索马甜(thaumatin,Tha)是一种天然甜味剂,别名非洲竹芋甜、沙马汀,是从非洲竹芋的果实(Thaumatococcus danielli)当中提取的植物性甜味蛋白[1]。该蛋白由207个氨基酸残基组成,相对分子质量为22 kDa,含有8个二硫键。索马甜具有很强的甜味,摩尔甜度约为蔗糖的1×105倍,质量甜度约为蔗糖的1 600倍,甜味阈值约为50 nmol/L,即使稀释至10-8 mol/L仍可被感知[2]。此外,索马甜极易溶解,甜味持久,热量极低(约为4.2 kcal/g),且可被生物降解为人体所需的氨基酸,具有显著的健康优势,符合大众消费需求和食品添加剂的发展趋势。
研究者们对索马甜的生产展开了一系列研究。VAN DER WEL等[3]和LEE等[4]分别在1972年和1988年提取出了thaumatin Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和thaumatin A、B,其中最主要的是thaumatin Ⅰ和Ⅱ,且其结构差异仅为3%。1982年,EDENS等[5]首次在大肠杆菌中克隆并表达了索马甜基因,但产出的索马甜产量较低。2004年, MASUDA等[5]在毕赤酵母中表达索马甜,获得约25 mg/L的重组索马甜。2016年,FRIRSOV等[6]在番茄植株中表达获得了50 mg/kg的索马甜。目前,索马甜在酿酒酵母和毕赤酵母中的发酵罐表达水平分别可达140 mg/L[5]和100 mg/L[7]。
毕赤酵母(Pichia pastoris)作为一种备受关注的酵母表达平台,能够高效表达真核生物来源的目的蛋白[8]。首先,毕赤酵母具有高效的分泌能力,可显著简化蛋白的纯化过程并降低生产成本。其次,毕赤酵母能够进行糖基化、二硫键形成[9]等翻译后修饰,有助于重组索马甜的正确折叠和活性表达,这对于生产具有甜味活性的重组索马甜至关重要。此外,毕赤酵母能够实现高细胞密度发酵[10],从而提高重组索马甜的产量。同时,其严格的代谢调控、对廉价培养基的适应性、高安全性、简便的基因操作、良好的环境适应性以及系统生物学支持等特性,使其成为生产重组索马甜的理想宿主,有助于实现高效、低成本且稳定的工业化生产。
本研究拟将天然甜味剂Tha的基因在毕赤酵母中进行重组表达,并通过启动子筛选、信号肽筛选、基因剂量优化和共表达分子伴侣等手段进一步提高产量。相关结果不仅为Tha的生产提供了新的技术路径,还为其他重组蛋白的高效表达提供了参考和借鉴。同时本研究为Tha的工业化应用奠定了基础,能更好地满足市场对天然甜味剂的需求,推动相关产品的开发和应用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
本研究中构建菌株大肠杆菌(Escherichia coli) JM109、发酵菌株毕赤酵母GS115及质粒pPIC9K(带有α-factor信号肽,用于分泌表达)、pGAPZA(无信号肽,用于胞内表达分子伴侣)均保藏于作者所在实验室。
限制性内切酶和T4连接酶,TaKaRa公司;质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,北京天根生化科技有限公司;蛋白凝胶电泳试剂盒,上海诺维赞生物技术有限公司;蛋白浓度测定试剂盒,碧云天生物技术(上海)有限公司。质粒测序与引物合成由安升达和擎科生物科技公司负责。
LB培养基(g/L):酵母提取物5.0,蛋白胨10.0,NaCl 10.0, 121 ℃灭菌20 min(固体培养基含15～20 g/L质量体积比的琼脂粉)。
完全培养基(yeast extract peptone dextrose medium,YPD,g/L):酵母提取物10.0,蛋白胨20.0,葡萄糖20.0,115 ℃灭菌30 min(固体培养基含15 g/L的琼脂粉)。
10×无氨基酸酵母氮源(yeast nitrogen base,YNB,13.4%质量分数的无氨基酸酵母氮源):134.0 g YNB定容至1 L,过滤除菌,4 ℃避光保存。
