长双歧杆菌长亚种CCFM1113和青春双歧杆菌CCFM1386复合益生菌对糖尿病前期小鼠代谢和肠道菌群的影响

糖尿病是一种慢性代谢紊乱,其特征是胰岛素分泌不足或胰岛素调节功能障碍;近年来由于糖尿病患病率不断上升,预防和治疗糖尿病已成为一项巨大的公共卫生挑战[1]。研究发现,其中超过90%的糖尿病病例为二型糖尿病(type Ⅱ diabetes mellitus,T2DM)[2]。糖尿病前期是T2DM的早期阶段,其特征是血糖水平超过正常范围,但仍低于T2DM的诊断阈值[3]。许多研究已经确定糖尿病前期是预防或逆转T2DM的关键阶段,每年大约有5%～10%的糖尿病前期患者发展为T2DM[4]。因此,解决糖尿病前期发展问题对于降低患糖尿病的风险至关重要。

研究表明,肠道菌群在调节糖代谢和影响糖尿病发生发展中扮演着至关重要的角色,菌群丰度的变化与疾病的发生和发展有关[5]。LUC等[6]发现,胰岛素抵抗个体的肠道菌群多样性降低,尤其是产丁酸盐的细菌显著减少。益生菌能够通过调节肠道菌群促进宿主健康。目前已经确定了几株具有不同抗糖尿病作用的益生菌[7-8]。研究发现,长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp. longum)APC1472能够改善高脂饮食(high fat diet,HFD)诱导的小鼠体重增加和葡萄糖耐量等[9]。青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)对降低空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)和缓解胰岛素抵抗显示出巨大的潜力[10]。已有研究将复合益生菌用于临床实验,研究发现复合益生菌具有降血糖作用,且能够促进胆汁酸生成[11]。

在本实验室前期的人群实验中,已经筛选出了几株有助于缓解糖尿病前期的菌株[12],其中2株效果最好的菌株为长双歧杆菌长亚种CCFM1113和青春双歧杆菌CCFM1386。我们假设将这2株菌进行复配能够协同增效,可能会产生“1+1>2”的效果,因此进行了这项研究,通过构建糖尿病前期小鼠模型,以评估复合益生菌在糖尿病前期的治疗潜力并阐明其潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选取4周龄,体重在18～20 g的无特定病原体级C57BL/6J雄性小鼠作为实验小鼠,北京维通利华实验动物技术有限公司;60%的高脂饲料(TP23300)和10%的低脂对照饲料(TP23302)分别作为模型组和空白组饲料,南通特洛菲饲料科技有限公司。

本研究所用菌株均来自江南大学生物技术中心微生物菌种保藏中心(Culture collection of food microorganisms,CCFM)。菌株信息见表1。

链脲佐菌素(streptozotocin,STZ),美国Sigma公司;4%多聚甲醛固定液,上海碧云天生物技术有限公司;柠檬酸钠缓冲液(0.1 mol/L,pH 4.5),博飞美科有限公司;谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)检测试剂盒,美国贝克曼-库尔特公司;胰岛素检测试剂盒,Proteintech中国公司;其他试剂,国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ZHJH-C1115B超净工作台,上海智诚分析仪器制造有限公司;罗氏活力血糖仪、血糖试纸,罗氏有限公司;ME3002E电子天平、ME204E分析电子天平,瑞士梅特勒-托利多有限公司;MX-S涡旋混匀仪,北京大龙兴创实验仪器有限公;Thermo-994超低温冰箱,美国赛默飞科技有限公司;SX-500高压蒸汽灭菌锅,日本Tomy公司;400TG厌氧工作站,英国Eletrotek公司;数字切片扫描仪,匈牙利3DHISTECH公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌悬液的制备

长双歧杆菌长亚种CCFM1113菌悬液的制备方法[13]:将冻存于-80 ℃的长双歧杆菌长亚种取出后,在超净台里以4%的接种量接入含有0.5 g/L L-半胱氨酸的MRS液体培养基中,置于37 ℃的厌氧箱中培养18～24 h,随后平板划线并挑选单菌落至液体培养基中,液体培养一代后,进行菌种保藏和鉴定,确保鉴定无误后重新活化,活化2次后进行扩大培养,培养条件同上,随后将菌液在8 000 r/min下离心15 min,并用含0.5 g/L L-半胱氨酸的9 g/L无菌生理盐水洗菌2次,最后进行平板活菌计数,并使用含0.5 g/L L-半胱氨酸的无菌生理盐水将菌液稀释至1×109 CFU/mL。

青春双歧杆菌CCFM1386菌悬液的制备方法[14]:除每次接种后在37 ℃的厌氧箱中培养时间为24～36 h外,其余步骤与上述长双歧杆菌长亚种菌悬液制备方法相同。

