2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)是一类以胰岛素抵抗和葡萄糖代谢紊乱为主要特征的慢性代谢性疾病,其发病率逐年升高,已成为严重威胁人类健康的重要公共卫生问题[1]。近年来,饮食干预与功能性低热量甜味剂的应用在糖尿病防治中的潜在价值受到广泛关注。D-阿洛酮糖(D-psicose)是一种稀有糖,热量极低,甜度约为蔗糖的70%[2]。多项动物实验及临床研究已证实,D-阿洛酮糖可有效抑制血糖升高、降低餐后血糖水平并改善葡萄糖耐量,其作用机制包括保护胰岛β细胞、提高胰岛素敏感性、改善胰岛功能,从而延缓甚至阻止糖尿病的发生与发展[3-4]。然而,现有D-阿洛酮糖的纯品制备工艺复杂且成本高昂,严重限制了其应用。该工艺的核心瓶颈在于:高度可逆的酶法转化导致大量D-果糖残留,而后者与目标产物D-阿洛酮糖因结构相似,其分离纯化面临极大困难。我们前期虽采用固定化酶纳米微球结合模拟移动床分离技术及冷却结晶技术实现了D-阿洛酮糖的制备,在一定程度上降低了生产成本,但整体工序仍然繁琐,产品价格较高[5-6]。相较之下,D-阿洛酮糖与D-果糖组成的混合糖液——阿果糖浆(psicose-fructose syrup)则展现出显著优势:它省去了高成本的分离纯化与结晶步骤,制备工艺更为简便,成本更低;同时,得益于高甜度果糖,其整体甜度高于纯D-阿洛酮糖,在保持良好口感的同时可减少添加量,从而为食品企业进一步降低使用成本,展现出广阔的应用前景。目前,关于阿果糖浆对糖尿病发生发展及肠道菌群结构影响的研究在国内外尚未见报道,其是否与D-阿洛酮糖纯品具有类似的降糖与改善胰岛素抵抗作用仍不明确。因此,本研究以糖脂代谢紊乱的糖尿病小鼠为模型,采用不同配比的阿果糖浆进行干预,系统评估其对生长性能、血糖、口服葡萄糖耐量(oral glucose tolerance test, OGTT)、糖化血红蛋白(glycated hemoglobin,HbA1c)、胰岛素水平、血脂代谢、肝功能、甲状腺功能及肠道菌群结构的影响,旨在明确阿果糖浆对糖尿病的潜在改善作用,并对其代谢调控机制进行初步探讨,为其在功能性食品开发及糖尿病防治中的应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
结晶D-阿洛酮糖(纯度99%),本实验室自制;结晶D-果糖,山东西王糖业有限公司馈赠;鼠维持料,广州市赛柏诺生物科技有限公司;高热能饲料,江苏美的生物医药有限公司;链脲佐菌素,Sigma公司;肝素钠,北京索莱宝科技有限公司;磷酸盐缓冲液,北京鼎国昌盛生物技术公司。
BarnsteadTM GenPureTM Pro水净化系统、FormaTM 900系列直立型超低温冰箱,美国Thermo Scientific公司;G-421血糖仪,爱奥乐医疗器械(深圳)有限公司;JE303GE电子天平,瑞士Mettler Toledo公司;LAB 5液氮罐,美国MVE Cryosystem公司;5424R离心机,德国Eppendorf公司;HE-ZHJ-20制冰机,青岛海尔生物医疗股份有限公司;BCD-190WDPT冷冻冷藏冰箱,海尔智家股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 实验动物与建模
实验选用4周龄健康雄性SPF级BALB/C小鼠(平均体重25 g),购自成都达硕实验动物有限公司。所有小鼠均在标准SPF级屏障环境下进行适应性饲养,环境条件控制为:温度(21±2) ℃、湿度(60±15)%,12/12 h明暗循环,小鼠可自由获取饲料和饮水。本研究的动物实验方案已通过伦理委员会审核批准(批准文号:〔2025〕54号),并严格遵循相关动物实验伦理规范。
为构建2型糖尿病模型,首先予以小鼠高热能饲料喂养3周以诱导胰岛素抵抗。随后,对禁食24 h(不禁水)的小鼠腹腔注射新鲜配置的链脲佐菌素(streptozotocin,STZ, 103～105 mg/kg BW)。注射后继续饲喂高热能饲料3～5 d,测量尾静脉空腹血糖。将血糖值持续≥11.1 mmol/L的小鼠判定为糖尿病造模成功。
1.2.2 分组与干预
