益生菌(probiotics)是指摄入后在宿主体内发挥有益生理功能的活性微生物[1],广泛应用于维持肠道菌群稳态[2]、增强黏膜免疫[3]及改善代谢功能[2]等方面。近些年来,其在调节胃肠功能[4]、辅助治疗腹泻[5]、肠易激综合征[6]及代谢性疾病[7]中的潜力不断得到验证,展现出良好的临床应用前景。
益生菌的功能发挥依赖其活性状态,需在经口摄入后穿越胃酸与胆盐等屏障,顺利到达肠道并完成定植[8]。然而,胃肠道复杂的理化环境常对益生菌活性造成破坏,严重影响其生物效能[9]。因此,制剂在胃肠道转运过程中的生理稳定性,已成为益生菌产品开发中的关键评价指标。
为准确评估益生菌在消化过程中的存活与释放特性,构建体外模拟消化体系已成为重要研究手段[10]。该体系可模拟胃液pH、胆盐质量浓度等典型理化条件,从而在体外环境中系统分析不同制剂的耐酸性、耐胆盐性及缓释能力,为耐受性评估、制剂优化及功能验证提供理论基础[11]。
当前益生菌制剂主要以菌粉、颗粒、胶囊等传统剂型为主,虽制备工艺成熟,但在胃肠环境中普遍存在活菌损失大、功能释放不充分等局限[12]。为提高益生菌在胃肠道中的生存率,新型给药形式逐渐引起研究者关注[13-14]。滴丸型制剂作为一种新型包埋载体,具备缓释性强、包埋密封性好等优势,在提升益生菌胃肠稳定性方面展现出应用潜力[15]。本研究基于人工胃肠液构建多阶段模拟体系,比较滴丸型与菌粉型益生菌制剂在耐酸,耐胆盐及连续消化过程中的存活与释放特性,旨在为新型益生菌制剂的开发及其精准递送提供理论支撑与实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
本研究选取4种益生菌制剂作为实验样品,包括2种滴丸型制剂和2种菌粉型制剂,4款产品均由深圳万和制药有限公司提供,具体信息详见表1。其中样品A和样品C为滴丸型益生菌,样品B为复合菌粉制剂,样品D为长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)BB536菌粉。所有样品在实验前均于4 ℃密闭避光保存,避免受潮、失活等影响。胃蛋白酶(酶活力≥3 000 U/mg)、胰酶[蛋白酶活性279 USP U/mg,符合规格要求(≥275 USP U/mg)]、猪胆盐,山东科源生化有限公司;磷酸二氢钾(KH2PO4,分析纯),上海麦克林生化科技股份有限公司;改良MRS琼脂培养基,广东环凯生物科技有限公司;2.5 L圆底立式厌氧产气袋,湖南比克曼控股有限责任公司;2.5 L厌氧产气包,日本三菱化学公司;90 mm细菌培养皿,北京兰科杰柯科技有限公司。
表1 产品信息
Table 1 Product information
样品编号剂型添加微生物种类活菌含量规格生产日期产品A滴丸制剂B. longum subsp. longum BB536;短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)BBr60;长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp. infantis)Bl45;动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp. lactis)BLa80;两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum) BBi32;青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis) BAC30双歧杆菌总添加量300亿CFU/袋、其中BB536 50亿CFU/袋2 g/袋2024.9.24产品B菌粉制剂同产品A6 000亿CFU/g散装粉末2024.9.1产品C滴丸制剂B. longum subsp. longum BB53650亿CFU/g2 g/袋2024.10.15产品D菌粉制剂同产品C800亿CFU/g散装粉末2024.9.20