1.3.2 动物实验设计

动物实验方案经江南大学动物伦理委员会审查并批准(JN.No20230315c1200710[086])设计见图1。小鼠饲养在江南大学动物实验中心屏障(饲养环境温度20～26 ℃,相对湿度40%～70%,12 h明暗交替循环)。每周同一时间更换饮水和笼具,每隔2～3 d更换1次饲料,所有小鼠自由进食进水。

造模方法参考WANG等[15]的方法并适当修改。适应一周后,随机选择6只小鼠喂食低脂对照饮食(low fat diet,LFD),并作为空白组,20只小鼠喂食HFD(60%脂肪)42 d。第43天,对20只喂食HFD的小鼠腹腔注射30 mg/kg STZ,对空白组腹腔注射0.1 mL柠檬酸钠缓冲液(0.1 mol/L,pH 4.5)。在注射后第21天进行口服糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT),在此期间各组饮食保持不变。共有12只小鼠糖尿病前期模型构造成功(OGTT试验中FBG水平低于7.8 mmol/L,2 h血糖水平介于7.8～11.1 mmol/L),将其随机分为2组,包括模型组、长青复合组,每组6只,并继续喂食HFD,而空白组继续喂食LFD。从第10周开始直至15周,空白组和模型组灌胃无菌生理盐水,干预组灌胃长青复合菌悬液[长双歧杆菌长亚种CCFM1113(1×109 CFU/mL)、青春双歧杆菌CCFM1386(1×109 CFU/mL)以1∶1的比例混合][16],每只小鼠灌胃体积均为0.2 mL。在第15周进行了OGTT试验,在第16周安乐死小鼠,收集小鼠血清及肝脏、胰腺组织,结束实验。

1.3.3 小鼠体重、血糖及胰岛素相关指标测定

在动物实验期间,每周记录1次小鼠的体重。

在STZ注射后3周和后9周进行血糖测定:小鼠禁食不禁水12 h后,腹腔注射30 mg/kg的STZ溶液(用0.1 mol/L、pH 4.5柠檬酸缓冲溶液配制,置于冰上),1周后,使用血糖仪测定小鼠空腹血糖并进行OGTT试验。小鼠禁食12 h后,取小鼠尾尖血测量FBG,之后根据小鼠的体重,按2 g/kg的剂量给小鼠灌胃葡萄糖,进行OGTT试验,在小鼠口服葡萄糖0.5、1、1.5、2 h后分别测量血糖浓度。

使用小鼠胰岛素ELISA试剂盒检测小鼠空腹血清胰岛素含量。并通过公式(1)计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR):

式中:HOMA-IR,胰岛素抵抗指数;FIN,空腹血清胰岛素,μU/mL;FBG,空腹血糖,mmol/L。

1.3.4 组织病理学分析

用4%多聚甲醛溶液固定肝脏、胰腺。组织切片经洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后,用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染液对3 mm厚的石蜡切片染色。观察肝脏、胰腺组织学切片,并使用数字载玻片扫描仪分别以200×的放大倍数进行扫描。

1.3.5 肝功能评估

使用自动生化分析仪测定血清ALT和AST的浓度。

1.3.6 宏基因组测序

小鼠处死前一天,将粪便收集在无菌离心管中,并储存在-80 ℃用于后续的宏基因组测序。宏基因组测序在北京诺禾致源科技股份有限公司的DNBSEQ-T7平台完成。将获得的原始数据进行过滤,并使用Bowtie 0.7.17、samtools 1.9和bedtools 2.30将过滤后的序列与小鼠参考基因组进行比较,以消除宿主来源的基因[17]。

使用Shannon、Simpson和Richness指数评估α多样性,β多样性则通过在线平台(https://www.bioincloud.tech/)的基于Bray-Curtis距离的非度量多维尺度(non-metric multidimensional scaling,NMDS)分析进行可视化,以衡量组间的群落组成差异。在同一平台上进行基于线性判别分析(linear discriminant analysis,LDA)的效应量(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)分析,以确定各组之间差异物种。

1.4 数据处理

数据均以“平均值±标准差”表示。多组间的差异采用ANOVA和Dunnett’s多重检验进行分析。当P<0.05时,数据有显著差异(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1)。使用GraphPad Prism(版本9.5)软件进行统计分析并绘图。

2 结果与分析

2.1 复合益生菌对糖尿病前期小鼠表观指标的影响

如图2-a所示,与空白组相比,模型组体重具有显著差异,表明糖尿病前期小鼠体重显著上升(P<0.000 1),造模成功;而与模型组相比,长青复合组体重显著下降(P<0.05),表明长青复合益生菌对HFD引起的体重增加具有一定的抵抗作用。肝脏/体重比值在一定程度上反应了肝脏脂肪含量,如图2-b所示,与模型组相比,长青复合组能够显著抑制肝脏脂肪的产生(P<0.05)。