小鼠经5 d适应性饲养后,随机分为4组(n=20),分组详情见表1。Nor组(正常对照组)小鼠继续饲喂鼠维持料。其余3组为糖尿病模型小鼠,均饲喂高热能饲料,并作如下区分:DM组仅给予高热能饲料;DM-LPsi组和DM-HPsi组均在饲喂高热能饲料基础上每日灌胃给予阿果糖浆(300 mg/kg BW),两组的干预区别在于阿果糖浆中阿洛酮糖与果糖的配比不同,分别质量比3∶7和7∶3。所有小鼠均以每笼5只的密度饲养,每4～6 d称量1次体重以记录变化。
表1 小鼠的分组与干预
Table 1 Grouping and interventions of mice
分组Nor组DM组DM-LPsi组DM-HPsi组小鼠模型正常鼠糖尿病鼠糖尿病鼠糖尿病鼠饲料鼠维持料高热能饲料高热能饲料高热能饲料灌胃干预不额外给糖不额外给糖每天阿果糖浆灌胃(300 mg/kg BW,阿洛酮糖∶果糖=3∶7)每天阿果糖浆灌胃(300 mg/kg BW,阿洛酮糖∶果糖=7∶3)
1.2.3 小鼠生长性能指标测定
日均增重:每隔4～6 d称重1次,早上9点定时称重,称重前禁食3 h,记录小鼠体重变化,计算日均值。日均采食量:给予每笼小鼠确定量的饲料,5 d后称量残余量,计算日均采食量。
1.2.4 小鼠血糖代谢评估
空腹血糖测定:小鼠禁食12 h(自由饮水)后,用体积分数为75%乙醇消毒尾部皮肤,使用一次性采血针穿刺尾静脉,取少量全血。采用G-421血糖仪及配套试纸条测定血糖值,单位为mmol/L。为确保准确性,每批次检测前均使用葡萄糖标准液对仪器进行校准。
OGTT实验:于干预结束前3 d进行OGTT实验。实验前,所有小鼠禁食4 h(自由饮水),测定其空腹血糖值,此时间点记为0 h。随后进行预处理,DM-LPsi组和DM- HPsi组分别给予由阿洛酮糖与果糖质量配比为3∶7和7∶3的阿果糖浆,DM模型组和Nor正常对照组不给予任何糖溶液,仅灌胃等体积的生理盐水。预处理15 min后,对所有组别的小鼠进行一次性葡萄糖灌胃(葡萄糖剂量2.5 g/kg 体重),分别于葡萄糖灌胃后的0.5 h和2 h再次采集尾静脉血测定血糖。
血糖曲线下面积(area under the curve, AUC)采用梯形法进行近似计算,按公式(1)进行:
(1)
式中:G0、G0.5和G2分别代表0、0.5、2 h的血糖测量值。
1.2.5 小鼠血液生化指标的测定
小鼠禁食12 h后,经10 g/L戊巴比妥钠麻醉,摘眼球采集全血。用于糖化血红蛋白检测的血液直接收集于专用采血管并送检。其余指标检测用血液收集于肝素钠抗凝管,冰上静置,于4 ℃、3 000 r/min条件下离心10 min(室温与冰上样本需分别在1 h和2 h内完成离心),收集上层血浆,分装后于-80 ℃保存待测。
血液样本(每组n≥5)委托西安迪安医学检验实验室有限公司进行检测。具体方法如下:
血脂四项:使用全自动生化分析仪检测甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)。
肝功能:采用生化法检测谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT);采用电化学发光法检测总胆红素(total bilirubin,TBiL)。
血清空腹胰岛素:采用电化学发光法。
HbA1c:采用免疫比浊法。
甲状腺功能:采用电化学发光法检测三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine,T3)、游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)、甲状腺素(thyroxine,T4)和游离甲状腺素(free thyroxine,FT4)。
1.2.6 样本采集及测序
肠道内容物采集:从各组随机挑选5只小鼠,腹腔注射戊巴比妥钠深度麻醉后颈椎脱臼处死。无菌条件下剖腹,取出肠道内容物放置于无菌冻存管中,并立即将冻存管置于液氮中冷冻4 h,确保冷冻充分,转移到-80 ℃冰箱中储存。样本经干冰运输寄送至GENEWIZ公司(苏州,中国)进行肠道菌群的16S rDNA测序。