注：CFU表示菌落形成单位,用于表示活菌数量;产品A与B添加为相同的7种双歧杆菌组合,其中B.longum subsp.longum BB536为其中一株;产品A、产品C为益生菌滴丸制剂,滴丸工艺相同,产品B与产品D为冻干粉状菌粉制剂;所有样品于实验前统一低温避光密封贮存,确保活性稳定。
滴丸型益生菌制剂采用多层油包水型微囊包埋技术,通过控制表面张力进行滴下成丸,形成直径约1～3 mm的球形结构。整个结构由3层组成,外层为疏水性脂质屏障,主要由起酥油和赤藻糖醇构成,能够有效阻隔氧气、胃酸及胆盐,具有良好的抗氧化性与封闭性。中间包埋层由明胶、果胶、柠檬酸钠等成膜剂与稳定剂组成,具备显著的隔水性与pH响应性,可在肠道特定环境下逐步崩解。内核为高浓度的益生菌悬液,含有活性双歧杆菌菌群(B.longum subsp.longum BB536, B.breve BBr60等)及抗性糊精等益生元组分,提供营养支持与稳定性。
1.2 仪器与设备
ZRS-8G智能溶出仪,天津市鑫洲科技有限公司;精密天平ZG-TP203,上海仪器(集团)公司;DHP-9011B微生物培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;OptiMair®垂直流超净工作台,新加波艺思高科技有限公司;YSM23B小型压力蒸汽灭菌器,宁波甬安医疗器械制造有限公司;FE28便捷式pH计,梅特勒托利多科技(中国)有限公司;IKA RW20 digital数显型顶置悬臂式机械搅拌器,艾卡(广州)仪器设备有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品预处理
为便于后续活菌计数与模拟胃肠液处理实验,分别对滴丸制剂与菌粉制剂进行初始样液制备,制备方法如下:a)滴丸样品:称取1.0 g滴丸样品,加入199 mL 85 g/L NaCl无菌稀释液中,于18 000 r/min条件下均质80 s,制得稀释200倍的初始样液,用于后续溶出试验与菌落计数。b)菌粉样品:未经模拟胃肠液处理的样品,称取1.0 g,加入199 mL 85 g/L NaCl无菌稀释液中,以10 000 r/min条件下均质1 min,制得稀释200倍的初始样液,用于活菌数测定。对于经过模拟胃肠液处理后的菌粉样品,不再进行均质操作,直接取样进行双歧杆菌的平板计数分析,以真实反映在胃肠环境下的生存状态。
1.3.2 活菌计数
活菌计数方法参照GB 4789.35—2023《食品安全国家标准 微生物学检验 乳酸菌检验》及GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 微生物学检验 菌落总数测定》执行。所有操作均在超净工作台内于无菌条件下进行,以避免外源性微生物污染。具体操作如下:准确吸取1 mL初始样液,加入9 mL 85 g/L NaCl无菌稀释液试管中,充分混匀,制备10倍稀释液,并以此进行10倍梯度连续稀释。选择2～3个连续适宜稀释梯度,分别从各稀释度中取1 mL样品稀释液接种于无菌90 mm平皿中,每个稀释度设置2个平行平皿。接种完成后,立即向平皿中倾注已冷却至 48～50 ℃的改良MRS琼脂培养基,轻轻旋转平皿以确保稀释液与培养基充分混匀并迅速凝固。随后将接种好的平板置于(36±1) ℃厌氧培养环境中,培养(48±2) h。培养结束后,选择菌落数量为30～300个的平板进行计数,计算每克样品中双歧杆菌的活菌数,计算结果以lg CFU/g形式表示。
1.3.3 消化液的配制