2.2 复合益生菌对糖尿病前期小鼠血糖代谢和胰岛素抵抗的影响

2.2.1 复合益生菌对糖尿病前期小鼠糖代谢的影响

通过OGTT实验来确定长青复合益生菌对糖尿病前期小鼠血糖代谢的影响。如图3-a,与空白相比,模型组中各个时间点的血糖值均升高,较之模型组,长青复合组能够抑制餐后血糖的增加,在一定程度上可以调节糖尿病前期小鼠的血糖代谢。如图3-b所示,复合益生菌显著降低了空腹血糖(P<0.000 1)。OGTT实验得到的葡萄糖曲线下面积(area under curve,AUC)表明,与空白组相比,模型组AUC显著上升(P<0.000 1),而经过干预后,AUC显著降低(P<0.01),这表明长青复合益生菌能够显著提高糖尿病前期小鼠葡萄糖耐受能力。

2.2.2 复合益生菌对糖尿病前期小鼠胰岛素抵抗的影响

通过ELISA测定小鼠空腹血清胰岛素含量。结果发现,与空白组相比,模型组的空腹血清胰岛素含量显著升高(P<0.01),而长青复合益生菌干预能够在一定程度上降低空腹血清胰岛素含量(图4-a)。此外,HOMA-IR结果表明,模型组相较于空白组,HOMA-IR显著升高(P<0.000 1),而在利用长青复合益生菌干预后,HOMA-IR显著降低(P<0.001)(图4-b)。以上结果表明长青复合益生菌对糖尿病前期小鼠的胰岛素抵抗症状具有缓解作用。

2.3 复合益生菌对糖尿病前期小鼠肝脏和胰腺病理及肝功能的影响

2.3.1 复合益生菌对糖尿病前期小鼠肝脏和胰腺组织病理的影响

通过HE染色对肝脏和胰腺组织切片进行病理特征评估,如图5所示。相较于空白组,模型组小鼠肝脏出现大量的网状空隙,并伴随着密集的圆形空泡区域,如黑色箭头所示,且视野内>50%的肝细胞胞质内存在圆形空泡,可见细胞变形坏死,炎症细胞浸润。长青复合组小鼠肝细胞胞质内空泡数量与模型组相比明显减少(图5-a)。此外,空白组胰岛完整,细胞可见,模型组胰岛受损,如黑色箭头所示,且细胞数量减少;值得注意的是,与模型组相比,长青复合组的小鼠胰岛损伤减轻(图5-b)。上述实验结果表明,复合益生菌干预对肝脏和胰腺组织具有一定的保护作用。

2.3.2 复合益生菌对糖尿病前期小鼠肝功能的影响

通过生化分析仪测定了小鼠血清ALT和AST含量。ALT升高与肝脂质积累和胰岛素抵抗密切相关[18]。AST是参与肝损伤的非特异性酶[19]。如图6所示,相较于空白组,模型组血清ALT含量和AST含量显著上升(P<0.001),表明其肝功能受到了明显的损害。而与模型组相比,干预组的血清ALT和AST含量显著下降(P<0.05)。上述结果表明复合益生菌的干预对肝功能有明显的保护作用。

2.4 复合益生菌对糖尿病前期小鼠肠道菌群的影响

研究发现,糖尿病前期的发生和发展与肠道菌群紊乱有关,恢复肠道菌群结构和保持稳态有助于缓解糖尿病前期[20]。为了研究长青复合益生菌对小鼠肠道菌群多样性的影响,采用α和β多样性指数进行评估。如图7-a～图7-c所示,通过Shannon、Simpson和Richness指数评价糖尿病前期小鼠肠道菌群α多样性。与空白组相比,模型组α多样性升高,表明模型组肠道菌群丰富度更高,推测可能是HFD结合STZ导致小鼠肠道菌群平衡被破坏,结构发生紊乱,进而造成α多样性升高[21];而较之模型组,干预组小鼠的肠道菌群α多样性显著升高,表明复合益生菌的干预有助于增加肠道菌群多样性。如图7-d所示,β多样性分析结果表明,与空白组小鼠相比,模型组小鼠的肠道菌群发生显著变化。小鼠在口服长青复合益生菌后,肠道菌群结构均呈现出向正常肠道菌群转变的趋势,表明长青复合益生菌对菌群结构紊乱发挥了一定的调节作用。为了探究复合益生菌对糖尿病前期小鼠肠道菌群物种组成的影响,选取每组相对丰度位于前20的物种做分组百分比堆积柱形图,如图7-e所示。HFD结合STZ造模后,小鼠啮齿粪杆菌(Faecalibaculum rodentium)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)及鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus)等物种相对丰度增加,假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)等物种相对丰度降低。同时,长青复合益生菌的干预,降低了啮齿粪杆菌的相对丰度,且增加了假长双歧杆菌的相对丰度。

