便秘是一种全球普遍存在的胃肠道功能性疾病,影响约10%～20%的成年人,其主要表现为排便次数少、粪便坚硬和排便不适[1],在罗马Ⅳ标准中功能性便秘被定义为在3个月内排便次数少于每周3次,伴有排便不尽感和过度用力,且无潜在疾病,该标准目前被视为诊断功能性便秘的金标准[2]。便秘症状的出现受多种因素的影响,包括年龄增长、性别、饮食、肥胖、术后(如心脏病术后、肝移植术后等)、药物(如阿片类药物、抗精神病药物等)、体力活动等[3-4],同时便秘也可能成为其他疾病的危险因素,如长期便秘可增加患结肠癌的风险,诱发急性心肌梗死、脑梗[5]。便秘的病理生理机制复杂,涉及胃肠道内的多种机制。其中肠平滑肌运动功能障碍被认为是重要环节,可以直接影响粪便排出[6]。此外,肠神经系统的紊乱,以及神经递质水平的改变和肠道菌群失调,会导致结肠传输时间延迟,进而引起便秘症状[7-9]。越来越多的研究证明肠道神经系统、肠道微生物群衍生的代谢物(如胆汁酸、短链脂肪酸和色氨酸代谢物等)、肠道菌群产生的气体(如甲烷)等影响肠道蠕动和肠道黏液分泌,从而影响便秘的发生[10]。
因此,肠道菌群的调节已成为改善便秘的临床疗法。常用的治疗方法有益生菌、益生元、粪菌移植。多项研究表明,益生菌干预可有效缓解便秘症状。例如,包括Lactiplantibacillus plantarum UALp-05等5种益生菌的配方可以显著增加乳杆菌和植物乳植杆菌丰度,改变L-脯氨酸、糖醛酸等代谢物水平,明显改善便秘症状[11]。TAKEDA等[12]发现长双歧杆菌长亚种BB536可以显著改善肠道运动从而缓解老年人慢性便秘。然而,益生菌改善便秘的效果仍有矛盾,动物双歧杆菌乳亚种HN019被认为可以显著改善低排便频率成年人的排便次数[13],但CHENG等[14]HN019补充8周并未发现对受试者自发排便的影响与安慰剂相比有显著差异。这些研究提示益生菌在缓解便秘方面可能存在很多难以解释之处,仍需开展更多研究。
动物双歧杆菌乳亚种BL-99(Bifidobacterium animalissubsp.lactis BL-99)最初从1名中国健康婴儿的肠道中分离得到,并由内蒙古伊利实业集团申请专利并上市销售[15]。动物双歧杆菌乳亚种有望成为美国一般认为安全(Generally Recognized as Safe,GRAS)的膳食补充剂,存在于我国《可用于食品的菌种名单》中。目前BL-99缓解便秘的相关研究有体外发酵模型、小鼠模型、斑马鱼模型及部分临床试验,初步证实BL-99有促进肠道蠕动、改善消化不良、便秘的效果[16-18]。在此基础上,本研究重建了动物双歧杆菌的宏基因组组装基因组(metagenome-assembled genomes,MAGs),并系统评估了BL-99干预对便秘人群症状的改善效果以及基因组重建后肠道菌群组成、功能通路特征的影响。
1 材料与方法
1.1 研究设计和受试者招募
本研究招募了21名18～80岁存在便秘困扰的受试者,采用自身前后对照设计,开展了为期6周的益生菌干预试验,其中包括4周的干预期和2周的跟踪期。受试者在整个试验期间保持正常的生活、饮食习惯。在干预期前1 d收集基线粪便样本,并要求受试者根据便秘患者症状自评量表(patient assessment of constipation-symptom,PAC-SYM)进行便秘症状自我评分。PAC-SYM问卷是便秘临床试验中评估患者反应结果的标准化方法[19],量表分为3部分:腹部症状、直肠症状、排便情况,共有12种症状,根据李克特5级评分法对症状严重程度(0=无、1=轻微、2=中等、3=严重、4=非常严重)进行自我评分,每个症状分数相加作为相应受试者的最终得分。在干预期内,受试者需每日服用含BL-99菌株的发酵酸奶,每日服用2次,益生菌数量为1×1011 CFU/d,持续4周。在第(28±1)天,即干预期结束后,收集粪便样本。在第(42±1)天,即跟踪期结束后,再次收集粪便样本和便秘症状评分,以跟踪期结束视为试验终点,进行受试者前后评分变化的统计学分析,并基于宏基因组测序的基因组重建技术进行肠道菌群分析。该研究经江南大学附属医院医学伦理委员会批准(WXSY-YXLL-AF/SC-11/01.0)。
