饮酒在全球范围内普遍存在,我国更有着悠久的饮酒文化。世界卫生组织(World Health Organization,WHO)近日报告称,全球约有24亿人饮酒,其中9.6亿人属于重度饮酒者[1]。长期过量摄入酒精会严重损害肝脏代谢功能,其通过诱导脂质过氧化反应削弱机体抗氧化能力[2],引起肝组织形态和功能的改变、氧化应激及免疫系统的异常应答,最终导致了酒精性肝损伤(alcoholic liver injury,ALI)[3]。具体来说,摄入乙醇后,活性氧(reactive oxygen species,ROS)会损伤肝细胞,同时肠道内毒素会激活库普弗细胞,还会引发白细胞浸润,这些因素共同作用导致肝脏产生氧化应激。此外,乙醇还会通过干扰电子传递链蛋白的结构与功能,导致其活性异常,增加线粒体ROS的产生,进一步导致的线粒体功能障碍加剧。乙醇诱导的氧化应激还会通过抑制谷胱甘肽(glutathione,GSH)穿过线粒体膜的转运,降低肝脏线粒体中GSH的水平。TNF-α,在ALI的发病机制中,也起着至关重要的作用[4]。目前临床治疗ALI仍以美他多辛、水飞蓟素等药物为主,但其应用因伴随胃肠道反应等副作用而面临患者依从性低的挑战[5]。因此,探寻安全、有效、无副作用的防治ALI的策略至关重要。

目前,以古方中草药为基础、结合现代化手段开发的解酒产品[6],因低毒副作用等优势成为市场主流。据报道,药食同源植物葛根对ALI具有保护作用[7]。葛根中含有的黄酮类物质是被普遍认可的治疗预防ALI的中药有效成分,故亟待对其研究开发活性成分含量高、低副作用的解酒保肝产品[8]。通过采用不同的提取方法从葛根中提取得到的黄酮类化合物,主要成分包括葛根素、大豆苷元等。现代药理研究进一步证实,葛根不仅能预防醉酒、缓解醉酒症状,还对酒精所致的肝损伤具有保护作用[9]。

中药发酵技术是一种新起的中药处理方法,在特定环境下可利用酶与微生物的作用,降低中药的毒性,增强药理活性,甚至赋予传统药材新的功能。近年来,利用益生菌进行中药发酵的研究得到了极大的关注。微生物发酵中药能提高有效成分的含量,产生新化合物及减少不良反应,促进有效成分吸收和利用,是现代生物技术与中医药相结合的理想途径。其中,植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)可以对多种植物基食品进行发酵,适用于各种植物性食品。它能够分解植物中的膳食纤维、蛋白质和维生素等成分,提升这些化合物的生物利用率和活性[10]。FENG等[11]发现,植物乳植杆菌TK9和副干酪乳酪杆菌TK1501发酵的苦荞麦具有良好的抗氧化活性。付依依等[12]研究发现,植物乳植杆菌的发酵过程可以使沙棘原浆的成分、抗氧化能力以及挥发性物质发生变化。然而,植物乳植杆菌发酵葛根的复方体系对ALI的调节机制尚不明确[13]。

本研究前期从发酵豆酱中筛选出具有多重益生作用的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum FS5-5),动物实验表明其对ALI具有显著缓解作用[14]。鉴于其突出的益生优势,本研究选用植物乳植杆菌 FS5-5 作为发酵菌种,对葛根提取液(pueraria lobata extract,PE)进行发酵处理;在此基础上,进一步系统评估了发酵前、后PE中功能成分的变化,以及其解酒保肝功效,为功能性解酒护肝产品的开发提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

实验动物:5周龄健康,无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级昆明小鼠(雄性,体质量20～22 g),购买于长生生物技术股份有限公司,获实验单位使用许可证编号:SYXK(辽)2021-0010。本实验受实验伦理审查委会监督实施,且符合动物实验伦理学要求,得到沈阳农业大学实验动物伦理委员会的批准(批准号:NO.2023102702)。

植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum FS5-5)分离于中国的天然发酵豆酱中,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为:CGMCC 10331。葛根饮片,德草堂传统中药房;海王金樽(主要成分为牡蛎提取液),深圳市海王健康科技发展有限公司。