500×B(0.02%质量分数生物素):20.0 mg B定容至100 mL,过滤除菌,4 ℃保存。
10×D(20%质量分数葡萄糖):200.0 g D-葡萄糖定容至1 L,过滤除菌,4 ℃保存。
选择培养基(minimal dextrose medium,MD):2.0 g琼脂糖加80 mL去离子水,121 ℃灭菌20 min,待温度降至60 ℃后在超净台上加入10 mL 10×YNB,10 mL 10×D,0.2 mL 500×B。
甘油复合生长培养基(buffered glycerol-complex medium,BMGY):10.0 g酵母提取物,20.0 g蛋白胨,3.0 g K2HPO4,11.8 g KH2PO4,定容至890 mL,121 ℃ 灭菌20 min,待温度降至60 ℃后在超净台上加入100 mL 10×YNB,1 mL 500×B,10 mL甘油。
甲醇复合诱导培养基(buffered methanol-complex medium ,BMMY):10.0 g酵母提取物,20.0 g蛋白胨,3.0 g K2HPO4,11.8 g KH2PO4,定容至895 mL,121 ℃灭菌20 min,待温度降至60 ℃后在超净台上加入100 mL 100×YNB,1 mL 500×B,5 mL甲醇。
种子培养基(g/L):酵母提取物10.0,蛋白胨20.0,YNB 13.4,甘油30.0,121 ℃灭菌20 min。
酵母发酵专用微量元素液(PTM1 trace salts,PTM)微量元素液:3.0 g CuSO4·5H2O,0.04 g KI,1.5 g MnSO4·H2O,0.01 g H3BO3,0.1 g Na2MoO3·2H2O,0.25 g CoCl2,10.0 g ZnCl2,32.5 g FeSO4·7H2O,0.1 g生物素,2.5 g H2SO4,定容至500 mL,过滤除菌,4 ℃避光保存。
高密度发酵基础盐培养基(basal salt medium,BSM)培养基:40.0 g甘油,40.0 g (NH4)2HPO4,14.9 g MgSO4·7H2O,18.2 g K2SO4,6.0 g KH2PO4,0.94 g CaSO4·2H2O,0.83 g KOH,4.32 mL PTM微量元素液,定容至1 L,121 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
4309电击转化仪,德国Eppendorf公司;DYY-6C核酸电泳仪、Mini Protein 3蛋白凝胶电泳仪,北京六一电泳仪器厂;A24812 PCR仪,赛默飞世尔科技有限公司;MINI Space 1000凝胶成像仪,上海天能科技有限公司;5427 R高速离心机,德国Eppendorf公司;PYX-DHS恒温培养箱,上海医疗器械研究所。
1.3 实验方法
1.3.1 重组Tha表达系统的构建及筛选
实验室前期已对Tha基因序列进行了密码子优化,并设计引物,通过PCR扩增技术成功获得Tha基因。随后,采用Gibson组装法将目的基因连入pPIC9K,并利用化学转化法转至JM109感受态细胞,测序验证得到正确的重组质粒pPIC9K-Tha。将该重组质粒用Q.cut Sal Ⅰ进行线性化处理后,利用电击转化法转入毕赤酵母宿主菌株GS115感受态细胞中,并利用MD板进行阳性克隆筛选。从平板上挑取单个阳性转化子GS115-Tha接种于10 mL YPD培养基中,在30 ℃、200 r/min条件下培养24 h,以实现菌种活化。随后,按5%接种量转接至50 mL BMGY培养基中,于30 ℃、200 r/min条件下培养48 h,使菌体进入对数生长期。培养完成后,于超净台中将培养液转至50 mL离心管,4 ℃、4 000 r/min离心5 min,去除上清液,再用等体积的BMMY培养基重悬。随后在30 ℃、200 r/min条件下诱导表达120 h,期间每隔24 h补加1.5%(体积分数)甲醇,以维持甲醇诱导系统的活性。诱导表达结束后,离心收集上清液,并采用SDS-PAGE法进行重组蛋白的验证。