1.2 纳入排除标准
收集的受试者基本信息包括性别、年龄、身高、体质量,并根据纳入排除标准对受试者进行筛选。纳入标准为年龄18～80岁的存在便秘困扰的人群。排除标准如下:a)患有重大胃肠道疾病;b)研究开始前3个月内摄入抗生素;c)3个月内摄入益生菌或益生元补充剂;d)怀孕或者哺乳期;e)参与其他试验。
1.3 粪便采集
分别在干预前后和跟踪期结束时收集粪便。向受试者提供无菌管并指导他们将粪便收集到管中冷藏保存直到运送到研究地点,随后研究人员将样本贮存在-80 ℃直至进一步分析。
1.4 肠道菌群分析
将粪便样本解冻后使用QIAamp DNA试剂盒提取总基因组DNA,构建文库后用Illumina NovaSeq 6000平台对所有样本进行宏基因组测序。经过质控和去宿主之后得到clean data使用FastQC V.0.12.1评估处理后的序列质量。组装软件为MEGAHIT V.1.2.9[20],获得Contigs后使用MetaBAT2 V.2.12.1[21]进行宏基因组分箱得到MAGs。使用CheckM2 V.1.1.0[22]评估MAGs的质量,以确定其完整性和污染水平。选择完整性≥50%和污染率<10%的MAGs用dRep V.3.6.2[23]进行去复制后用GTDB-Tk V.1.3.0[24]对物种级基因组箱(species-level genome bins,SGBs)进行物种分类,用ITOL在线工具可视化最大似然树(https://itol.embl.de/)。使用Prodigal V.2.6.3[25]进行基因预测,随后通过eggNOG-mapper V.2.1.13[26]对SGBs进行功能注释,并使用CoverM V.0.7.0计算SGBs的丰度。此外,通过DIAMOND V.2.1.13[27]将SGBs映射到整个UniRef90数据库后使用MelonnPan预测肠道生物活性代谢物的分布[28]。
1.5 统计分析
所有统计分析用R V.4.3.3和GraphPad Prism V.10.1.2完成。数据以“平均值±标准差”或n(%)的形式呈现。用Friedman检验和Wilcoxon符号秩和检验进行显著性差异分析。肠道菌群的物种多样性、主坐标分析(principal coordinates analysis,PCoA)和预测活性代谢物的非度量多维尺度(non-metric multidimensional scaling,NMDS)分析,通过R包(vegan、mixOmics、ggplot2和ggpubr)计算。差异菌种和受试者基线特征的相关性采用Spearman分析并进行可视化,相关性系数(r)介于-1～1,r>0为正相关,r<0为负相关。使用DESeq2包识别差异基因,并设定校正后P<0.05及|log2FoldChange|(差异倍数)>1为显著差异表达的阈值。用clusterProfiler包将差异基因的KO映射到通路进行功能富集分析。所有统计分析都使用B-H法校正多重检验。所有结果的可视化均用R和Adobe Illustrator完成。
2 结果与分析
2.1 基线特征
共有21名受试者完成了研究,其中男性3名(14.3%),女性18名(85.7%)。基本信息包括性别、年龄、身高、体质量、体质量指数(body mass index,BMI)。受试者的平均年龄为(55.48±13.43)岁,平均身高为(165.20±6.74) cm, 平均体质量为(57.86±6.09)kg, BMI为(21.24±2.19) kg/m2。
2.2 便秘相关症状评分
根据干预前(T0)和跟踪第2周(T2)收集到的评分情况,本研究分别对每位受试者PAC-SYM量表的总得分以及3个亚量表(腹部症状、直肠症状、排便情况)进行配对t检验和Wilcoxon符号秩和检验,发现在跟踪期后,总PAC-SYM评分显著降低(P<0.001),从(14.05±2.01)降至(7.86±2.37)。第1～3、5～7、9～12项的症状显著缓解(P<0.05)(表1),这些结果表明,在停止干预2周后便秘症状得到明显改善。