Al(NO3)3、K2S2O8、DPPH、Na2CO3、ABTS、NaNO2、水杨酸、没食子酸、柠檬酸、没食子酸、NaOH、FeSO4、无水乙醇、双氧水,佰境生物技术有限公司;福林酚试剂、PBS(pH 7),北京索莱宝科技有限公司;谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、GSH、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒,南京建成生物工程研究所;乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)、乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)、TNF-α、IL-6、小鼠IL-1β酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒,南京建成生物工程研究所;乙醇含量测定试剂盒,苏州科铭生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1D超净工作台,苏州净化设备有限公司;JY-502电子分析天平,波兰RADWAG公司;HC-3018R高速离心机,美国热电Thermo公司;DHP-9080电热恒温培养箱,上海博讯实业有限公司;ELX-800酶标仪,美国BIOTEK公司;PHS-3CPH计,北京仪电科学仪器厂;mLS-3780压力蒸汽灭菌锅,日本三洋公司;UV-2100紫外分光光度计,龙尼柯(上海)仪器有限公司;DP73显微镜,日本OLUMPUUS公司;YF500中药打粉机,瑞安市永历制药机械有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 葛根浓缩液的制备

先对原料进行预处理,选取无霉变、无虫蛀的葛根饮片,清洗后在60 ℃条件下烘干至恒重。再粉碎葛根,过80目筛,随后进行活性成分提取。采用回流提取法,向葛根中加入6倍于生药量的体积分数60%乙醇溶液,80 ℃下搅拌,回流60 min[8],提取2次,合并提取液然后60 ℃旋转蒸发至无乙醇,浓缩至0.21 g /mL(生药质量浓度)的浓缩液。

1.3.2 PE的制备

葛根浓缩液:MRS培养基(体积比1∶4[8]),然后在121 ℃,灭菌20 min,冷却至室温,避光保存,得到PE。

1.3.3 植物乳植杆菌FS5-5发酵葛根提取液(fermented pueraria lobata extract by Lactiplantibacillus plantarum FS5-5,FPE5)的制备

植物乳植杆菌FS5-5的活化:自80 ℃超低温冰箱内取出经甘油保存的菌株,予以解冻处理;利用无菌接种环,将菌株以划线方式接种至MRS固体培养基,并在37 ℃恒温培养箱内倒置培养过夜;次日,使用接种环从平板上挑选单个菌落,接种到MRS液体培养基中,充分混匀后进行标记,并在37 ℃、900 r/min的恒温混匀仪上培养24 h以活化菌株,保存备用。制作PE方法参照1.3.2节,备用。发酵:基于1.3.2节中制备的PE,采用液体发酵的方式,按单因素试验及正交试验所需,先对PE用柠檬酸调节所需的初始pH值,再接种不同比例的植物乳植杆菌FS5-5,在摇床37 ℃,200 r/min,按照所需时间进行发酵。

在进行单因素试验时,固定其他2个因素在基础水平(pH 6.0,接种量4%,发酵时间24 h),分别考察初始pH值、接种量和发酵时间对黄酮含量的影响。先用柠檬酸对PE调节pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0),接种选用活化后的植物乳植杆菌FS5-5做为发酵菌种,接种到PE中(接种量分别为1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%),进行发酵。其中发酵温度37 ℃、发酵时间分别为6、12、18、24、30、36、42、48 h。最终得到FPE5。

1.3.4 正交试验设计

在单因素试验的基础上,以初始pH值(A)、接种量(B)、发酵时间(C)为试验因素,选择黄酮含量为核心指标,因其是葛根解酒护肝的关键活性成分,所以以黄酮含量为评价指标,采用L9(33)正交设计试验,因素与水平见表1。

1.3.5 活性成分的测定

1.3.5.1 黄酮含量的测定

参照比色法[15]测定总黄酮含量,具体步骤如下:以无水乙醇配制质量浓度为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2 mg/mL的芦丁标准溶液,按以下步骤测定吸光度(optical density,OD):取上述标准溶液0.1 mL,加入0.3 mL质量浓度0.05 g/mL的NaNO2溶液,摇匀后放置5 min;再加入0.3 mL质量浓度0.1 g/mL的硝酸铝溶液,反应6 min;随后加入2 mL 1 mol/L NaOH溶液,摇匀,静置15 min,在510 nm处测定OD值。以芦丁为标准品,得到标准曲线为y=0.006 1x+0.013(x-芦丁浓度,μg/mL;y-OD510 nm),R2=0.997 5。对待测样品按上述方法测定,测定均独立重复3次,将测得的OD值代入标准曲线方程计算。黄酮含量(total favonoid content,TFC)的计算如公式(1)所示。

(1)

式中:C,标准曲线求得黄酮的质量浓度,μg/mL;V,样品测定液的定容体积,mL;N,稀释倍数;M,样品原液体积,mL。

1.3.5.2 总酚含量的测定

采用福林酚比色法测定,准确称取5 mg没食子酸对照品于烧杯中,用适量蒸馏水超声波溶解,转移至100 mL棕色容量瓶中定容至刻度,制备0.05 mg/mL对照品储备液。精确地量取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6 mL的对照品储备液,转移到25 mL的棕色容量瓶里,加入20 mL的蒸馏水和0.5 mL的福林酚试剂后搅拌均匀,放置5 min,再加入1 mL质量浓度0.15 g/mL的Na2CO3溶液,再次搅拌均匀,用蒸馏水定容至25 mL。在室温下放置30 min后,以不含没食子酸但经过相同处理的溶液作为空白对照,在765 nm波长处测量OD值。回归方程为y=0.057 4x-0.003 3(x-没食子酸质量浓度,μg/mL;y-OD765 nm),R2=0.996 7。待测样品按上述方法平行测定3次,将测得的OD值代入标准曲线方程。总酚含量(total phendic content, TPC)的计算如公式(2)所示。

