鳞抗冻多肽制备鱼糜凝胶,冻藏28 d后发现添加量0.05%酶+2.0%多肽组较空白对照组自由水减少63.25%,孔隙率最小(约27%),此时凝胶持水性最强,网络结构最致密,形态完整。

1.6 其他类型的共价交联

在食品加工过程中,脂质氧化衍生交联、羰基化氨基酸衍生交联也较常见。脂质经热处理或长期贮存后氧化产生脂质氢过氧化物,最终生成多种多样的羰基化合物,如GO、MGO、丙烯醛等,这些羰基化合物可与Lys、Arg、组氨酸、谷氨酸等反应生成脂质氧化衍生物[1]。在检测脂质氧化衍生物时,脂质氧化衍生交联与美拉德反应存在相同的中间体(GO、MGO等)与修饰位点(Lys、Arg等),因此需注意AGEs对检测结果的干扰。脂质氧化衍生物在影响牛肉和兔肉肌纤维蛋白持水性[71]、改善乳制品理化及消化特性[72]等方面均有相关报道。

蛋白质在氧化过程中,部分氨基酸如Lys会发生羰基化反应,羰基化的Lys相互之间会发生羟醛缩合反应,羰基化的Lys亦会与Lys的ε-NH2和其他氨基酸的α-NH2反应分别生成甲亚胺和席夫碱类产物;这些衍生物影响着肉类的质构、持水性、风味和营养价值,也被作为蛋白质氧化的标志物[73]。

已报道文献多聚焦于二硫键交联、美拉德反应交联和脱氢蛋白质衍生交联,且往往仅关注1种或2种共价交联,但在食品中多种蛋白质共价交联往往共存,因此应综合考虑,为蛋白质聚集等研究提供更加科学、全面的理论知识。

2 不同共价交联类型间相关性研究

二硫键交联生成量与脱氢蛋白质衍生物生成量具有一定负相关性,这是由于半胱氨酸可用于合成胱氨酸,亦可与二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)加成生成LAN,半胱氨酸是胱氨酸和LAN生成共同的前体物质,二硫键交联与脱氢蛋白质衍生交联路径具有竞争性;此外,胱氨酸可作为DHA生成的前体物质,继而DHA可与半胱氨酸和Lys加成分别生成LAN和LAL,胱氨酸的消耗有利于脱氢蛋白质衍生物的形成(图8)。如ROMBOUTS等[74]发现小麦醇溶蛋白在pH 8.0、130 ℃加热120 min后,胱氨酸含量由84 μmol/g降至51 μmol/g,而游离巯基、DHA、LAN含量由0分别增至5、14、36 μmol/g。

此外,因反应物均需Lys参与,脱氢蛋白质交联、美拉德交联、异肽键交联、脂质氧化衍生交联和羰基化氨基酸衍生交联间相互均有竞争性。如NIELSEN等[75]对酪蛋白胶束-乳清蛋白复合体系进行121 ℃加热,引入乳糖后发现体系的Lys和LAL含量显著下降,反之,糠醛、CML、CEL含量显著上升,其中CML含量激增189倍。

当前报道主要涉及二硫键交联、美拉德交联和脱氢蛋白质交联之间的相关性,对于涉及其他种交联间的相关性研究鲜有报道。

在食品体系中,多种蛋白质共价交联类型往往共存,占主导地位的共价交联类型与反应体系组成和加工条件密切相关。如60 ℃加热α-乳清蛋白体系,发现蛋白质共价交联以二硫键为主,引入葡萄糖后,测得体系的二硫键含量大幅下降,但果糖-赖氨酸、CML和CEL等美拉德反应产物含量大幅上升,表明此时蛋白质共价交联以美拉德反应交联为主[5]。在110～130 ℃下加热小麦醇溶蛋白体系,当体系pH值为6和8时,醇溶蛋白聚集体形成速率是胱氨酸发生β-消除反应速率的45和15倍,此时二硫键交联主导醇溶蛋白聚集体的形成,但随着加热时间延长或体系pH值升高,主导共价交联类型可能转变为脱氢蛋白质衍生交联[47]。

3 总结与展望

该文对食品中常见的5种蛋白质共价交联类型进行了综述和讨论,并尝试对不同共价交联类型的相关性进行了总结。通过调控共价交联类型及含量可定向改善蛋白质的理化、功能特性及营养价值,为绿色、美好高蛋白食品的开发提供新的技术路径,然而部分关键科学问题仍待探明:共价交联与非共价交联对蛋白质聚集行为的影响机制;食品原料组成和加工工艺对不同类型共价交联含量的影响规律;共价交联的种类、含量对蛋白质结构、功能性的影响机制;有害交联产物的控制策略等。

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