肠道菌群的16S rDNA测序:肠道菌群16S rDNA测序相关工作委托GENEWIZ公司(苏州,中国)完成。首先提取粪便样本中的细菌DNA,针对16S rRNA基因的V3～V4区进行扩增,并使用Illumina MiSeq PE300平台进行高通量测序。获得的原始序列经Cutadapt(v1.9.1)、Vsearch(1.9.6)、Qime(1.9.1)等软件进行质量过滤和序列拼接,并剔除低质量序列、长度小于200 bp的短序列以及嵌合体序列。随后,对高质量有效序列进行聚类分析,将相似度高于97%的序列归为一个操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)。从每个OTU选取代表性序列,利用RDP classifier进行物种注释,进而解析各样本的菌群组成结构。同时,通过计算Shannon指数和Chao1指数,评估样本中微生物群落的物种多样性和丰富度。
1.3 数据分析
实验数据以“平均值±标准差”表示,每组数据均来自至少5次独立实验。使用SPSS软件对数据进行单因素方差分析。若总体比较存在显著差异,则进一步使用Dunnett检验,将各实验组与对照组进行两两比较。组间差异的统计学意义按以下标准判定:*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001;****,P<0.000 1。
2 结果与分析
2.1 阿果糖浆对糖尿病小鼠代谢调节作用
2.1.1 阿果糖浆对糖尿病小鼠生长性能的影响
小鼠进食量的结果如图1-a、图1-b所示。高热能饲料组(DM组、DM-LPsi组和DM-HPsi组)的进食量显著性低于普通饲料组(Nor组),说明与普通维持料相比,高热能饲料可降低小鼠的进食量。进一步比较发现,阿果糖浆灌胃组(尤其是DM-LPsi组)的进食量又显著低于未灌胃组(DM组)。其原因可能包括:一是灌胃操作带来的不适感降低了食欲,二是阿果糖浆(尤其是阿洛酮糖∶果糖=3∶7)的摄入会降低小鼠的进食量。此外,在第25天时,糖尿病模型组小鼠的进食量出现短暂下降,至第30天显示出恢复迹象。这主要是由于在第24天时,模型组小鼠被注射链脲佐菌素,造成其胰岛功能损伤,引发应激反应,从而暂时抑制了食欲。
a-食物摄入量随时间的变化;b-每日平均食物摄入量;c-体重随时间的变化;d-每日平均体重增加量
图1 阿果糖浆对小鼠进食量及体重的影响(n=20)
Fig.1 Effects of psicose-fructose syrup on food intake and body weight in mice (n=20)
a-血清葡萄糖水平;b-AUC
图2 阿果糖浆对小鼠口服葡萄糖耐量的影响
Fig.2 Effects of psicose-fructose syrup on oral glucose tolerance in mice
小鼠体重变化如图1-c、图1-d所示。与Nor组相比,DM组小鼠的平均进食量虽显著降低,但体重增量反而增加,说明高热能饮食联合胰岛素抵抗可导致小鼠脂肪堆积和肥胖。阿果糖浆干预13 d后,DM组与干预组(DM-LPsi和DM-HPsi)体重差异逐渐显现并随时间扩大。与DM组相比,阿果糖浆干预组体重增长显著放缓,自第22天起至实验结束体重趋于稳定,其中DM-LPsi组甚至出现了显著下降,而DM组仍持续增长。结果表明,阿果糖浆干预有助于控制糖尿病小鼠体重增加。
2.1.2 阿果糖浆对糖尿病小鼠葡萄糖耐量的影响
为评估阿果糖浆对小鼠血糖调节能力的影响,本研究进行了OGTT试验并计算了AUC。如图2所示,DM组小鼠在0 h的空腹血糖值显著高于Nor组(P<0.01),表明糖尿病造模成功。在糖负荷后,DM组血糖上升的幅度及AUC均明显高于正常组(P<0.01)。经阿果糖浆干预后,糖尿病小鼠的糖耐量得到了显著改善(P<0.01),其血糖水平接近正常组。具体表现为:干预组的血糖峰值(30 min)和AUC均显著低于DM组,且数值已十分接近正常水平。以上结果说明,阿果糖浆能够有效增强糖尿病小鼠葡萄糖处置能力,显著改善糖耐量损伤,具有很好的血糖稳态调控作用。
2.1.3 阿果糖浆对血糖控制及胰岛素功能的影响