(2)

式中:C,标准曲线求得总酚的质量浓度,μg/mL;V,样品测定液的定容体积,mL;N,稀释倍数;M,样品原液体积,mL。

1.3.6 抗氧化活性的测定

1.3.6.1 DPPH自由基清除能力的测定

先吸取2 mL样品加2 mL 0.2 mmol/L DPPH试剂,置于室温下避光反应30 min后,在517 nm处检测OD值,每个样品测定均独立重复3次,DPPH自由基清除率的计算如公式(3)所示。

(3)

式中:W,DPPH自由基清除率,%;A1,DPPH溶液加无水乙醇的OD值;A2,DPPH溶液中加样品反应后的OD值;A3,无水乙醇中加入样品溶液的OD值。

1.3.6.2 ABTS阳离子自由基清除能力的测定

将等体积的ABTS(7.4 mmol/L)与K2S2O8(2.6 mmol/L)溶液混合,在室温黑暗条件下静置12 h以产生自由基,然后用体积分数95%乙醇稀释。在734 nm处的OD值为(0.70±0.02),即得ABTS阳离子自由基工作液。样品溶液0.1 mL,分别加入3.9 mL ABTS阳离子自由基工作液,混合均匀后于室温下避光孵育10 min,测定OD734nm值,每个样品测定均独立重复3次。ABTS阳离子自由基清除率的计算如公式(4)所示。

(4)

式中:W,ABTS阳离子自由基清除率,%;A1,样品溶液与ABTS工作液混合后的OD值;A2,空白组(体积分数95%乙醇与ABTS工作液混合后)的OD值。

1.3.6.3 羟自由基(·OH)清除能力的测定

配制FeSO4溶液(9 mmol/L),乙醇-水杨酸溶液(9 mmol/L)、双氧水溶液(8.8 mmol/L),取1 mL乙醇-水杨酸溶液,加入1 mL FeSO4溶液,再加入1 mL双氧水溶液、1 mL样品溶液,混匀后于37 ℃静置30 min,在510 nm处测定OD值,每个样品测定均独立重复3次。·OH清除率的计算如公式(5)所示。

(5)

式中:W,·OH清除率,%;A1,羟基混合溶液加超纯水的OD值;A2,羟基混合溶液中加样品后的OD值;A3,超纯水中加入样品溶液的OD值。

1.4 动物实验方法

1.4.1 动物饲养条件

所有小鼠均在SPF级、室温(25±1) ℃、12/12 h明暗循环的环境中饲养,实验前小鼠适应性饲养7 d后进行分组,用苦味酸对称重后的不同组小鼠做标记。

1.4.2 小鼠灌酒剂量的确定

购买的健康雄性昆明小鼠适应性饲养7 d后,禁食不禁水12 h,随机分为5组(n=10),各组小鼠分别按8、10、12、14、16 mL/kg灌胃体积分数50%乙醇溶液。具体灌胃操作如下:固定于上午9:00进行灌胃操作,每只小鼠灌胃时间约为40 s,灌胃总时长不超过30 min。灌胃操作后,监测小鼠的醉酒情况,记录下小鼠的醉酒数目和死亡状况,选取醉酒数目最多且致死率最小的灌酒剂量来开展后续的实验。

1.4.3 建模小鼠分组情况

根据《中国药典》(2020年版),经换算临床剂量为0.17～0.25 g生药/kg。本研究以0.28 g生药/kg作为中剂量,并以此为基准,设置低、中、高3个剂量组,进行动物实验。购买的健康雄性昆明小鼠先适应性饲养7 d后,禁食不禁水12 h,随机分为7组(n=10):NC组(正常对照组,10 mL/kg生理盐水)、ETOH组(酒精模型组,10 mL/kg生理盐水+递增乙醇)、PE组(葛根提取物组,0.42 g生药/kg,灌胃剂量10 mL/kg+递增乙醇)、FL组(FPE5-L发酵葛根低剂量组,0.14 g生药/kg,灌胃剂量10 mL/kg+递增乙醇)、FM组(FPE5-M发酵葛根中剂量组,0.28 g生药/kg,灌胃剂量10 mL/kg+递增乙醇)、FH组(FPE5-H发酵葛根高剂量组,0.42 g生药/kg,灌胃剂量10 mL/kg+递增乙醇)及PC组(阳性对照组,海王金樽0.8 g/kg[13],灌胃剂量10 mL/kg+递增乙醇)。分组情况如图1所示。