人工胃液与人工小肠液的配制均参考《中国药典》(2020年版)相关规定进行,并结合实验目的进行适当调整。人工胃液的制备方法如下:取16.4 mL稀盐酸加入约800 mL去离子水中,定容至1 000 mL后分别调节pH值至1.5、2.0、2.5、3.5、4.0。按每升加入胃蛋白酶10 g,充分溶解后经0.22 μm滤膜除菌,备用,用于益生菌耐酸性试验。人工小肠液的制备方法如下:称取KH2PO4 6.8 g溶于500 mL去离子水中,调节pH值至6.8;另将胰酶10 g与胆盐分别按0.3、1、2、3 g/L的质量浓度溶于适量水中。将两部分混合,定容至1 000 mL,经0.22 μm滤膜除菌后备用,用于益生菌耐胆盐性评价。
1.3.4 胃肠模拟消化实验
本实验采用溶出法模拟人体胃肠道环境,考察不同条件下益生菌制剂的耐酸性、耐胆盐性及整体胃肠耐受能力,具体实验步骤如下:
模拟胃液处理:参考《中国药典》(2020版)中人工胃液制备方法,分别设定pH值为1.5、2.0、2.5、3.5、4.0的人工胃液,考察不同酸度条件下益生菌的耐受情况。在溶出杯中加入500 mL对应pH值人工胃液,预热至37 ℃。滴丸样品处理时,将1.0 g样品置于溶出篮中,溶出篮浸入液面下,顶部距离液面约2 cm;菌粉样品处理时,直接在溶出篮中加入1.0 g样品。设置溶出仪转速为100 r/min,开启转动并计时,分别于0、1、2、3 h取样,终点(3 h)取出溶出篮中所有样品或溶液,按照1.3.2节所述方法进行活菌计数。
模拟小肠液处理:在胆盐质量浓度为0.3、1、2、3 g/L条件下考察益生菌在人工小肠液中的耐受性。将500 mL不同胆盐浓度的人工小肠液加入溶出篮中并预热至37 ℃。滴丸样品处理方式参考1.3.1节部分,菌粉样品亦按照相同方法直接加入溶出液中分散,设置溶出仪转速为100 r/min,实验持续6 h,分别在0、2、4、6 h取样,终点取出样品或溶液进行活菌计数。
模拟胃肠液处理:为模拟完整胃肠道消化过程,先将样品置于人工胃液中处理2 h后,再转入人工小肠液中继续处理6 h,考察其整体胃肠耐受能力。操作如下:将1.0 g滴丸样品置于溶出篮中,或直接将1.0 g菌粉样品加入至500 mL人工胃液中,预热至37 ℃后继续浸没样品,转动处理8 h。分别在胃液处理0 h和2 h,肠液处理1、2、4 h取样,按照1.3.2节所述方法进行活菌计数。
采用平板计数法测定样品处理前后各时间点的益生菌活菌数。活菌存活率的计算如公式(1)所示:
存活率
(1)
式中:Ni为经过处理后的活菌数,N0为初始活菌数。
1.3.5 伦理说明
本研究为体外模拟实验,未涉及人体或动物样本,实验中所使用的益生菌制剂均为合法商业来源,未涉及任何需伦理审批的研究对象或操作。所有实验操作符合GB 19489—2020《实验室 生物安全通用要求》等国家相关规范,无需伦理审批。
1.4 数据分析
实验数据采用Graphpad Prism 9.5软件进行统计分析和图形绘制。所有实验均进行3次独立重复(n=3),结果以“平均值±标准差”表示,组间差异检验使用单因素方差分析(one-way ANOVA)并进行Tukey多重比较检验(Tukey’s multiple comparisons test),以P<0.05为差异显著的判定标准。
2 结果与分析
2.1 不同pH条件下益生菌制剂的体外胃液耐受性评估
益生菌在进入胃肠道过程中,首先面临胃酸的强烈胁迫,其生存和定植能力在很大程度上取决于其对胃液环境的耐受性。有研究表明,胃液的pH值在空腹状态下可低至1.5,而在餐后可升高至约4.0左右[16-17]。胃内酸性环境对益生菌活性的保持构成了重大挑战。因此,开展益生菌制剂在不同pH条件下的体外模拟胃液消化实验,对评价其耐酸性能和剂型保护机制具有重要意义。