为探究阿果糖浆对小鼠血糖控制能力及胰岛素功能的影响,本研究检测了小鼠的HbA1c和胰岛素水平。如图3结果显示,与Nor组相比,DM组小鼠的HbA1c含量显著升高(P<0.01),胰岛素水平也明显上升(P<0.05),表明模型小鼠存在高血糖与胰岛素抵抗。经阿果糖浆干预后,各处理组小鼠的HbA1c均显著降低,其中DM-HPsi的降低幅度尤为显著(P<0.01),提示阿果糖浆降血糖作用与其阿洛酮糖含量呈正相关。在胰岛素方面,阿果糖浆干预可降低DM小鼠的胰岛素水平,且DM-HPsi的降低效果更显著。以上结果说明,阿果糖浆能有效稳定糖尿病小鼠的血糖并显著改善其胰岛素抵抗,并且高阿洛酮糖配方(阿洛酮糖∶果糖=7∶3)的效果更为显著。
a-HbA1c;b-胰岛素
图3 阿果糖浆对小鼠HbA1c及胰岛素水平的影响
Fig.3 Effects of psicose-fructose syrup on glycated hemoglobin and insulin levels in mice
2.1.4 阿果糖浆对糖尿病小鼠血脂水平的影响
糖尿病常伴随血脂异常,表现为TG、TC和LDL-C升高,同时HDL-C降低,这增加了心血管疾病的风险[7-8]。因此,控制血脂水平对糖尿病防治至关重要。
如图4和电子版增强出版附图1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.045376,下同),长期高脂饲喂后,DM组小鼠的血清TG、TC和LDL-C水平均显著高于正常对照组(Nor组),说明糖尿病小鼠存在典型的血脂异常。经阿果糖浆干预后,糖尿病小鼠的血脂水平得到不同程度的改善。TG水平显著下降(P<0.01),DM-LPsi和DM-HPsi组的TG值接近正常组水平。TC和LDL-C水平有所下降,表明干预有一定的改善作用,但与DM组相比,差异未达到显著性水平。值得注意的是,DM-HPsi组小鼠的HDL-C水平显著升高,而DM-LPsi组对HDL-C无影响。以上结果说明,阿果糖浆能够显著改善糖尿病小鼠的血脂异常,尤其是降低血清TG水平,高阿洛酮糖含量的阿果糖浆还可能提高HDL-C水平。
a-TG;b-HDL-C
图4 阿果糖浆对小鼠主要血脂指标的影响(n=5)
Fig.4 Effects of psicose-fructose syrup on key serum lipid indicators in mice(n=5)
2.1.5 阿果糖浆对糖尿病小鼠肝功能的影响
肝脏是机体糖脂代谢的重要器官,糖尿病引起的代谢紊乱常导致不同程度的肝损伤。ALT、AST和TBil是反映肝功能状态的常用生化指标[9]。本研究通过检测这些指标,评估阿果糖浆对糖尿病小鼠肝功能的影响。
如图5和附图2所示,DM组小鼠血清ALT、AST 和TBil水平均显著高于正常对照组(Nor组)(P<0.05),表明糖尿病引起了一定程度的肝损伤。阿果糖浆干预后,DM-LPsi组和DM-HPsi组的小鼠AST和ALT水平均显著下降(P<0.05),接近正常组水平,而TBil未见显著变化。结果表明,阿果糖浆可显著降低糖尿病小鼠ALT和AST水平,从而在一定程度上减轻肝脏损伤。
a-AST;b-ALT
图5 阿果糖浆对小鼠血清AST和ALT水平的影响(n=5)
Fig.5 Effects of psicose-fructose syrup on serum AST and ALT levels in mice(n=5)
2.1.6 阿果糖浆对糖尿病小鼠甲状腺功能的影响
甲状腺在人体中负责物质和能量的代谢。糖尿病常伴随着甲状腺功能异常,这种异常不仅可能加剧糖尿病的病情,还可能导致糖脂代谢紊乱,增加患者的健康风险。FT3、T3、FT4和T4是反映甲状腺功能状态的重要生化指标,异常水平可能提示甲状腺功能异常。
如附图3所示,DM组小鼠的T4和FT4水平均显著升高,而T3和FT3水平未显著变化,提示糖尿病小鼠可能存在甲状腺功能异常的风险。阿果糖浆干预后,T4和FT4水平略有下降,但与DM组相比无显著性差异,说明阿果糖浆对糖尿病小鼠的甲状腺功能未产生显著改善作用。
2.2 测序质量与多样性分析
对20例小鼠肠道内容物样本(每组n=5)进行细菌16S rDNA基因V3～V4区高通量测序,共获得1 357 998条原始序列,经双端序列拼接、低质量过滤及嵌合体序列剔除,获得有效序列数量为1 176 735条(数据保留率86.7%),平均每个样品的有效序列为58 837条。序列平均长度452 bp,每个样本优质序列覆盖率均高于79%。基于97%相似度进行OTU聚类,共鉴定328个OTU。稀释曲线(附图4)显示,随测序深度增加,各组OTU数量进入平台期,不再增加,说明测序深度充分覆盖菌群多样性。