灌胃期间,按照小鼠体重进行给药,整个动物实验干预周期为30 d,且处理与1.4.2节中保持一致。造模采用酒精剂量递增的方式:前15 d,每日首次灌胃中,NC组和ETOH组给予生理盐水,其余各组灌胃相应样品,剂量均为10 mL/kg;30 min后进行第2次灌胃,除NC组外,其他组均灌胃体积分数50%的乙醇溶液,剂量为8 mL/kg。后15 d,首次灌胃操作同前,第2次灌胃则将所有非NC组的乙醇灌胃剂量增至12 mL/kg。每日灌胃时间如下:首次灌胃于上午9:00～9:30完成,按标记顺序操作,每只小鼠耗时约40 s,组内总时长不超过30 min;第2次灌胃于第1次灌胃后严格间隔30 min(即9:30～10:00)进行,灌胃顺序与第1次一致,操作时长相同。在试验期间记录小鼠的体重变化,处死前测定小鼠的空腹体重[14]。

1.4.4 小鼠翻正反射消失与恢复的时间

记录给酒与给药时间,以及小鼠翻正反射消失时间(定义为小鼠仰卧位维持超过30 s无法自行翻正,即醉酒状态)和恢复时间(小鼠重新获得自主翻身能力的时间)。计算酒精耐受时间(给酒时间～翻正反射消失时间)、醒酒时间(翻正反射重新出现至恢复正常的时间)。

1.4.5 血清和肝脏样本采集

经过30 d的造模,实验结束时,让小鼠禁食12 h后用异氟烷麻醉,从眼球取血并将血液收集于1.5 mL离心管中,在室温下静置1 h,然后在4 ℃、3 000 r/min的条件下离心10 min,吸取上清液并储存于-80 ℃的冰箱中。小鼠处死后迅速分离肝脏组织,经预冷(4 ℃)生理盐水冲洗2～3次。随后用无菌滤纸吸除表面残留血液及生理盐水,称量肝脏质量并做好记录,然后迅速在液氮中冷冻30 s,最后储存放于-80 ℃的冰箱内。小鼠肝脏指数的计算如公式(6)所示。

(6)

式中:W,肝脏指数,%;a,小鼠肝脏质量,g;A,小鼠体重,g。

1.4.6 小鼠血清乙醇浓度、ALT、AST活性测定

取-80 ℃保存的血清样品,使用试剂盒检测肝功能指标(AST、ALT)的酶活性,结果以“U/L”表示;血清的乙醇浓度结果以“mmol/L”表示,操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.7 小鼠肝组织相关指标测定

取少量肝脏组织,按组织质量(g)∶生理盐水体积(mL)=1∶9的比例,制备成组织匀浆,用于后续指标检测。检测包括:ADH、ALDH活性,采用ELISA试剂盒定量检测,结果以“U/mg”或“U/g”表示;氧化应激指标(T-SOD活性、MDA含量及GSH含量)的测定:T-SOD活性使用黄嘌呤氧化酶法试剂盒测定,结果以“U/mg”表示;MDA含量采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)法试剂盒检测,结果以“nmol/mg”表示;GSH含量通过比色法试剂盒测定,结果以“μmol/mg”表示;炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)含量:通过ELISA试剂盒检测,结果以“pg/mg”表示,操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.8 小鼠肝组织基因表达量的测定

利用Trizol试剂提取总RNA,通过逆转录试剂盒将所提RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板,采用荧光染料嵌合法进行实时荧光定量PCR,并借助StepOne实时PCR系统检测荧光信号。以小鼠β-actin作为内参基因,采用2-ΔΔCt法计算目标基因(Cyp2e1、Nrf-2、HO-1、Keap1)mRNA相对表达量,结果以相对于NC组(设为1.0)的表达倍数表示。引物由生工生物工程有限公司合成,序列见表2(RT-qPCR基因引物序列)。

1.4.9 肝脏组织病理学观察

取肝脏的右叶组织样本,用生理盐水清洗干净,接着用质量浓度40 g/L的多聚甲醛溶液进行固定处理,采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,借助显微镜观察其组织学的病理变化,并对肝脏组织中的异常病变执行病理学分析。

1.5 数据统计分析

本研究使用SPSS 27.0进行分析,首先通过Shapiro-Wilk检验数据正态性,Levene检验方差齐性,符合正态分布且方差齐的数据以“平均值±标准偏差”表示,2组间比较用独立样本t检验,多组间比较用单因素方差分析(analysis of variance,ANOVA)及Duncan多重比较,结果以不同字母标注显著性(P<0.05);非正态分布或方差不齐时采用非参数检验。每组数据重复3次,经Excel整理后,用GraphPadPrism 9.0绘图,检验水准α=0.05。