为了找到复合益生菌干预引起肠道菌群变化的差异物种,进行了LEfSe分析。如图8-a、图8-b所示,在种水平上,比较了空白组和模型组的差异物种,空白组特征物种包括假长双歧杆菌长亚种和嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)等,模型组特征物种包括啮齿粪杆菌、鼠乳杆菌等;对比模型组和长青复合组的差异物种发现,假长双歧杆菌、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)等是长青复合组的特征物种。为了分析特定肠道细菌与代谢健康相关临床指标之间的关系,选取模型组和长青复合组中相关程度最高的前15个物种,绘制相关性热图,图8-c显示,啮齿粪杆菌与FBG、AUC及HOMA-IR呈显著正相关,表明啮齿粪杆菌可能导致血糖调节紊乱,而梭菌ASF502(Clostridium_sp_ASF502)、假长双歧杆菌和单形拟杆菌与FBG和HOMA-IR呈显著负相关,表明其有助于血糖代谢和缓解胰岛素抵抗。因此,长青复合组有助于通过增加与调节代谢紊乱相关的有益菌的相对丰度,来缓解糖尿病前期。

3 结论与讨论

本研究通过HFD结合低剂量STZ成功创建了糖尿病前期模型,持续的HFD会导致肥胖和糖尿病前期的发展[22]。益生菌作全球应用最为广泛的营养补充剂之一,在改善血糖方面已显示出有效性。YANG等[23]的研究发现补充普拉梭菌能够通过影响肠脑轴来调节肠道菌群和神经激素的分泌并降低食欲,从而减少高脂饮食诱导的小鼠体重增加,这与本研究结果一致。

除了HFD引起的体重增加以外,血糖水平、胰岛素抵抗和肝功能等指标也是糖尿病前期的危险因素。通过测定血糖相关指标,本研究发现长青复合益生菌能够直接改善糖尿病前期小鼠的糖代谢。另一方面,胰岛素抵抗是指组织对胰岛素介导的细胞对葡萄糖的摄取和利用等生物活性的敏感性或反应性降低,从而导致高血糖水平,这是糖尿病前期的主要危险因素之一[24]。空腹血清胰岛素含量反映了胰岛素在体内的基础水平,这对于了解胰岛素的分泌情况和胰岛素调节功能至关重要。长青复合益生菌具有降低胰岛素抵抗的功能。研究发现,长期HFD可能导致肝脏脂肪堆积和肝功能异常,进而影响血糖代谢和胰岛素敏感性[25]。高血糖会破坏肝细胞,导致糖尿病死亡率增加[26]。长青复合益生菌有助于减少肝脏损伤,并能够显著降低评估肝细胞损伤的生化标志物[27]——血清AST和ALT含量,进而保护肝功能。

肠道菌群与代谢紊乱特别是糖尿病显著相关,因此,益生菌干预是一种通过调节肠道菌群从而改善糖尿病症状的有效策略。在改善肠道菌群方面,长青复合益生菌表现出优良的效果,能够促进有益菌的增殖,如单形拟杆菌等,研究发现,单形拟杆菌能够通过肠-肝轴调节胆汁酸代谢,改善糖尿病小鼠的脂质代谢紊乱[28]。为了进一步探究复合益生菌调节肠道菌群的潜在机制,将差异物种丰度与环境因子之间的相关性进行可视化,发现复合益生菌能够富集与调节糖代谢紊乱相关的有益菌,其中关键菌包括梭菌ASF502和假长双歧杆菌等。研究发现,补充梭菌属细菌能够显著改善他汀类药物诱导的小鼠糖耐量异常,一方面其能够增加血清胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)水平,另一方面又能调节粪便胆汁酸代谢,促进鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)向熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)转化,最终改善葡萄糖稳态[29]。

综上所述,长双歧杆菌长亚种CCFM1113和青春双歧杆菌1386复合益生菌能够显著减轻糖尿病前期小鼠的体重增加、调节血糖代谢、改善糖耐量和胰岛素抵抗;进一步研究发现,长青复合益生菌对肝脏和胰腺具有保护作用。宏基因组测序发现,长青复合益生菌有助于增加肠道菌群多样性,恢复肠道菌群结构,并富集有益菌的生长。本研究为开发适合糖尿病前期病人的膳食配方提供了重要基础,并为糖尿病预防和管理提供一种新的方法。同时,为了提高本研究的严谨性并进一步阐明机制,未来将在动物实验中增设长青单菌干预组,以明确各菌株的贡献及协同作用,并进行多组学分析,深入探讨机制。

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