由杂合信号肽引导的重组Tha表达系统构建方法同上,本研究涉及的14个信号肽见表1。
表1 本研究涉及的信号肽
Table 1 The signal peptides involved in this study
名称信号肽序列参考文献0030毕赤酵母PAS_chr3_0030的信号肽MKFAISTLLIILQAAAVFAA[11]ExpL KR毕赤酵母PAS_chr3_0076的信号肽MKLSTNLILAIAAASAVVSAAPVAPAEEAANHLHKR[12]ExpL SP毕赤酵母PAS_chr3_0076的信号肽MKLSTNLILAIAAASAVVSA[12]INU1马克思克鲁维酵母菊粉酶信号肽MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKR[13]MEL1酿酒酵母α-半乳糖苷酶信号肽MRAFLFLTACISLPGVFGVNET[14]OST1酿酒酵母糖蛋白糖基转移酶亚基信号肽MRQVWFSWIVGLFLCFFNVSSA[15]PAA黑曲霉α-淀粉酶信号肽MVAWWSLFLYGLQVAAPALA[16]PALGallus gallus溶菌酶信号肽MLGKNDPMCLVLVLLGLTALLGICQG[16]PHO11酿酒酵母酸性磷酸酶信号肽MLKSAVYSILAASLVNA[17]PROSCW10毕赤酵母细胞壁蛋白信号肽MQVKSIVNLLLACSLAVARPLEHAHHQHDKR[11]SCW10毕赤酵母细胞壁蛋白信号肽MQVKSIVNLLLACSLAVA[11]SUC2酿酒酵母蔗糖转换酶信号肽MLLQAFLFLLAGFAAKISA[18]UTH1毕赤酵母线粒体外膜和细胞壁定位SUN 家族成员的信号肽MKSQLIFMALASLVAS[11]KexEA-α酿酒酵母经改造后的α交配因子信号肽MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTEEGVSLEKREAEAEA[16]
1.3.2 多拷贝酵母表达载体的构建
本研究采用“同尾酶”法构建多拷贝重组质粒,以构建GS115-2Tha为例(图1)。首先,分别使用Q.cut Bgl Ⅱ和Q.cut Sal Ⅰ以及Q.cut BamH Ⅰ和Q.cut Sal Ⅰ对GS115-Tha单拷贝质粒进行双酶切。其中,Q.cut Sal Ⅰ为非唯一酶切位点。酶切产物利用1%琼脂糖凝胶进行电泳分离;若条带接近,可改用低浓度凝胶。使用DNA胶回收试剂盒回收含有Tha基因表达盒的片段。随后,将回收的载体与片段在T4 DNA连接酶的作用下,于16 ℃孵育12 h进行连接反应。取10 μL连接产物转化JM109感受态细胞,挑选单菌落进行酶切验证,以确保拷贝数正确。按照相同方法,依次构建含有3、4、5、6拷贝目的基因的重组质粒。将上述构建的多拷贝表达质粒按照1.3.1节所述方法电转至毕赤酵母GS115感受态细胞中,并通过发酵验证其表达情况。
图1 “同尾酶”法构建Tha多拷贝表达载体的示意图
Fig.1 Schematic diagram of the construction of multi-copy Tha expression vector using the “isoschizomer” method
1.3.3 共表达分子伴侣的构建
本研究共筛选16种伴侣蛋白见表2。以毕赤酵母基因组为模板,通过PCR扩增技术分别获得上述分子伴侣基因。随后,利用Gibson组装法将这些目的基因与pGAPZA载体进行组装,并转化至JM109感受态细胞中。经测序验证,确认重组质粒构建正确后,将16个重组质粒分别用Q.cut Bln Ⅰ进行线性化处理,并按照1.3.1节所述方法电转至毕赤酵母GS115-4Tha感受态细胞中。最后,通过发酵验证共表达各分子伴侣对Tha表达情况的影响。
表2 本研究涉及的伴侣蛋白