2 结果与分析

2.1 单因素试验优化发酵工艺

由图2-a可见,黄酮含量随初始pH值升高呈先增后降趋势,并于pH 6.0时达到峰值。原因在于,植物乳植杆菌在弱酸性环境下具有更优的生长代谢活性,而强酸及碱性条件抑制其繁殖与次级代谢产物合成,最终确定最佳初始pH值为6.0。

由图2-b可见,黄酮含量在30 h发酵期内持续上升至峰值,后续则出现较大幅度的下降。发酵前期菌体代谢旺盛,后期因营养消耗及菌体衰老导致次级代谢产物合成减少,最终选择30 h为最佳发酵时长。

从图2-c可见,当接种量低于4%时黄酮含量随接种量增加而上升,至4%时达最高值,过量接种则引起含量下降。此现象符合微生物典型生长规律:充足资源下代谢强度与菌密度正相关,而过度密集则因营养竞争与空间限制而抑制代谢效率,最终确定最佳接种量确定为4%。

2.2 正交试验

在单因素试验的基础上,以初始pH值(A)、接种量(B)、发酵时间(C)为试验因素,以黄酮含量,计算综合评分,并以综合评分作为评价指标,采用L9(33)正交试验设计,优化FPE5的工艺条件正交试验结果与分析见表3。

由表3正交试验结果极差分析可知,各因素对黄酮含量影响次序为C>B>A。最佳发酵工艺为A2B2C3。故发酵工艺条件为A2B2C3,即初始pH 6,接种量4%,发酵30 h。由表4方差分析结果可知,B、C因素对结果有显著性影响(P<0.05),A因素对结果无显著性影响(P>0.05)。

2.3 验证试验

在上述最佳条件下(初始pH 6.0,接种量4%,发酵时间30 h),平行试验5次,黄酮含量依次为:5.63、5.59、5.58、5.61、5.56 mg/mL。平均值为5.596 mg/mL,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.545%。验证试验结果表明,在此优化工艺条件下,黄酮含量高且重现性良好,表明该优化工艺稳定可靠,试验设计合理。

2.4 PE与FPE5黄酮、总酚含量与抗氧化指标的测定

据报道,类黄酮与总酚类化合物含量的升高,与肝脏组织中MDA含量的下降、GSH含量的上升以及T-SOD活性的增强密切相关[16]。由表5可知,与PE组的黄酮含量[(5.62±0.37)mg/mL],总酚含量[(4.28±0.46)mg/mL]相比,FPE5组的黄酮、总酚含量显著提高(P<0.05),分别为(6.93±0.54)、(5.98±0.49)mg/mL,较PE组分别提高23.33%和39.72%,提高了提取液中活性物质含量。表明通过发酵有效提升了活性物质含量。

酒精毒性可诱导肝细胞脂质过氧化并增强氧化应激,过量自由基会进一步加剧组织损伤。由表5可知,与PE相比,FPE5的DPPH自由基清除率、ABTS阳离子自由基清除率、·OH清除率分别提升了26.71%、28.93%和48.98%,抗氧化能力显著高于PE(P<0.05),显著提升提取液的抗氧化能力。说明,在发酵过程中,FS5-5发酵代谢可能协同促进了黄酮、总酚等抗氧化成分的积累,从而增强提取液的整体抗氧化效能,这为其潜在的解酒保肝作用提供了理论基础。

2.5 灌酒剂量的确定

给小鼠灌胃体积分数50%乙醇溶液,依据小鼠的“翻正反射”消失判断醉酒状态。实验结果如表6所示,小鼠在8、10 mL/kg的灌胃剂量下,醉酒率分别为50%、80%,未出现死亡现象;在14、16 mL/kg的灌胃剂量下,小鼠全部醉酒,死亡率分别为10%、30%;在12 mL/kg的灌胃剂量下出现全部醉酒且无死亡现象,因此选择最佳灌酒剂量为12 mL/kg。

2.6 对小鼠醉酒数量、醉酒率、酒精耐受时间和醒酒时间的影响

经过30 d的造模后,所有组别小鼠均无死亡情况。由表7可知,与 ETOH 组相比,PC组、各FPE5组均能显著缩短小鼠醒酒时间,表明通过药物干预能够有效地提升小鼠对酒精的代谢速度。同时,PC组与FH组可显著延长小鼠酒精耐受时间(P<0.05),表明通过干预既能增强机体对酒精的耐受能力,又能加速酒精清除,呈现双向解酒效应。其中,FH组的解酒效果最好,可能是因为在发酵的过程中,提取液里的活性成分增多,从而降低了酒精在体内的吸收速率,并且抑制了血液中酒精浓度的上升,并促进了酒精的代谢。