表1 BL-99干预对便秘患者症状评分的影响
Table 1 Effects of BL-99 intervention on PAC-SYM scores
指标T0T2P值腹部症状1.腹部不适1.10±0.54a0.67±0.482.腹部疼痛0.86±0.36a0.14±0.363.腹部胀满0.48±0.75a0.19±0.404.腹部痉挛0.10±0.300.14±0.36<0.001直肠症状5.排便疼痛1.52±0.81a0.67±0.486.排便有肛门烧灼感1.24±0.77a0.76±0.627.排便有肛门出血或撕裂0.95±0.86a0.52±0.51<0.001排便情况8.排便不尽感1.05±0.92 0.86±0.739.粪质坚硬1.81±0.60a0.71±0.4610.排便量少1.86±0.48a1.00±0.6311.排便费力1.91±0.44a1.43±0.6012.有便意但排不出1.19±1.08a0.76±0.83<0.001总分14.05±2.01 7.86±2.37<0.001
注：a为T0与T2组比较(P<0.05)。
2.3 肠道菌群组成特征
对21名受试者在第0、28、42天采集的共63个样本进行了宏基因组分箱,共获得了7 037个原始MAGs。将完整性设置为≥50%,污染率设置为<10%并删除重复后,进一步获得了653个非冗余SGBs,均属于细菌。这653个SGBs分布于9个门、15个纲、30个目、67个科、272个属、541个种,其中17个SGBs无法映射到物种层级,表示未分类物种,它们主要属于芽孢杆菌门(Bacillota)76.47%,少数属于放线菌门(Actinomycetota)23.53%(图1)。
图1 653个SGBs的系统发育树
Fig.1 Phylogenetic tree of 653 SGBs
基于种水平对肠道菌群进行多样性分析,α多样性主要关注样本内部的微生物群落的丰富度和多样性。干预前(T0)、干预第4周(T1)、跟踪第2周(T2)这3组间群落丰富度Shannon指数和Simpson指数差异均无统计学意义(P>0.05)(图2-a,图2-b),但干预后的Shannon指数(3.489)相较于干预前(3.444)升高,跟踪期(3.424)又回降,Simpson指数在3组间逐渐降低(0.915 vs 0.907 vs 0.897),提示干预对肠道菌群的均匀度有一定的调节作用。为了考察3组之间微生物群落结构的相似性,进行了β多样性分析,基于Bray-Curtis距离和Jaccard距离进行PCoA,置换多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance,PERMANOVA),结果显示,3个时期的肠道微生物组成相似(P>0.05)(图2-c,图2-d)。多样性分析结果表明BL-99干预对整体肠道细菌微生物群结构无明显改变。
a-Shannon指数;b-Simpson指数;c-Bray-Curtis PCoA;d-Jaccard PCoA
图2 肠道菌群的α多样性和β多样性
Fig.2 α Diversity and β diversity of the gut microbiota
肠道菌群组成结果如图3-a～图3-c所示,在门水平上,相对丰度排名前5的门分别为芽孢杆菌门、拟杆菌门(Bacteroidota)、放线菌门、假单胞菌门(Pseudomonadota)、疣微菌门(Verrucomicrobiota)。3组中芽孢杆菌门和拟杆菌门始终处于绝对优势菌门,与干预前相比,芽孢杆菌门(37.39% vs 36.45% vs 36.91%)、拟杆菌门(15.41% vs 13.02% vs 13.70%)、疣微菌门(1.54% vs 1.49% vs 1.92%)的相对丰度降低,跟踪期较干预后有回升趋势但仍低于干预前水平。放线菌门(7.06% vs 10.74% vs 10.00%)和假单胞菌门(3.28% vs 5.04% vs 4.79%)的相对丰度呈先升高后降低趋势,但跟踪期丰度仍更靠近干预后。