Table 2 The chaperone proteins involved in this study
名称功能参考文献Bmh2参与蛋白离开内质网过程的14-3-3型蛋白[19]Bip参与蛋白质输入内质网,也作为伴侣调节蛋白质折叠[20]Ero1内质网氧化还原酶,参与内质网中二硫键的形成过程[21]Gcn4是酵母中氨基酸生物合成基因的关键转录激活因子[22]Hac1UPR转录激活因子,参与蛋白折叠和转运、内质网质量控制和相关蛋白降解[23]Hrd1E3泛素连接酶,参与内质网中错误折叠蛋白的降解[24]Mpd1Pdi1的同源酶[25]Pdi1蛋白质二硫键异构酶[26]Pdi2蛋白质二硫键异构酶[27]Sec1参与外泌泡对接和融合的类Sm蛋白[28]Sec53与分泌蛋白的折叠和糖基化加工过程有关的磷酸甘露糖变位酶[29]Sil1内质网腔内Hsp70伴侣蛋白Kar2p的核苷酸交换因子[30]Sly与v-SNARE蛋白互作促进囊泡膜融合[31]Ssa4在蛋白共翻译转运过程中负责将新生蛋白引导到内质网膜上[32]Sso2主要参与辅助分泌小泡与细胞质膜的融合[32]Ubc1负责选择性的降解构象错误的蛋白[33]
1.3.4 3-L发酵罐分批补料培养
摇瓶种子准备:将重组菌株于YPD平板划线活化,30 ℃培养48 h。挑选单菌落至10 mL YPD培养基, 30 ℃、200 r/min培养24 h。从10 mL YPD培养基中接种1%至100 mL种子培养基,30 ℃、200 r/min培养24 h。
甘油发酵阶段:将含有4%甘油的BSM培养基放入发酵罐,实消。通冷凝水将温度降至30 ℃,并用氨水将pH值调至5.0。将100 mL种子培养基接种至发酵罐中,同时加入4.4 mL PTM。待溶氧反弹,以32 mL/(L·h)流速补加甘油,每升甘油补料含有12.3 mL PTM。
甲醇发酵阶段:停止甘油进料后,饥饿2 h,使甘油消耗完全,以充分激活PAOX1的转录活性。每升甲醇补料含有12.5 mL PTM。甲醇流加速度如下:1～4 h:3.6 mL/(L·h);4～6 h:7.3 mL/(L·h);6 h往后:10.9 mL/(L·h)。
1.3.5 SDS-PAGE分析
根据索马甜蛋白大小采用12%分离胶进行电泳分析,配制方法详见蛋白质快速凝胶电泳试剂盒(SDS-PAGE)说明书。取20 μL发酵上清液与5 μL 5×SDS蛋白上样缓冲液混匀,金属浴100 ℃加热变性5 min,短暂离心使所有液体进入底部。上样量依据凝胶孔数调整:10孔胶每孔上样8 μL,15孔胶每孔上样5 μL,蛋白质分子质量标准品统一上样5 μL。点样完毕,初始电泳电压设置为90 V,待条带越过浓缩胶时,电压遂升至120 V进行分离。电泳结束后,将凝胶置于考马斯亮蓝R-250染色液中染色,随后进行2次快速脱色处理,更换新鲜脱色液后于摇床上缓慢脱色过夜。最后使用凝胶成像系统采集图像并保存。
1.3.6 Image J灰度分析
打开Image J软件,点击选择上步凝胶图像File→Open,转灰度Image→Type→8-bit,去除背景Process→Subtract Background→50→OK,点击矩形工具,框选蛋白条带,把当前矩形注册为1号泳道,便于后面“等距批量复制”:Analyze→Gels→Select First Lane,Analyze→Gels→Plot Lanes,出现“峰形曲线”,峰面积正比于蛋白量,点击直线工具给每个峰画基线,点击积分工具得到各个条带所对应的峰面积,目的蛋白峰面积占总峰面积的百分比即最终的灰度占比,结合总蛋白浓度可得对应蛋白量。
1.3.7 HPLC分析