2.7 对小鼠血清乙醇浓度的影响

翻正反射丧失小鼠的中毒和恢复时间是醉酒最直接的表型指标。同时,血清乙醇浓度提供了小鼠对酒精暴露的反应的实质性证据。如表8所示,在血清乙醇浓度变化上,ETOH组灌胃前血清乙醇浓度接近零,灌胃后1 h达峰值33.96 mmol/L峰值,随后逐渐下降,3 h降至14.87 mmol/L。PC组各时间点的血清乙醇浓度均显著低于ETOH组(P<0.05),其对小鼠乙醇代谢有促进作用。FH组在改善小鼠乙醇代谢方面表现突出。与ETOH组相比,0.5 h时,FH组血清乙醇浓度降低了 37.44%(P<0.05);1 h时,FH组血清乙醇浓度峰值降低了 41.17%(P<0.05),效果优于PC组,说明在乙醇浓度高峰时能更有效抑制其上升;3 h时,FH组血清乙醇浓度降低了64.96%(P<0.05),展现出持续高效的乙醇代谢能力。此外,具体来看,FL组在0.5、1和3 h时,血清乙醇浓度分别降低了 24.91%、22.11%和6.32%,而FM组在相同时间点的降幅分别为 27.85%、26.94%和45.29%。这些数据表明,FL组和FM组虽有促进乙醇代谢效果,但降低血清乙醇浓度的幅度和显著性均弱于FH组。

2.8 对小鼠体质量及肝脏指数的影响

体质量变化是反映小鼠健康状况最直观的指标,导致脂质代谢出现紊乱,进而引发肝脏脂肪变性并堆积,造成肝脏肿大,而肝脏指数可反映出肝脏肿大的程度[17]。从图3-a中可以看出,与ETOH组相比,各FPE5组、PE组及PC组体质量均呈现出增长并趋于稳定。与NC组相比,FL组体质量增长幅度最小,而FH组体重增幅最大,并且稳定升高。这表明FPE5能有效缓解酒精诱导的体质量减轻。按照既定方案完成30 d模型干预后,由图3-b可以看出,相较于NC组,ETOH组的小鼠肝脏指数显著上升(P<0.05),而各给药组的小鼠肝脏指数都有所下降,尤其是FH组的降低更为突出。因此,FH能够缓解由酒精导致的体重下降和肝脏指数的升高,表明FPE5可通过调节能量代谢和抑制肝脂肪变性发挥护肝作用。

2.9 对小鼠肝脏脱氢酶活性的影响

肝脏脱氢酶活性检测结果如图4所示,在长期酒精刺激下,与NC组相比,ETOH组肝组织的ADH和ALDH活性显著降低(P<0.05),解酒能力整体下降。然而,经PE组、PC组和各剂量FPE5组的干预,肝脏的ADH和ALDH活性得到了显著升高(P<0.05)。其中,FH组的效果显著优于其他组,表明FH通过提高ADH和ALDH的活性来加速酒精在体内的代谢进程,促进酒精的代谢,减少毒性中间产物乙醛的蓄积,从而起到更好的解酒效果。

2.10 对小鼠血清中转氨酶活性的影响

血清转氨酶活性检测结果如图5所示,长期摄入大量酒精导致ETOH组血清中ALT、AST活性显著升高(P<0.05),造成肝细胞损伤。与ETOH组相比,PE组、PC组、各剂量的FPE5组小鼠的血清中AST、ALT活性显著降低(P<0.05)。其中,FH组ALT、AST活性显著低于其他干预组(P<0.05),并且ALT活性与NC组无显著差异,说明FH很大程度上减轻了肝细胞损伤的程度,有助于防止因酒精过量摄入引起的肝细胞坏死,从而起到护肝的作用。

2.11 对小鼠肝脏组织病理学的影响

肝脏组织病理学是判断肝脏受损程度的金标准,在各类肝损伤模型中被广泛运用。肝组织病理学结果见图6,NC组图6-a肝小叶结构清晰,肝索呈放射状排列,细胞形态正常,肝窦无扩张及炎症浸润。ETOH组图6-b肝细胞边界消失,胞质内可见小泡性的圆形空泡,肝索排列紊乱,细胞肿胀并出现炎症浸润。说明通过灌胃酒精对小鼠的肝脏产生了明显的损伤。相较于ETOH组,PE组图6-d、FL组图6-e肝细胞损伤程度明显减轻,肝索结构变得越来越有序,炎症浸润减少;PC组图6-c、FM组图6-f组,肝索排列整齐,炎症浸润明显减少,肝脏组织中以汇管区为中心,在胞质中观察到细小的圆形空泡;FH组的肝细胞图6-g显示出较为完整的结构,肝索的排列形态清晰可见。胞质内未见圆形空泡,炎症浸润大大减少细胞核形态趋于完善。这些结果充分表明,相较于酒精灌胃导致严重损伤的ETOH组,不同实验组对肝损伤均展现出一定程度的改善效果,尤其是FH组对肝脏组织结构的修复与炎症抑制作用最为显著,为后续深入探究肝损伤防治策略提供了直观且有力的组织病理学依据。