为系统评估益生菌制剂在模拟胃液环境中的耐酸性能,本研究参考人体胃液在不同生理状态下的典型pH波动范围,设置pH 1.5、2.0、2.5、3.5、4.0为酸度条件。其中pH 1.5和2.0模拟空腹状态下的强酸环境,而pH 3.5、4.0模拟餐后胃酸部分被食物缓冲的弱酸环境,而pH 2.5作为酸度过渡区间用于揭示益生菌存活率随酸性强度变化的趋势。以此为基础,本研究对4种益生菌产品(A、B、C、D)的胃液耐受性进行比较分析。通过比较各样品在不同pH条件下3 h消化处理前后的活菌数与存活率,分析其耐酸能力及剂型的保护效果,结果如图1所示。在强酸环境(pH 1.5和2.0)下,所有样品活菌数均呈下降趋势,其中菌粉型B和D样品降幅最为显著:B样品在pH 1.5和2.0处理3 h后活菌数分别下降约4.72 lg CFU/g和1.56 lg CFU/g(P<0.001);D样品在pH 1.5处理1 h后已基本无活菌检出,且在pH 2.0与2.5下3 h处理后分别下降4.61 lg CFU/g和2.94 lg CFU/g(P<0.001),显示其对低pH条件高度敏感,耐酸性较差。相比之下,滴丸型A与C样品在相同条件下活菌数下降显著减缓,尤其在pH≥2.0时,活性保持更为稳定,显示出良好的耐酸性与剂型保护作用。在pH 3.5与4.0环境中,4种样品的活菌数下降幅度较小,滴丸制剂活菌数在3 h处理后基本维持初始水平,表明其在餐后胃液环境中具有更优的活性保持能力。
a-产品A;b-产品B;c-产品C;d-产品D
图1 四种益生菌产品在不同pH值人工胃液消化后的活菌数
Fig.1 The viable counts of four probiotic products after digestion in artificial gastric juice with different pH values
注:*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001;各处理组的统计比较以同组0 h为基准;图中数值为实测活菌数,而非产品包装标示量(下同)。
鉴于各益生菌产品初始菌量存在差异,为增强结果的可比性与表达直观性,本研究在活菌数基础上进一步换算存活率,以更准确评估其在不同pH条件下的耐酸性能。4种产品在人工胃液中消化后存活率变化如图2所示。A样品在pH 1.5～4.0条件下消化3 h后存活率均维持在97%以上,随时间延长略有下降,变化幅度较小,尤其在pH 1.5强酸环境下仍表现出良好稳定性,消化3 h后存活率为(97.74±0.08)%,显示其滴丸包埋形式对菌体具有显著保护作用。相比之下,B样品在各pH条件下存活率显著下降,pH 1.5 下1 h内迅速降低,3 h后仅为(60.08±0.86)%(图2-b),差异具有高度统计学意义(P<0.001),表明其抗胃酸能力较弱。C样品整体表现稳定,3 h后最低存活率为(95.67±1.39)%,在pH 1.5～2.5下亦保持较高水平,说明其包埋工艺可有效提升B.longum subsp.longum BB536菌株的耐酸性。D样品在低pH条件下稳定性较差,pH 1.5下1 h后存活率即接近为0,pH 2.0和2.5条件下3 h存活率分别为(40.48±1.16)%和(62.02±0.31)%,仅在pH 3.5及4.0条件下下降趋势有所减缓,提示该菌株对强酸环境敏感,缺乏有效保护手段。
a-产品A;b-产品B;c-产品C;d-产品D
图2 四款益生菌产品在梯度pH值人工胃液中的存活率
Fig.2 Survival rates of four probiotic products in artificial gastric juice with gradient pH values
注:图标后*表示益生菌存活率在消化时间为3 h和0 h之间的差异(图5同)。
a-pH=1.5;b-pH=2.0
图3 四款益生菌产品在pH 1.5、2.0人工胃液中消化3 h后存活率
Fig.3 Survival rates of four probiotic products following 3-hour digestion in artificial gastric juice at pH 1.5 and pH 2.0