本研究HPLC分析主要参考JOSEPH等[34-35]所述方法。发酵上清液经0.22 μm滤膜过滤制成样品,标品由上海源叶科技有限公司提供,纯度98%。检测仪器为:Waters e2695型高效液相色谱仪,检测条件为:色谱柱Zorbax SB 300-C8(4.6 mm×150 mm,5 μm),保护柱Zorbax SB 300 C8(4.6 mm×12.5 mm,5 μm),流动相A:水、乙腈和三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)按950∶>50∶>0.5(体积比)混合,流动相B:乙腈、水和TFA按950∶>50∶>0.25(体积比)混合,流速0.8 mL/min梯度洗脱,进样量15 μL,柱温40 ℃,检测波长220 nm。
1.4 数据处理与分析
本研究数据皆为3次平行测定,表示为“平均数±标准差”。使用Image J进行灰度分析,使用Origin 2021进行图表绘制。
2 结果与分析
2.1 启动子对Tha表达量的影响
本研究比较了在毕赤酵母中广泛使用的3种启动子(甲醇诱导型启动子PAOX1、组成型启动子PGAP和PGCW14)对Tha表达量的影响。按照1.3.1节方法构建重组表达载体pPIC9K-Tha、pGAPZαA-Tha和pGCW14ZαA-Tha(图2-a),电转化至毕赤酵母GS115感受态后获得重组菌株GS115-pPIC9K-Tha、GS115-pGAPZαA-Tha和GS115-pGCW14ZαA-Tha。挑取生长状态良好的单菌落进行发酵验证,使用SDS-PAGE分析上清液中蛋白分泌情况,检测到约22 kDa的蛋白条带(图2-b),与预测的Tha分子质量大小一致,PAOX1、PGAP和PGCW14所对应的Tha产量分别为33.37、26.67和24.51 mg/L(图2-c)。结果显示PAOX1诱导型表达系统产量最高,因此,后续研究将在PAOX1启动子的基础上进行。
M:Marker(下同)。
a-构建示意图;b-发酵上清液SDS-PAGE检测结果;c-生长情况和Tha产量
图2 不同启动子对Tha表达水平的影响
Fig.2 The effects of different promoters on the expression levels of Tha
2.2 杂合信号肽对Tha表达量的影响
杂合信号肽是指通过基因工程技术将不同信号肽特性结合在一起的产物,在一定程度上能提高蛋白质的转运效率。如BARRERO等[36]将Ost1信号序列和α因子前导序列组成杂合信号肽,其脂肪酶BTL2的分泌水平与原始α因子相比提高了10倍。本研究共挑选了14种不同来源的信号肽(表1)与α因子pro区域进行融合,考察其对Tha表达量的影响。
SDS-PAGE结果显示(图3-a),杂合信号肽OST1-α、PROSCW10-α、SCW10-α、KexEA-α所引导的跨膜转运效率明显提升,与原α-factor信号肽相比,Tha表达量分别增加了20.89%、20.76%、21.35%、43.52%(图3-b),其中KexEA-α表达量最高,达到了47.89 mg/L。前3个杂合信号肽的疏水性核心区域较长(8～17 aa)、疏水性较高(>2.5),KexEA-α的疏水核心更长达20 aa,有助于与SRP的高效结合,能更好的靶向内质网膜,减少胞质滞留和mRNA衰减。且PROSCW10-α、SCW10-α、KexEA-α都含有N-糖基化位点,有助于Tha在内质网中的正确折叠和修饰。除此之外,KexEA-α的长度较短,可使新生多肽链更快地进入内质网,从而更早地接触到有助于二硫键形成的分子伴侣和氧化环境。这对于含有多个二硫键的Tha尤为重要,因为早期进入内质网可以减少在细胞质中的错误折叠和聚集。
a-不同杂合信号肽的发酵上清液SDS-PAGE检测结果;b-不同杂合信号肽的生长情况和Tha产量
图3 不同杂合信号肽对Tha表达水平的影响
Fig.3 The effects of different hybrid signal peptides on the expression levels of Tha
2.3 拷贝数对Tha表达量的影响