2.12 对小鼠肝脏氧化应激指标的影响

如图7所示,与NC组相比,ETOH组T-SOD活性和GSH含量显著降低(P<0.05),MDA含量均显著提高(P<0.05)。而PC组、PE组和各剂量FPE5组小鼠肝脏中T-SOD活性和GSH含量较ETOH组显著升高(P<0.05),MDA含量均显著降低(P<0.05)。其中,FH组提高小鼠肝脏T-SOD活性和GSH含量,降低MDA含量的效果更显著。这些结果可能是由于植物乳植杆菌发酵增加了中药提取液中抗氧化成分多酚和黄酮类物质的含量,这些活性成分可直接参与清除自由基反应,减少自由基对细胞的损伤,从而抑制脂质过氧化反应,起到了解酒和护肝的作用。

2.13 对小鼠肝脏炎症因子指标的影响

如图8所示,ETOH组中肝组织中炎症因子TNF-α、IL-1β及IL-6含量较NC组显著升高(P<0.05),提示肝脏炎症反应被激活。与ETOH组相比,PC组、各剂量FPE5组和PE组均能够显著抑制由酒精诱导的炎症因子含量升高(P<0.05)。其中,FH组抑制效果显著优于其他组(P<0.05)。综上,FH组通过抑制炎症因子的产生,降低小鼠肝脏的炎症反应,从而减少酒精引起的肝脏损伤。

2.14 对小鼠肝脏mRNA表达量的影响

本研究证实,如图9-a所示, ETOH组Cyp2e1 mRNA表达较NC组显著上调(P<0.05)。经海王金樽和不同剂量FPE5和PE干预后,Cyp2e1基因表达显著下调(P<0.05),显著降低了其基因表达水平。其中,FH效果最显著,优于其他组。图9-b、图9-c、图9-d显示,ETOH组Keap1 mRNA的表达量显著高于NC组(P<0.05),Nrf2、HO-1的mRNA 表达则显著低于NC组(P<0.05),经海王金樽和不同剂量FPE5和PE干预后,FH扭转了这一情况,其中Keap1 mRNA的表达量显著低于ETOH组,Nrf2、HO-1的mRNA表达则显著高于ETOH组(P<0.05),且显著优于其他组。综上,酒精诱导Cyp2e1高表达并破坏Keap1/Nrf2/HO-1通路的正常调控,引发了肝脏氧化应激损伤;FPE5可通过下调Cyp2e1的过表达,恢复Keap1/Nrf2/HO-1信号通路,降低肝细胞氧化应激损伤,从而缓解ALI。

3 结果与讨论

近年来,长期过量饮酒所引发的ALI问题日益突出,开发安全有效的天然解酒护肝制剂成为研究重点。本研究通过FPE5,系统评价了其解酒防醉效果及对ALI的保护作用与机制。

通过正交试验确定最优发酵工艺为初始pH 6、接种量4%、发酵时间30 h,所得产物FPE5中活性成分含量与抗氧化能力显著提升,为其后续功能奠定物质基础。在ALI小鼠模型中,FPE5表现出显著解酒与护肝功效。行为学及生理生化检测表明,FPE5可明显改善酒精中毒症状。ADH与ALDH是乙醇代谢过程中的关键酶,其活性高低直接决定血液中乙醇的清除速率[18]。FPE5能够提高这2种酶的活性,从而加速酒精代谢,减少酒精在体内的滞留时间。同时,酒精可激活肝巨噬细胞,促进TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子的分泌[19],加剧炎症反应,而FPE5有效减轻这一过程所带来的炎症反应。肝脏中MDA作为脂质过氧化的特征性醛类产物,其含量反映机体脂质过氧化程度,GSH的含量能改善酒精性肝病的病理症状[20],T-SOD活性则直接表征机体清除氧自由基的能力水平[21]。由于FPE5具有显著的抗氧化能力,所以可显著降低MDA水平、提升GSH含量并增强T-SOD活性,从而有效减轻ALI。ALT与AST二者分别反映了肝细胞膜和细胞器的损伤程度[22],FPE5可加快酒精代谢以及减轻氧化应激,从而降低ALT与AST活性,减轻肝损伤程度。