本研究基于Chao1指数和Shannon指数对小鼠肠道微生物菌群结构进行α多样性分析,以评估各组样本的物种丰度及多样性差异。如图6所示,基于α多样性指数绘制的箱线图直观展示了各组样本指数的分布情况,包括最大值、最小值、中位数及可能的异常值。结果显示,糖尿病对照组(DM组)的Chao1指数和Shannon指数低于正常组(Nor组),而经阿果糖浆干预后,该指数有所回升,但组间差异未达到统计学显著性(P>0.05),说明阿果糖浆干预对糖尿病小鼠肠道菌群的物种丰度和多样性影响有限。进一步通过主坐标分析(principal coordinates analysis, PCoA)评估样本间群落结构差异。如图6-c所示,前2个主坐标(PC1和PC2)分别解释了26.82%和14.35%的变异。PCoA图显示,正常组(Nor组)和各糖尿病组(DM组、DM-LPsi组及DM-HPsi组)能够明显区分,表明糖尿病状态引起肠道菌群结构改变。在干预组中,DM-LPsi组与DM组存在部分重叠,而DM-HPsi组与DM组在空间分布上呈现明显区分趋势,说明高阿洛酮糖含量的干预对菌群结构有一定的调节作用。综上,糖尿病小鼠和正常小鼠的肠道菌群结构存在显著差异。阿果糖浆干预,尤其是高剂量阿洛酮糖干预,可在一定程度上影响糖尿病小鼠的菌群组成,且该效应随阿洛酮糖含量的增加而更为明显。
a-Chao1指数;b-Shannon指数;c-PCA图
图6 小鼠肠道菌群多样性
Fig.6 Diversity of gut microbiota in mice
2.3 菌群结构分析
2.3.1 门水平菌群结构变化及阿果糖浆干预效应
为探究阿果糖浆干预对糖尿病小鼠肠道菌群结构的影响,在不同分类水平上分析了菌群构成。门水平分析结果(图7)显示,小鼠肠道菌群主要由厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、髌骨细菌门(Patescibacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和Epsilonbacteraeota组成。与Nor组相比,DM组出现显著的菌群失调,具体表现为:厚壁菌门相对丰度下降,厚壁菌门/拟杆菌门比值降低,以及革兰氏阴性菌/革兰氏阳性菌比值升高。经阿果糖浆干预后,与DM组相比,各干预组(DM-LPsi组和DM-HPsi组)的厚壁菌门/拟杆菌门比值显著回升,革兰氏阴性菌/革兰氏阳性菌比值则显著下降。这些结果表明,阿果糖浆干预有助于该改善糖尿病引起的肠道菌群结构紊乱,且DM-HPsi组的菌群构成更接近正常组水平,说明改善效果具有剂量依赖性。
a-Nor组;b-DM组;c-DM-LPsi组;d-DM-HPsi组;e-各组厚壁菌门/拟杆菌门比值;f-各组革兰氏阴性菌/革兰氏阳性菌比值
图7 小鼠肠道菌群门水平分析
Fig.7 Gut microbiota composition at the phylum level in mice
2.3.2 属水平菌群结构变化及阿果糖浆干预效应
对小鼠肠道菌群的属水平分析显示,阿果糖浆干预能够显著调节与糖尿病发生发展密切相关的微生物组成。在属水平共鉴定出91个菌属,并对其中相对丰度>1%且丰度排名前30的菌属进行重点分析。这些关键菌属的门类归属如下:厚壁菌门(Firmicutes)有18个菌属,分别是乳杆菌属(Lactobacillus)、粪杆菌属(Faecalibaculum)、布劳特氏菌属(Blautia)、Ruminococcus torques group、Lachnospiraceae NK4A136 group、Ruminococcaceae UCG-014、罗姆布茨菌属(Romboutsia)、Eubacterium fissicatena group、链球菌属(Streptococcus)、Lachnospiraceae UCG-006、Lachnoclostridium、杜氏杆菌属(Dubosiella)、粪异杆菌属(Allobaculum)、Family