通过增加基因拷贝数以提高转录水平是提升目的基因表达量的有效策略,在毕赤酵母重组蛋白的生产过程中,基因拷贝数已被广泛认为是一个关键的“限速”因素[37]。通常情况下,基因拷贝数增加会使得相应的mRNA量增多,进而提高蛋白质的表达量,然而,这种关系并非总是线性的,过高的基因拷贝数可能给细胞带来额外的代谢压力,影响细胞的正常生长和蛋白质的正确折叠,确定最佳拷贝数可在不加重细胞代谢负担的前提下,实现高效表达。
按照1.3.2节方法将1～6拷贝构建完成后,分别线性化电转至GS115感受态,发酵结果显示(图4):随着Tha基因拷贝数从单拷贝逐步增加至4拷贝,目的蛋白表达量逐渐上升,GS115-4Tha表达量达到了60.12 mg/L,为单拷贝的1.56倍,表明此时细胞的代谢能力和蛋白表达效率达到了一个最佳平衡点。然而,当拷贝数进一步增加至5、6时,表达量却出现了下降,分别为55.07、50.12 mg/L。这可能是由于高拷贝重复序列会导致染色质压缩,阻碍转录因子与RNA聚合酶结合,导致转录效率下降;同时,大量新生肽链瞬时涌入内质网腔,触发未折叠蛋白应答(unfolded protein response,UPR)。UPR上调内质网相关降解途径(endoplasmic reticulum-associated degradation,ERAD),加速未折叠或错误折叠Tha的胞质降解,进一步拉低5～6拷贝的有效产量。因此,综合考虑蛋白表达量和细胞代谢负担,4拷贝为Tha在毕赤酵母中的最佳剂量。
a-不同拷贝数表达菌株发酵上清液的SDS-PAGE检测结果;b-不同拷贝数表达菌株的生长情况和Tha产量
图4 不同拷贝数对于Tha表达水平的影响
Fig.4 The effects of different copy numbers on the expression levels of Tha
2.4 共表达伴侣蛋白对Tha表达量的影响
当Tha基因在P.pastoris中过量表达时,由于Tha含有8个二硫键,其复杂的折叠过程使得大量新生肽链不能及时正确折叠,从而聚集在内质网腔内,造成了巨大的内质网压力[38]。鉴于分子伴侣蛋白在促进蛋白质正确折叠、防止蛋白聚集以及提高分泌效率方面的重要作用,通过与分子伴侣蛋白共表达,有望进一步优化Tha的表达水平。本研究选择了16个伴侣蛋白与Tha进行共表达(表2),以菌株GS115-4Tha为对照进行发酵验证,并进行SDS-PAGE检测。
SDS-PAGE结果表明(图5),与对照GS115-4Tha相比,共表达Bmh2、Bip、Gcn4、Hac1、Mpd1、Sec1、Sil1、Sly、Ssa4的重组菌株Tha产量均无显著提升,甚至下降。相反,共表达Ero1、Hrd1、Pdi1、Pdi2、Sec53、Sso2、Ubc1的菌株在Tha产量分泌上普遍提升,分别提升了19.8%、10.5%、9.6%、3.9%、4.5%、16.8%、14.0%,其中GS115-4Tha-Ero1的Tha产量最高,达到72.02 mg/L。此外,这种共表达策略并未对菌株的生长造成任何负面影响,所有菌株的生长情况均未发生显著变化。
a-不同伴侣蛋白表达菌株发酵上清液的SDS-PAGE检测结果;b-不同伴侣蛋白表达菌株的生长情况和Tha产量
图5 不同伴侣蛋白对于Tha表达水平的影响
Fig.5 The effects of different molecular chaperones on the expression levels of Tha
功能层面分析显示,产量提升的伴侣蛋白主要集中在3条互补通路上:a)氧化折叠强化:Ero1提高腔内氧化电位,Pdi1和Pdi2催化二硫键重排,三者共同加速Tha多对二硫键的形成,减少错误折叠Tha的ERAD降解;b)糖基化修饰:Sec53保障N-糖基化供体GDP-甘露糖充足,促进Tha正确折叠与后续分泌;c)分泌流量提升:Sso2加速囊泡与质膜融合,解除胞吐瓶颈,Ubc1和Hrd1选择性清除滞留的错误折叠蛋白,缓解ER负荷,间接提升正确折叠分子的存活率。而产量下降的伴侣蛋白则多因功能失衡,如:Bip与Sil1过度延长新生链在ER腔内滞留;Mpd1与Pdi1功能重叠且催化效率低;Bmh2与COPII组件竞争结合位点;Hac1持续放大UPR并同步上调ERAD,均导致有效分泌量下降。