肝脏作为酒精代谢的核心器官,线粒体乙醇氧化体系发挥主导作用,而CYP2E1是该代谢途径的关键酶。本研究发现,酒精暴露可显著上调Cyp2e1基因表达,而FPE5干预后可显著抑制其过度表达,这与TOMASI等[23]的研究一致,CYP2E1过度激活不仅催化乙醇生成毒性乙醛,还通过电子传递链产生大量ROS,加剧肝细胞脂质过氧化损伤。FPE5对Cyp2e1表达的抑制作用,可从源头减少乙醛和ROS的生成,阻断ALI的启动环节。在抗氧化防御机制中,Keap1/Nrf2/HO-1信号通路的激活是缓解肝脏氧化应激的关键。本研究证实,酒精暴露可破坏该通路的正常调控,而FPE5可通过下调Keap1、促进Nrf2核转位,显著上调HO-1等抗氧化酶基因表达。这一机制与KUNDU等[24]的报道一致:Nrf2与DNA上抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)结合后,可激活Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶的表达,增强细胞内源性抗氧化能力。本研究中FPE5对该通路的激活,与其提升肝脏GSH含量、T-SOD活性及降低MDA水平的结果形成呼应,证实其通过抑制氧化损伤源头以及增强抗氧化防御的双途径发挥护肝作用。FPE5的双重调控机制可能与其发酵后活性成分(黄酮、总酚)的含量提升密切相关。这可能与植物乳植杆菌FS5-5的β-葡萄糖苷酶可水解葛根中的黄酮苷,生成更易吸收的苷元,这些成分可直接发挥作用[25]。综上,本研究为酒精性肝病的防治提供了新的策略与方向,也为新型解酒保肝产品的研发奠定了坚实的理论与实验基础。

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Mechanisms and efficacy of Lactiplantibacillus plantarum FS5-5 fermentedPueraria lobata extract in alcohol detoxification and liver protection

YANG Haixin1, LI Tong1, WU Junrui1, XIA Suning1, AN Feiyu1, SHI Haisu1, GUO Jia1, XUE Ruixia1, WU Rina1*, ZANG Jian2*

1(Liaoning Food Fermentation Technology Engineering Research Center, College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)2(Analysis and Testing Center, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

ABSTRACT The global health burden of alcohol-induced liver injury is increasing, necessitating effective hepatoprotective strategies.This study employs Lactiplantibacillus plantarum FS5-5 as a fermenting agent to bioferment Pueraria lobata extract.The optimization of fermentation parameters resulted in the production of a fermented product, fermented pueraria lobata extract by Lactiplantibacillus plantarum FS5-5 (FPE5).The results indicate that fermentation significantly enhances the flavonoid content, total phenolic compounds, and antioxidant capacity of FPE5.Animal studies demonstrate, a high dose of FPE5 (FH) demonstrated significant efficacy.FH prolonged the time to the loss of righting reflex, shortened the recovery time, and lowered the serum ethanol concentration.FH effectively reduces serum alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase activities, ameliorates hepatic histopathological damage, while concurrently enhancing hepatic alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase activities.It also elevates total superoxide dismutase activity, reduces the content of malondialdehyde, increases the content of glutathione, and suppresses pro-inflammatory cytokine expression.Mechanistic investigations indicate that FPE5 mitigates oxidative stress by downregulating Cyp2e1 gene expression and modulating the Keap1/Nrf2/HO-1 signaling pathway, thereby exerting hepatoprotective and anti-alcoholic effects.This study confirms that fermentation with Lactiplantibacillus plantarum can significantly enhance the antioxidant capacity and hepatoprotective effects of Pueraria lobata, providing a theoretical foundation for the development of functional products aimed at alcohol detoxification and liver protection.

Key words Lactiplantibacillus plantarum;Pueraria lobata;fermentation process;alcohol detoxification and hepatoprotection;alcoholic liver injury

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044052

引用格式：杨海鑫,李彤,武俊瑞,等.植物乳植杆菌FS5-5发酵葛根提取液解酒护肝功效与机制的研究[J].食品与发酵工业,2026,52(11):53-64.YANG Haixin, LI Tong, WU Junrui, et al.Mechanisms and efficacy of Lactiplantibacillus plantarum FS5-5 fermented Pueraria lobata extract in alcohol detoxification and liver protection[J].Food and Fermentation Industries,2026,52(11):53-64.

第一作者：硕士研究生(乌日娜教授和臧健讲师为共同通信作者,E-mail:wrn6956@163.com;2005500031@syau.edu.cn)

基金项目：国家自然科学基金面上项目(32172279);辽宁省“兴辽英才计划”项目(XLYC2213026,XLYC2402005);辽宁省科学技术计划项目(2024JH2/101900005);沈阳农业大学引进人才(高层次)科研启动费项目(2023YJRC002);沈阳市科技创新平台项目(21-103-0-14,21-104-0-28)

收稿日期：2025-07-31,改回日期:2025-10-26