XIII AD3011 group、Anaerotruncus、瘤胃梭菌属 9 (Ruminiclostridium 9)、Erysipelatoclostridium、肠球菌属(Enterococcus);拟杆菌门(Bacteroidetes)有5个菌属,分别是拟杆菌属(Bacteroides)、臭气杆菌属(Odoribacter)、另枝菌属(Alistipes)、Rikenellaceae RC9 gut group、文肯菌属(Rikenella);变形菌门(Proteobacteria)有4个菌属,分别是埃希氏-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、摩根菌属(Morganella)、副萨特氏菌属(Parasutterella);髌骨细菌门(Patescibacteria)的Candidatus Saccharimonas属,脱铁杆菌门(Deferribacteres)的Mucispirillum,及Epsilonbacteraeota门的螺杆菌属(Helicobacter)。如附图5所示,这些菌属的系统发育关系通过进化树直观呈现(附图5-A),不同组别间的丰度差异通过热图展示(附图5-B),共同表明阿果糖浆干预对肠道菌群结构具有显著影响。
进一步比较发现(图8),与Nor组相比,DM组小鼠肠道中Bacteroides属和Alistipes属的相对丰度显著升高,而Lactobacillus属、Lachnospiraceae NK4A136 group属及Lachnoclostridium属的相对丰度则明显下降。阿果糖浆干预可显著逆转上述菌群失衡,表现为Bacteroides属和Alistipes属丰度的回调,并显著降低了糖尿病小鼠肠道内Helicobacter属的丰度。上述3个菌属与糖尿病和炎症密切相关[10-12]。同时,阿果糖浆干预显著提高了Blautia属、Faecalibaculum属、Romboutsia属、Mucispirillum属和Dubosiella属的相对丰度;除Mucispirillum属之外,其余菌属的丰度提升均与阿洛酮糖含量呈正相关。上述菌属多为已报道具有短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)产生潜力的有益菌群[13-14]。
a-Nor组与DM组在属水平上具有显著差异的物种;b-阿果糖浆干预后属水平的差异物种
图8 肠道菌群在属水平上具有显著变化的物种
Fig.8 Significantly different bacterial genera in the gut microbiota
2.3.3 差异菌属与代谢指标的Spearman相关性分析
为进一步明确差异菌属在糖脂代谢改善中的潜在作用,本研究对主要差异菌属与代谢指标(胰岛素、HbA1c、TG、HDL-C、ALT、AST)进行了 Spearman 相关性分析。结果显示(图9),Bacteroides、Alistipes及 Helicobacter与血糖和血脂异常指标呈一致正相关:Bacteroides与胰岛素、HbA1c、TG、AST、ALT 呈强正相关,Alistipes与胰岛素、HbA1c、AST 呈显著正相关,提示二者的增多与长期血糖升高、胰岛素抵抗加重及肝脏损伤的变化趋势一致。相反,多种干预后上调的有益菌则表现出一致的负相关趋势: Faecalibaculum、Blautia、Romboutsia、Dubosiella均与 HbA1c、TG、ALT、AST 呈负相关,说明这些菌属的恢复与血脂异常和肝损伤的改善密切相关。总体而言,糖尿病状态下上升的炎症相关菌多与代谢恶化呈正相关,而阿果糖浆促进上调的有益菌则与这些指标呈显著负相关。
图9 差异肠道菌属与代谢指标的Spearman相关性热图
Fig.9 Spearman correlation heatmap between differential gut microbial genera and metabolic indices
3 讨论
本研究系统评估了阿果糖浆对糖尿病小鼠多层面生理与代谢功能的影响,结果表明,阿果糖浆可通过多通路改善糖尿病相关的代谢紊乱,表现为显著的降糖、调脂、护肝及肠道菌群调节作用,体现出其作为功能性糖替代品的潜在营养价值。