为进一步评估益生菌制剂在极端酸性条件下的耐受能力,本研究比较分析了4种产品在pH 1.5和pH 2.0人工胃液中消化3 h后的存活率(图3)。结果显示,不同产品在2种pH条件下均存在显著差异(P<0.001)。在pH 1.5条件下(图3-a),滴丸型产品A与C表现出较高存活率,分别包裹多种双歧杆菌与B.longum subsp.longum BB536,显示其对强酸环境具有良好稳定性;而菌粉型产品B存活率明显下降,产品D几乎无活菌检出。pH 2.0时(图3-b),各产品存活率整体提升,但差异依然显著(P<0.001),其中产品D最低,仅为(40.48±1.16)%。滴丸制剂在2种酸性环境下均显著优于对应菌粉产品,表明包埋工艺可有效减缓胃酸对菌体结构与活性的破坏,提升其在胃液中的存活能力。值得注意的是,在相同pH条件下,含多菌株的B产品存活率显著高于单一菌株的D产品(P<0.001),提示菌株组合可能通过协同机制增强整体抗酸能力。部分菌株或通过代谢产物、中和酸性或形成生物膜等方式对共存菌株提供保护,增强混合菌群对胃酸胁迫的整体耐受性。
综上,滴丸包埋技术与菌株多样性是提升益生菌产品胃酸耐受性的关键因素。合理的制剂形式与菌群构成不仅显著提高益生菌在胃液中的生存率,也为其顺利到达肠道并发挥生理功能提供重要保障。
2.2 不同胆盐浓度条件下益生菌制剂的体外肠液耐受性评估
益生菌在通过胃液考验后,需进一步抵御肠道中胆盐的生理胁迫,方能在肠道内定植并发挥作用。胆盐可破坏细胞膜,抑制菌体活性,是益生菌生存的另一关键障碍[18-19]。为系统评估益生菌制剂的肠液耐受性,本研究构建不同胆盐浓度的人工小肠液模型,分析各制剂在模拟肠道环境中的存活特性及其耐受性差异。研究显示,4款益生菌产品(A、B、C、D)在不同胆盐质量浓度(0.3～3 g/L)和处理时间(0、2、4、6 h)下的活菌数变化存在显著差异。整体趋势表明,随胆盐浓度升高及处理时间延长,菌体存活率逐渐下降。产品A在各条件下均表现出良好稳定性(图4-a),即使在0.3 g/L胆盐处理6 h后,活菌数仍达(9.30±0.04) lg CFU/g,显示滴丸包埋具备有效缓冲胆盐胁迫的能力。B产品在高质量浓度胆盐中活菌数急剧下降(图4-b),6 h处理后分别减少5.85 lg CFU/g和4.52 lg CFU/g,与初始活菌数相比具有显著差异(P<0.001),说明其缺乏保护结构,耐受性较差。产品C在不同质量浓度下活菌波动较小(图4-c),表现出良好的胆盐耐受性,反映滴丸包埋对B.longum subsp.longum BB536菌株具有有效保护。D产品则对胆盐高度敏感,0.1%以上浓度处理2 h后即无活菌检出,仅在0.3 g/L下残存少量活菌(图4-d),表明其稳定性最弱。综上,滴丸包裹技术显著提升益生菌胆盐耐受性,未包裹的菌粉制剂在胆盐环境中易发生失活,难以保障其功能发挥。
a-产品A;b-产品B;c-产品C;d-产品D
图4 四款益生菌产品在梯度胆盐浓度人工小肠液中活菌数
Fig.4 Enumeration of live bacterial cells for four probiotic products in artificial intestinal fluid with gradient bile salt concentrations