2.5 共表达多个伴侣蛋白对Tha表达量的影响
2.5.1 氧化折叠修饰途径伴侣蛋白联合共表达对Tha表达量的影响
为考察氧化折叠修饰途径相关伴侣蛋白联合共表达对Tha表达量的影响,将2.4节中对Tha表达量有促进作用的4个伴侣蛋白(Ero1、Pdi1、Pdi2、Sec53)按1.3.2节方法以不同组合与Tha联合共表达,共获得10株重组菌。发酵结果显示(图6),在6株双因子重组菌中,有GS115-4Tha-Pdi2-Ero1和GS115-4Tha-Sec53-Ero1表达量获得了提升,分别为71.6%和36.1%,其中GS115-4Tha-Pdi2-Ero1表达量可达103.18 mg/L;在4株三因子重组菌中,有GS115-4Tha-Pdi1-Pdi2-Ero1、GS115-4Tha-Pdi1-Pdi2-Sec53、GS115-4Tha-Pdi2-Sec53-Ero1表达量获得了提升,分别为93.9%、28.2%、67.5%,其中GS115-4Tha-Pdi1-Pdi2-Ero1表达量最高,达116.54 mg/L。
a-不同氧化折叠修饰途径伴侣蛋白组合表达菌株发酵上清液的SDS-PAGE检测结果;b-不同氧化折叠修饰途径伴侣蛋白组合表达菌株的生长情况和Tha产量
图6 不同氧化折叠修饰途径伴侣蛋白组合对于Tha表达水平的影响
Fig.6 The effects of different combinations of molecular chaperones from oxidative folding pathways on the expression levels of Tha
根据结果可知,二硫键氧化与异构功能可协同作用,Ero1提供氧化当量,Pdi1、Pdi2催化重排;两者协同可将错误折叠中间体迅速转化为正确构象,减少ERAD损失。而Pdi2-Ero1表达量优于Pdi1-Ero1,这可能提示Pdi2在Tha二硫键重排中效率更高;且Pdi1与Pdi2同时出现时表现不佳,这可能提示两酶间存在底物竞争或折叠延迟。Sec53负责GDP-甘露糖供给,其只有在同时引入Ero1的情况下(Sec53-Ero1和Pdi2-Sec53-Ero1)产量才显著高于对照,表明其本身并不能与Pdi1或Pdi2单独产生增益,其促进效应完全依赖于Ero1提供的强氧化折叠环境。
2.5.2 分泌-质量控制途径伴侣蛋白联合共表达对Tha表达量的影响
为考察分泌-质量控制途径相关伴侣蛋白联合共表达对Tha表达量的影响,将2.4节中对Tha表达量有促进作用的3个伴侣蛋白(分泌途径:Sso2,质量控制途径:Hrd1和Ubc1)按1.3.2节方法以不同组合与Tha联合共表达,共获得2株重组菌。结果显示(图7),双因子Hrd1-Ubc1共表达Tha产量提高至80.62 mg/L,增幅34.1%,进一步叠加Sso2后产量达90.01 mg/L,增幅49.7%。功能上,Hrd1与Ubc1协同增强ERAD,选择性清除错误折叠蛋白,降低ER负荷;Sso2则加速分泌囊泡与质膜融合,缓解胞吐瓶颈。两模块协同作用,既减少了“毒蛋白”积聚,又提高了正确折叠分子的外排效率,因此呈现累加增益。
a-不同分泌-质量控制途径伴侣蛋白组合表达菌株发酵上清液的SDS-PAGE检测结果;b-不同分泌-质量控制途径伴侣蛋白组合表达菌株的生长情况和Tha产量
图7 不同分泌-质量控制途径伴侣蛋白组合对于Tha表达水平的影响
Fig.7 The effects of different combinations of molecular chaperones from secretion-quality control pathways on the expression levels of Tha
2.5.3 多途径伴侣蛋白联合共表达对Tha表达量的影响