在生长性能方面,阿果糖浆干预显著抑制了糖尿病小鼠体重增长,尤其在DM-LPsi组中的表现更为显著。高热能饮食虽使进食量下降,但能量摄入过剩仍导致体重持续增加;阿果糖浆干预进一步降低进食量并延缓体重上升,提示其可能通过调节能量代谢及食欲相关激素改善糖尿病小鼠的肥胖状态。已有研究证实,D-阿洛酮糖可通过抑制能量吸收、促进脂肪氧化及激活胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)信号途径实现体重控制[15],与本研究结果一致。
OGTT试验显示,阿果糖浆显著增强糖尿病小鼠的葡萄糖处置能力,改善糖耐量损伤。结合空腹血糖与胰岛素检测结果可见,阿果糖浆显著降低空腹血糖并改善胰岛素抵抗,且高阿洛酮糖配方的效果更为显著,表明其血糖稳态调控作用与阿洛酮糖比例呈正相关。已有研究表明,补充D-阿洛酮糖可显著降低2型糖尿病患者餐后血糖峰值,减少胰岛素需求,并通过激活AMPK信号通路、增强GLUT4转运活性及保护胰岛β细胞功能发挥降糖作用[16-19]。尽管本研究未直接检测胰岛素信号通路关键分子(如AMPK或GLUT4等)的表达水平或活化状态,但空腹血糖、葡萄糖耐量及胰岛素水平等指标的显著改善,与既往文献中关于阿洛酮糖调节糖代谢作用的研究结果具有良好一致性。这些结果提示,阿果糖浆中所含阿洛酮糖可能在改善糖代谢紊乱的过程中发挥重要作用;然而,鉴于阿果糖浆为双组分体系,其整体调控作用所涉及的具体分子机制仍有待在后续研究中通过检测肝脏或骨骼肌相关信号通路蛋白的表达及活化情况进一步阐明。
在血脂代谢方面,糖尿病模型小鼠表现出典型的高TG、高TC、高LDL-C和低HDL-C特征。阿果糖浆干预显著降低了TG水平,使其接近正常组水平,同时高阿洛酮糖组显著提高HDL-C水平,表明阿果糖浆可有效改善糖尿病性血脂异常,对防控糖尿病相关心血管风险具有积极意义。
肝功能检测显示,糖尿病小鼠ALT、AST及TBil水平均显著升高,提示存在肝功能损伤。阿果糖浆干预后,ALT和AST显著下降,接近正常水平,说明其可有效改善糖尿病引起的肝功能受损。已有研究表明,D-阿洛酮糖可减轻高脂饮食诱导的胰岛素抵抗和氧化应激,促进脂联素分泌并增强脂肪酸β-氧化,从而减轻肝脏脂质堆积与炎症反应[20-22]。因此,阿果糖浆的护肝作用可能与其改善胰岛素敏感性及脂质代谢重塑有关。
甲状腺功能方面,糖尿病小鼠T4和FT4水平升高,而T3和FT3水平无显著变化,提示糖尿病可能伴随轻度甲状腺功能异常。阿果糖浆干预后,T4和FT4水平略有下降趋势,但改善并不显著,说明其对甲状腺功能影响有限。
肠道菌群在机体能量代谢、炎症反应及糖代谢稳态的维持中发挥着关键作用,其组成失衡被认为是2型糖尿病发生与进展的重要因素之一[23]。本研究发现,糖尿病模型小鼠肠道菌群结构发生显著紊乱,表现为厚壁菌门相对丰度下降,厚壁菌门/拟杆菌门比值降低,以及革兰氏阴性菌/革兰氏阳性菌比值升高。既往研究多认为厚壁菌门/拟杆菌门比值升高与肥胖及能量代谢异常密切相关,部分报道指出2型糖尿病患者中厚壁菌门/拟杆菌门比值显著高于正常对照[14, 24-26];但也有研究发现糖尿病及其并发症患者中厚壁菌门丰度下降[27]。KUSNADI等[23]指出糖尿病患者虽存在肠道菌群失调,但厚壁菌门/拟杆菌门比值的变化方向(升高或降低)并不一致,可能与模型类型、疾病阶段及宿主代谢状态差异有关。本研究采用高热能饮食联合单次高剂量STZ诱导的糖尿病模型,可能引起显著的急性肠道应激反应。STZ的毒性作用及其对肠黏膜屏障的损伤,可能会抑制Lactobacillus等厚壁菌门有益菌生长,从而导致厚壁菌门/拟杆菌门比值降低。此外,革兰氏阴性菌比例升高可导致血清脂多糖水平增加,进而激活炎症反应,加剧代谢异常[28]。本研究中,阿果糖浆干预下显著改善了小鼠肠道菌群结构,表现为厚壁菌门/拟杆菌门比值显著回升,革兰氏阴性菌/革兰氏阳性菌比值显著下降,尤其是DM-HPsi组的菌群构成更接近正常组水平。以上结果表明,阿果糖浆调节肠道菌群的有益效应主要归因于其中的阿洛酮糖,且该效应具有剂量依赖性,即随阿洛酮糖剂量的增加而增强。