为进一步评估益生菌制剂在肠道胆盐环境中的耐受性,本研究系统分析了4种益生菌产品(A、B、C、D)在不同胆盐浓度下的存活率变化。结果表示,产品A在3 g/L胆盐条件下,消化6 h存活率为(90.50±0.36)%,在0.3 g/L胆盐下存活率下降幅度较小(图5-a),揭示其滴丸制剂具备一定胆盐防护能力,尽管保护效果随胆盐浓度升高和作用时间延长有所减弱。产品B在3、2 g/L胆盐下存活率显著下降,6 h时分别下降约50%与38%,而在较低胆盐浓度下下降趋势较缓(P<0.001)(图5-b),说明无包裹的菌粉形式对胆盐敏感,缺乏有效的屏障机制。产品C在各胆盐浓度下存活率相对稳定,尤其在3 g/L胆盐条件下,6 h后仍达(85.26±1.41)%(图5-c),显示滴丸包裹技术对B.longum subsp.longum BB536具有良好保护作用,提升了其在胆盐环境中的存活能力。相较之下,产品D在3、2、1 g/L胆盐质量浓度下经消化2 h后存活率即降为0,表现出极低的胆盐耐受性(图5-d)。
a-产品A;b-产品B;c-产品C;d-产品D
图5 四款益生菌产品在梯度胆盐浓度人工小肠液中的存活率
Fig.5 Survival rates of four probiotic products in simulated intestinal fluids with gradient bile salt concentrations
为系统评估4款益生菌产品在高胆盐环境下的耐受性,本研究分析了其在3、2 g/L胆盐人工小肠液中消化6 h后的存活率(图6-a)。结果显示,产品A与C(滴丸制剂)在2种浓度下均表现出良好稳定性,6 h存活率均超过85%,其中A产品略优于C(P<0.001)。相比之下,产品B(混合菌粉)在3 g/L和2 g/L胆盐下的存活率分别为(50.5±0.28)%与(62.03±0.38)%,显著低于滴丸制剂(P<0.001);产品D(单一菌粉)在两条件下均无活菌检出,存活率为0%。上述结果表明,滴丸包埋显著增强益生菌对高胆盐环境的耐受能力,能有效减缓胆盐对菌体结构的破坏,提升存活率。未包裹的B与D产品则对胆盐高度敏感,活菌数显著下降,D产品完全失活。值得注意的是,尽管B产品未采用包裹技术,其存活率仍明显高于D,提示混合菌株间可能存在协同保护机制,如胆盐水解、应激响应或代谢互补,从而提升整体耐胆盐能力。而单一菌株B.longum subsp.longum BB536因缺乏协同效应,在高胆盐胁迫下更易失活。
a-3 g/L;b-2 g/L
图6 四款益生菌产品在胆盐质量浓度3、2 g/L人工小肠液中消化6 h后存活率
Fig.6 Survival rates of four probiotic products after 6 h exposure to artificial intestinal fluid containing 3 g/L and 2 g/L bile salts
综上所述,益生菌产品在研发过程中需综合考虑菌株组合与制剂工艺的协同效应。滴丸包裹可有效提升菌株在胆盐环境中的稳定性,尤其适用于单一菌株制剂。而对于混合菌株产品,虽然本身具有一定耐胆盐优势,但仍应借助合适的包埋技术进一步增强其稳定性与功能释放效率。
2.3 益生菌滴丸制剂在模拟胃-肠消化的存活特性
前期研究表明,滴丸包裹的益生菌(产品A与C)在单一胃液或肠液模拟环境中表现出优于菌粉制剂(产品B与D)的耐酸及耐胆盐特性,显示出滴丸制剂在提升益生菌稳定性方面的潜力。然而,该类研究未能模拟胃肠连续消化过程,难以全面评估滴丸结构在复杂消化环境中的保护效果。为更准确反映其在体内消化过程中的生物行为及递送优势,本研究构建人工胃肠液序贯消化模型,系统探究滴丸制剂在动态消化条件下对益生菌的保护机制及存活特征,为其剂型优化与靶向递送提供理论依据。
研究结果表明,产品A在模拟胃肠连续消化环境中表现出良好的耐受性与稳定性。于人工胃液(pH 1.5)阶段消化0～2 h内,滴丸内活菌数维持在(10.10±0.06) lg CFU/g,存活率达(98.25±0.56)%(图7-a和图7-b),显示其能有效抵御胃酸破坏,提高了益生菌在胃中的生存率。进入人工小肠液(3 g/L胆盐)后,尽管活菌数略有下降,8 h时存活率仍达(88.52±0.12)%,表明滴丸结构在胆盐环境中具备持续保护作用。值得注意的是,胃液阶段溶出液中几乎未检测到活菌,提示滴丸包裹能有效控制益生菌释放,避免其在强酸条件下暴露与失活。转入小肠液后,溶出液中活菌数逐步上升,并于第4 h趋于稳定,表明滴丸在小肠环境中实现缓释,有助于维持益生菌活性。综上,产品A滴丸制剂可在胃酸与胆盐双重胁迫下稳定保护并递送益生菌,为其顺利到达肠道并实现靶向释放提供了有效保障。