由2.5.1节和2.5.2节研究结果可知,氧化折叠修饰途径和分泌-质量控制途径的相关伴侣蛋白均对Tha的表达有协同促进作用,为了继续提高毕赤酵母重组菌的Tha表达量,以氧化折叠修饰途径中表达量较高的双因子组合GS115-4Tha-Pdi2-Ero1和三因子组合GS115-4Tha-Pdi1-Pdi2-Ero1为出发菌株,尝试与分泌-质量控制途径相关的伴侣蛋白及其组合进行联合共表达,共获得6株重组菌。结果显示(图8),有2组伴侣蛋白组合的表达量获得了大幅度提升:GS115-4Tha-Pdi1-Pdi2-Ero1-Hrd1-Ubc1和GS115-4Tha-Pdi1-Pdi2-Ero1-Hrd1-Ubc1-Sso2,产量分别为154.29和142.35 mg/L,较GS115-4Tha提升了156.6%和136.7%。GS115-4Tha-Pdi1-Pdi2-Ero1-Hrd1-Ubc1表达量的提升为氧化折叠修饰途径与质量控制途径共同作用的结果,Pdi1-Pdi2-Ero1保证ER正确折叠蛋白的产出速率,Hrd1-Ubc1则将错误折叠或滞留蛋白快速清除,使细胞能量和ER容量重新分配给正确折叠分子,为后续更高通量做准备;GS115-4Tha-Pdi1-Pdi2-Ero1-Hrd1-Ubc1-Sso2叠加了负责分泌途径的Sso2,虽然最终表达量提升了136.7%,但仍低于GS115-4Tha-Pdi1-Pdi2-Ero1-Hrd1-Ubc1,原因有可能是增加Sso2只是增加了t-SNARE的数量,却缺乏囊泡-质膜融合过程中与之匹配的v-SNARE、SM蛋白、ATP、Ca2+和膜脂,结果形成“空载”复合体或错误融合事件,反而造成产量微降。
a-多途径伴侣蛋白组合表达菌株发酵上清液的SDS-PAGE检测结果;b-多途径伴侣蛋白组合表达菌株的生长情况和Tha产量
图8 多途径伴侣蛋白组合对于Tha表达水平的影响
Fig.8 The effects of multi-pathway chaperone combinations on the expression levels of Tha
2.6 3-L发酵罐补料分批培养
在3-L发酵罐中采用补料分批培养,以评估重组菌株GS115-4Tha-Pdi1-Pdi2-Ero1-Hrd1-Ubc1的Tha的生物合成。根据1.3.4节内容进行发酵罐分批培养,发酵前21 h为甘油发酵阶段,21～25 h为甘油补料阶段,后饥饿2 h,待甘油消耗完全,于27 h进入甲醇诱导阶段。发酵罐产量在156 h达到最高,为1.09 g/L(图9),为摇瓶产量的7.06倍。
a-发酵罐中不同时间段发酵上清液的SDS-PAGE检测结果;b-发酵罐中不同时间段菌株的生长情况和Tha产量
图9 在3-L发酵罐上进行补料分批培养生产Tha
Fig.9 Fed-batch fermentation in a 3-L fermenter for Tha production
3 结论
该研究利用毕赤酵母GS115围绕启动子、信号肽、基因剂量及分子伴侣4个维度进行系统优化,使天然甜味蛋白Tha的摇瓶分泌水平由初始24.51 mg/L提升至154.29 mg/L,为原始菌株的6.29倍,验证了“强启动子-高效杂合信号肽-适度基因剂量-多伴侣协同”组合策略对于提高多二硫键的真核蛋白分泌量的普遍适用性。优化过程中发现:4拷贝为Tha最佳基因剂量,超过此拷贝数则会因ER压力及染色质压缩导致产量下降;不同伴侣蛋白组合效应存在差异,氧化折叠修饰途径(Ero1-Pdi1-Pdi2)与质量控制途径(Hrd1-Ubc1)协同优于单个途径叠加;继续增加Sso2未再提高产量,提示囊泡融合限速因素不仅在于t-SNARE数量,还存在v-SNARE、能量及膜脂匹配等瓶颈。在3-L发酵罐放大中,采用甘油/甲醇两阶段补料工艺,Tha产量(1.09 g/L)达到文献报道最高水平,证明该菌株具有优异的放大性能。所获得的高产菌株可降低下游纯化成本,为天然甜味剂Tha的食品级规模化生产奠定基础。
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