属水平分析进一步揭示,阿果糖浆干预能够显著调节糖尿病相关菌群组成。糖尿病模型组小鼠中,与炎症及代谢紊乱密切相关的Bacteroides和Alistipes相对丰度显著升高,而益生菌Lactobacillus、Lachnospiraceae NK4A136 group及Lachnoclostridium相对丰度显著下降。已有研究表明,2型糖尿病发展中益生菌的减少可能会激活RLRs信号通路,加剧炎症与代谢紊乱[29]。阿果糖浆干预后,Bacteroides、Alistipes和Helicobacter等菌属的相对丰度明显降低,同时Blautia、Faecalibaculum、Romboutsia、Mucispirillum和Dubosiella等有益菌属的丰度显著增加。既往研究报道, Blautia属、Faecalibaculum属、Romboutsia属能够发酵产生SCFAs,可促进胰岛素分泌、增强β细胞功能,并通过激活G蛋白偶联受体(GPR41/GPR43),促进GLP-1和厌食神经肽肽YY的分泌,从而协同调节血糖、食欲与胰岛素分泌[13-14,30-31]。Mucispirillum和Dubosiella的增加同样具有积极意义。前者可抵御沙门氏菌诱导的肠道炎症,其数量减少被视为胃肠道疾病的潜在标志[32];后者展现出显著的益生菌潜力,其增加有助于增强肠道黏膜屏障功能、减少有害物质跨膜通透,从而维护肠道健康。多项研究提示,Dubosiella的丰度与多种有利健康指标呈正相关,如胰岛素敏感性(GLP-1、HOMA-ISI)、血脂水平(如HDL-C)及机体抗氧化能力(如谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶);同时与空腹血糖、胰岛素抵抗、LDL-C等不利指标呈负相关[26,33-35]。
为直接验证上述菌群变化与宿主代谢改善的关联,我们进一步进行了Spearman相关性分析。结果显示,Bacteroides、Alistipes和Helicobacter与HbA1c、胰岛素、TG、AST 及ALT水平呈显著正相关;相反,在阿果糖浆干预后显著提升的Blautia、Faecalibaculum、Romboutsia与Dubosiella则与上述代谢异常指标呈一致负相关。这一结果直接将有益菌属的恢复与糖脂代谢和肝脏功能的改善联系起来,为阿果糖浆通过重塑肠道菌群来缓解代谢异常提供了关键的统计学证据。综合现有结果,阿果糖浆可能通过调节肠道菌群结构,如降低部分与代谢紊乱或炎症相关菌属的相对丰度,并增加具有SCFAs产生潜力的菌属比例,从而参与肠道微生态稳态的维持。该作用可能与其改善糖脂代谢表型相关,但是否经由SCFAs介导仍需在后续研究中结合代谢物水平的直接检测加以验证。
总体看来,阿果糖浆可通过多机制协同作用显著改善糖尿病小鼠的代谢异常,其综合效应主要体现在:①降低血糖水平、改善胰岛素抵抗;②调节血脂代谢,降低TG并升高HDL-C;③减轻肝功能损伤;④恢复肠道菌群结构稳态,促进微生态平衡的重建。其代谢调控作用可能与阿洛酮糖的多重生理活性密切相关。
4 结论
本研究系统评价了阿果糖浆对糖尿病小鼠多层面生理与代谢功能的影响。结果表明,阿果糖浆可改善糖尿病相关代谢紊乱,表现出显著的降糖、调脂与护肝作用。阿果糖浆干预显著降低空腹血糖水平、改善胰岛素抵抗并促进糖耐量恢复;同时显著降低TG水平、提高HDL-C含量,体现其在糖脂代谢调节中的综合效应。肝功能检测结果显示,阿果糖浆能显著降低ALT和AST活性,减轻糖尿病小鼠的肝脏损伤。此外,阿果糖浆可在一定程度上改善糖尿病小鼠的肠道菌群失衡,使厚壁菌门/拟杆菌门比值回升并增加有益菌群的丰度。相关性分析进一步揭示,这些菌群变化与宿主代谢指标的改善显著相关。
综上所述,阿果糖浆干预可显著改善糖尿病小鼠的糖脂代谢紊乱、肝功能损伤及肠道菌群失衡,表现出良好的综合代谢调节效应。作为由D-阿洛酮糖与D-果糖组成的功能性糖浆,阿果糖浆在未进行高纯度分离的情况下仍能够发挥显著的代谢改善作用,显示出其在代谢调控中的应用潜力。该结果为基于复合糖配方的功能性食品开发提供了新的研究思路,并显示出阿果糖浆在糖脂代谢健康干预相关营养策略中的潜在应用价值。
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