a-门水平物种组成;b-属水平物种组成;c-种水平物种组成;d-动物双歧杆菌_B个体趋势图;e-未分类的双歧杆菌个体趋势图
图3 肠道菌群物种组成及差异物种个体趋势图
Fig.3 Chart of gut microbiota species composition and individual trends of differential species
在属水平上,相对丰度排名前5的属为双歧杆菌属(Bifidobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)、布劳特氏菌属_A(Blautia_A)、链球菌属(Streptococcus)、居海事城球杆菌属(Phocaeicola)。双歧杆菌属(5.33% vs 8.60% vs 8.11%)和布劳特氏菌属_A(4.41% vs 4.53% vs 3.75%)的相对丰度在干预期第4周升高,跟踪期第2周降低。拟杆菌属(6.93% vs 5.53% vs 5.93%)的相对丰度先降低后升高。链球菌属(2.56% vs 4.57% vs 4.59%)的相对丰度持续升高,居海事城球杆菌属(3.35% vs 3.06% vs 2.69%)的相对丰度持续降低。此外,乳杆菌属(Lactobacillus)(0.43% vs 0.63% vs 0.68%)的相对丰度持续升高,栖粪杆菌属(Faecalibacterium)(3.03% vs 2.15% vs 2.66%)的相对丰度在干预期下降,跟踪期有所回升。
在种水平上,相对丰度排名前5的种有长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、韦氏布劳特氏菌_A(Blautia_A.wexlerae)。其中长双歧杆菌(2.05% vs 2.73% vs 2.52%)和韦氏布劳特氏菌_A(1.51% vs 1.71% vs 1.47%)的相对丰度呈先升高后降低的趋势,单形拟杆菌(1.61% vs 1.40% vs 2.23%)的相对丰度在干预期第4周降低,跟踪期回升。肺炎克雷伯氏菌(0.38% vs 3.15% vs 3.24%)相对丰度呈持续升高趋势,大肠埃希氏菌(2.46% vs 1.42% vs 1.15%)的相对丰度变化呈持续降低趋势。
在种水平上,用Friedman进行统计检验并经B-H校正后,共鉴定到2个差异种,分别是动物双歧杆菌_B(Bifidobacterium animalis_B)(P=0.014)(图3-d)和未分类的双歧杆菌(Unclassified Bifidobacterium)(P=0.014)(图3-e)。进行两两比较后发现,和干预前相比(0.00%),动物双歧杆菌_B干预第4周(1.19%)、跟踪第2周(0.55%)的平均相对丰度均显著升高,差异有统计学意义(P=0.002;P=0.014),未分类的双歧杆菌干预第4周(1.45%)和跟踪第2周平均相对丰度(0.63%)较干预前(0.00%)升高,组间差异显著(P=0.002;P=0.014)。
图4为差异物种在各组间的相对丰度变化与受试者基线特征(年龄、BMI)之间的相关性,r表示相关系数。结果显示,动物双歧杆菌_B在干预前和跟踪期的平均相对丰度变化值(△T2-T0)与年龄呈显著正相关(r=0.541,P=0.011);在干预期和跟踪期的平均相对丰度变化值(△T2-T1)与女性呈显著负相关(r=-0.466,P=0.033);组间丰度变化均和BMI无显著相关性。未分类的双歧杆菌和动物双歧杆菌_B结果一致。
图4 Spearman相关性分析图
Fig.4 Spearman correlation heatmap
2.4 肠道菌群功能特征