a-活菌数;b-存活率
图7 益生菌产品A在模拟胃部(pH 1.5人工胃液,2 h)及小肠(3 g/L胆盐人工小肠液,6 h)消化阶段的活菌数与存活率分析
Fig.7 Viable count and survival rate analysis of probiotic product A during sequential digestion in simulated gastric fluid (pH 1.5, 2 h) and simulated intestinal fluid(3 g/L bile salt, 6 h)
如图8所示,在序贯模拟胃肠消化模型中,产品C滴丸内益生菌在人工胃液(pH 1.5)0～2 h阶段活菌数维持在(9.87±0.02) lg CFU/g,存活率达(99.41±0.25)%,两时间点无显著性差异(P=0.503),显示其在强酸环境中具有良好的稳定性与抗酸能力。转入人工小肠液(3 g/L胆盐)后,2～8 h内活菌数逐渐下降,至8 h时存活率为(77.72±0.63)%,虽受胆盐胁迫影响,滴丸结构仍在一定程度上延缓了菌体失活,维持较高的生存水平。与产品A相比,产品C在整个消化过程中溶出液中活菌数接近于零,提示其溶出效率偏低,或释放出的单一B.longum subsp.longum BB536菌株在小肠环境中存活性较差。考虑到两者滴丸工艺相同,但包埋内容不同——产品A为多株双歧杆菌混合,产品C为单一B.longum subsp.longum BB536菌株——结合前期研究推测,混合菌株间可能存在协同作用,可增强整体耐胆盐能力。因此,产品A在8 h时存活率高于产品C,进一步印证了菌株多样性在提升益生菌稳定性中的潜在优势。综上,产品C滴丸制剂在胃酸条件下表现出优异的保护能力,在胆盐环境中亦具备一定缓释与维持活性的作用,显示其具备通过胃肠屏障、实现结肠递送的潜力。
a-活菌数;b-存活率
图8 益生菌产品C在模拟胃部(pH 1.5人工胃液,2 h)及小肠(3 g/L胆盐人工小肠液,6 h)消化阶段的活菌数与存活率分析
Fig.8 Viable counts and survival rates of probiotic product C during simulated gastric (pH 1.5, 2 h) and intestinal (3 g/L bile salt, 6 h) digestion phases
3 结论
近年来,益生菌因其在维持肠道微生态平衡、调节免疫功能以及促进代谢健康等方面的潜在益处,已经广泛应用于功能食品与临床干预中[20]。然而,由于胃酸与胆盐等消化因素的强烈胁迫,益生菌在经口摄入后的活性损失问题严重制约益生菌的功效发挥[13]。因此,如何通过科学的制剂工艺提升益生菌在胃肠环境中的存活率,成为益生菌制剂研发的关键问题之一[21]。
本研究通过构建模拟胃肠序贯消化模型,系统评价了滴丸制剂对双歧杆菌类益生菌在胃酸与胆盐胁迫下的保护作用,揭示了滴丸剂型在提升双歧杆菌类益生菌胃肠存活率方面的显著优势。研究结果表明,相较于无包裹的菌粉类制剂,滴丸结构能够有效的抵御pH 1.5极端酸性人工胃液及3 g/L胆盐人工小肠液对双歧杆菌类益生菌造成的损伤,提高了其在胃肠道转运过程中的存活率。在本研究中,胃液耐酸性实验的取样点设置参考了人体胃液在不同生理状态下的典型pH波动范围,涵盖了空腹状态下的强酸环境(pH 1.5、2.0)、餐后食物缓冲下的弱酸环境(pH 3.5、4.0)以及酸性过渡区间(pH 2.5)。