对3组肠道菌群用DESeq2进行基因差异分析(|log2FC|>1,P<0.05),识别到干预前和干预后的肠道菌群有3 018个差异基因,其中2 513个基因在干预后的数量增多,这些基因主要来自动物双歧杆菌_B、未分类的双歧杆菌、CAG-196 sp002102975;505个基因减少,主要来自鼠长丝杆菌(Longibaculum muris)、波尔图粘液乳杆菌(Limosilactobacillus portuensis)等(图5-a)。采用R的clusterProfiler包对差异基因所属KEGG通路进行富集,共有35条通路显著,图5-b为显著性前20的KEGG通路,差异基因富集于氨基酸生物合成(ko01230)、辅酶因子生物合成(ko01240)、核糖体(ko03010)、嘌呤代谢(ko00230)等通路中。
a-干预后较干预前差异基因火山图;b-干预后较干预前差异基因KEGG通路富集气泡图;c-跟踪期较干预前差异基因火山图;d-跟踪期较干预前差异基因KEGG通路富集气泡图
图5 差异基因火山图和KEGG通路富集图
Fig.5 Differential gene volcano plot and KEGG pathway enrichment plot
a-干预后较干预前差异基因CAZymes统计;b-跟踪期较干预前差异基因CAZymes统计
图6 差异基因的CAZy碳水化合物活性酶统计
Fig.6 Statistics of CAZy carbohydrate active enzymes in differential genes
注:GH为糖苷水解酶;GT为糖基转移酶;CBM为碳水化合物结合模块。
干预前和跟踪期的肠道菌群有2 269个差异基因,其中2 126个基因在跟踪期的数量增多,主要来自动物双歧杆菌_B、未分类的双歧杆菌、CAG-196 sp002102975;143个基因减少,主要来自波尔图粘液乳杆菌(图5-c)。共有34条通路显著,图5-d为干预前和跟踪期比较的显著性前20的KEGG通路,差异基因富集于氨基酸生物合成、辅酶因子生物合成、核苷酸代谢(ko01232)、核糖体等通路中。
对差异基因的CAZymes进行统计,发现差异基因主要注释到糖苷水解酶、糖基转移酶和碳水化合物结合模块。这些酶在代谢碳水化合物中起到重要的作用。干预前后CAZymes含差异基因数量最多的前5个酶是糖苷水解酶家族13、糖基转移酶家族2、碳水化合物结合模块48、糖基转移酶家族4、糖基转移酶家族28(图6-a)。
跟踪期与干预前相比CAZymes含差异基因数量最多的前5个酶是糖苷水解酶家族13、糖基转移酶家族2、碳水化合物结合模块48、糖基转移酶家族4、糖基转移酶家族5(图6-b)。
2.5 肠道菌群活性代谢物预测
基于宏基因组数据,本研究利用MelonnPan预测了肠道微生物群落潜在的代谢产物谱,共获得谷氨酸、胞嘧啶等44种可预测代谢物的相对丰度,通过NMDS在基于这些代谢物构建的总体概况中并未观察到显著差异(Stress=0.078,R2=0.019,P>0.05)(图7),但黄嘌呤等代谢物的相对丰度上升趋势,肌酸等代谢物的相对丰度有下降趋势。
图7 活性代谢物预测的非度量多维尺度分析
Fig.7 Non-metric multidimensional scaling analysis for predicting active metabolites
3 讨论
动物双歧杆菌乳亚种BL-99已被报道可以塑造肠道微生物群并抑制炎症[29]、治疗消化不良[30],和低聚糖一起干预具有改善便秘的效果[17],本研究的结果表明从症状上来说,BL-99在治疗便秘方面表现出良好的疗效,跟踪2周后PAC-SYM评分显著低于干预前,这与先前的一项BL-99和低聚糖共同干预的便秘人群试验结果一致,强调BL-99可以促进排便,在减轻腹部、直肠症状方面具有潜在优势[16]。
对宏基因组测序数据进行分箱后发现在653个SGBs中,有13个SGBs被分类为双歧杆菌属,有1个SGB被分类为动物双歧杆菌_B。肠道菌群的多样性分析结果显示干预前后和跟踪期3组间α多样性和β多样性均无显著差异,LAI等[31]的研究表明在膳食纤维/益生菌干预阶段(第0、2、4周),各组间的属群落多样性相当,PCoA评分也相似。进行物种组成和差异分析后发现,芽孢杆菌门和拟杆菌门的比例呈升高趋势,且在跟踪期第2周比例仍高于干预前。先前研究表明厚壁菌门和便秘缓解有关,拟杆菌门和便秘有关[32]。孟德尔随机化研究也确定了厚壁菌门和便秘呈负因果关系[33]。有研究认为链球菌属与便秘率呈正相关[34],在本研究的结果中,虽然链球菌属的相对丰度呈持续升高状态,但差异没有统计学意义。进一步对分类学水平进行差异分析,发现仅有动物双歧杆菌_B和未分类的双歧杆菌相对丰度变化差异显著,且这种差异持续到跟踪第2周。ZHANG等[30]用BL-99干预消化不良人群时发现,动物双歧杆菌平均相对丰度在物种方面变化最大。说明益生菌干预首先会特异性地增加肠道菌群中干预菌的丰度,也解释了本研究的结果。
对差异物种相对丰度变化和受试者基线特征进行Spearman相关性分析后发现,动物双歧杆菌_B和未分类的双歧杆菌的变化和年龄呈正相关,和性别呈负相关,即女性的变化值较男性低。由此可见益生菌干预试验对肠道菌群的影响可能和年龄密切相关。先前的研究表明,性别会以不同的方式影响肠道菌群,部分原因是性激素和胆汁酸的影响[35]。某些与年龄相关和与疾病相关的肠道菌群组成和功能变化存在重叠也存在独特性[36]。但由于本研究的受试者女性较男性多,年龄跨度较大,且肠道菌群受个人因素影响,个体差异较大,饮食、社交减少等与生活方式相关的因素都会影响肠道菌群的变化,因此该结果还需进一步研究和证实。
本研究通过DESeq2找出了差异基因,多存在于动物双歧杆菌_B、未分类的双歧杆菌中,进行KEGG通路富集后发现,差异基因富集于氨基酸生物合成、辅酶因子生物合成、核糖体等与代谢通路密切相关的生物学过程,该结论与先前研究结论相符,GONZ
LEZ-MORELO等[37]收集了双歧杆菌相关样本,通过构建响应不同类型母乳低聚糖的基因共表达网络发现,代谢图谱在氨基酸、辅因子等代谢通路显著富集。且先前研究认为缓解便秘可以通过调节氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)的生物合成等代谢途径实现[38]。此外,本研究发现差异基因主要注释到CAZy数据库中的糖苷水解酶、糖基转移酶。对于双歧杆菌来说,糖苷水解酶是最普遍的碳水化合物修饰酶组[39]。研究发现双歧杆菌属的泛基因组包括了3 000多个编码推定碳水化合物活性酶的基因,这其中包括了糖苷水解酶和糖基转移酶[40]。糖苷水解酶在便秘研究中具有重要意义,因为它们影响肠道菌群的组成和功能,进而调节肠道健康和排便。糖苷水解酶家族中基因数量多意味着更强的利用复杂碳水化合物和产生短链脂肪酸的能力[41]。有研究发现,动物双歧杆菌Probio-M8可以通过增加肌酸从而增强肌肉减少症患者的身体机能[42]。高尿酸血症小鼠粪便中双歧杆菌和乳杆菌数明显减少,同时伴黄嘌呤氧化酶活性以及脂多糖水平明显升高[43]。与本研究用MelonnPan预测代谢物的结果相反,但预测结果中这两者的改变并未有显著差异,且数值上变化都很小,甚至仅在10-6和10-7的数量级上发生变化,不足以作为结论的支撑依据。
无论是从症状还是肠道菌群分析来看,动物双歧杆菌乳亚种BL-99对便秘人群的干预效果可一直持续到干预停止后至少2周。本研究有一些局限性:1)尽管并未严格要求受试者在试验期间的饮食习惯,但应该进行饮食调查方便分析饮食对肠道微生物群组成的影响;2)本研究的样本量较少,代表性有限,可能导致统计功效不足,应该用更大的样本量进一步调查;3)未进行代谢组学检测,MelonnPan始终只是个预测工具,对于代谢组学的改变仍需进行真实的检测。
4 结论
综上所述,动物双歧杆菌乳亚种BL-99便秘症状缓解方面明显,但肠道菌群除了双歧杆菌属的菌种为差异物种外并未有显著变化,且干预效果可持续至干预结束后至少2周。这项研究强调了BL-99在便秘中的作用,可作为一个探索性试验,为设计更大规模的多中心、多种族群体和多亚型试验提供了信息。
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