通过这一系统化的酸度梯度设计,不仅能够全面评估不同益生菌制剂在模拟胃液环境中的耐酸性能,还能够揭示益生菌存活率随酸性强度变化的趋势,为滴丸制剂在酸性条件下的保护效应提供科学依据,并进一步支持对滴丸制剂工艺与菌株配伍策略的合理性分析。从制剂结构角度来看,滴丸型益生菌产品之所以在极端胃酸及高胆盐条件下依然表现出显著优势,主要得益于其多层包埋设计所构建的协同保护机制。该结构包括由植物油脂和赤藻糖醇构成的外层疏水屏障,可有效阻隔胃酸、胆盐和氧气的侵蚀;中间层由明胶、果胶、柠檬酸钠等成膜材料组成,具备良好的pH响应性和缓释能力;内核则为含7株双歧杆菌及抗性糊精的活菌悬液,兼具活性与营养支持。整体构建了“物理隔离-pH缓释-活菌递送”的防护体系,在模拟胃肠环境下有效提升菌体存活率,为滴丸制剂在益生菌口服递送中的保护作用提供了理论依据。已有研究亦证实滴丸包埋系统可有效提升益生菌在胃酸及胆盐条件下的存活率,如吕培佳等[15]采用油脂包埋与多糖内核设计,实现了对嗜酸乳杆菌的显著保护,进一步支持了本研究结果的应用潜力。相比之下,当前常用的益生菌包埋策略还包括钠藻酸盐-壳聚糖双层微胶囊、双乳液包埋体系等,这类结构通常通过形成凝胶或半透性膜层来降低胃酸和胆盐对菌体的直接损伤,从而在一定程度上提高益生菌在消化道环境中的稳定性。但这些体系在包埋均匀性、机械强度、胃肠缓释能力及工业规模化方面仍存在局限[13]。本研究所采用的多层滴丸结构在包埋致密性、pH响应释放行为以及材料稳定性等方面均表现出更优的综合性能,尤其适用于益生菌在复杂胃肠环境下的靶向释放要求。具体而言,产品A和产品C作为滴丸制剂,均在极端消化环境中展现出良好的耐受性。产品A中包埋的多菌株混合双歧杆菌在整个模拟消化过程中保持了较高的活性和存活率,显著优于单菌株B.longum subsp.longum BB536构成的产品C,揭示混合菌株间可能存在协同机制,在功能互补,代谢支持等方面共同增强了整体的抗逆性[22]。已有研究报道,部分双歧杆菌具有胆盐水解酶(bile salt hydrolase, BSH)活性,该酶可水解结合型胆盐,降低其对细胞膜的破坏性,从而提高菌株的胆盐耐受性[23]。混合菌株可能通过BSH活性叠加,代谢互补与膜结构稳定等机制,形成更强的群体抗逆能力。这与本团队观察到的产品A在高胆盐环境中表现出更高存活率的现象相符[24]。此外,溶出液中活菌的检测结果进一步表明,滴丸中所包埋菌株的类型在益生菌的释放行为和存活稳定性方面发挥着关键作用。表明制剂工艺与菌株配伍是决定益生菌口服稳定性的关键因素。
然而,本研究仍存在一定局限性。首先,模拟模型虽然能够较好反映胃酸、胆盐等物理化学胁迫因素,但仍难以全面模拟实际体内环境中益生菌与肠道菌群的复杂互作、宿主免疫反应、生物膜屏障及菌群竞争定植等多因素影响[25];其次,滴丸内菌体的释放机制及其在小肠、结肠的定植与功能发挥尚缺乏深入追踪与验证;此外,关于多菌株组合的协同机制,目前仅基于现象分析,缺乏代谢、转录组层面的机制性研究,仍需进一步探讨。因此,未来可进一步开展动物试验或者人体临床研究,以全面评估益生菌滴丸制剂在体内的存活动态、定植行为及功能发挥,完善其在功能食品和干预应用中的理论依据。
综上所述,本研究证实滴丸包裹工艺能显著提升双歧杆菌类益生菌在模拟胃肠环境中的稳定性和生存能力,特别是在严苛的胃酸和胆盐条件下表现出优越的保护效应。未来研究可从以下3个方面深入开展:一是结合动物模型与人体临床试验,进一步验证滴丸制剂在体内的递送效率与生理效应;二是应用组学技术解析多菌株协同耐逆机制,指导功能菌株的筛选以及配伍优化;三是探索新型缓释材料及智能响应性系统,实现益生菌的精准释放与靶向作用。上述研究将为益生菌制剂的精准开发与产业升级提供坚实基础,推动在功能食品与临床干预中的更广泛应用。
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