乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)是以碳水化合物为主要代谢产物的微生物,其通常被视为安全的(generally recognized as safe, GRAS)[1]。乳酸菌EPS是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞外的糖单元或多糖衍生物,是通过重复单元连在一起的长链或者含有支链的碳水化合物聚合物[2],属于微生物次级代谢产物。能使微生物免受高温高压、干燥脱水、重金属离子和抗生素等不利环境条件的影响,且参与细胞的黏附以及生物膜的形成[3]。乳酸菌EPS能改善食品的乳化性、稳定性、持水性以及流变学性质,具有一定的抗氧化、抗细菌、降胆固醇、抗肿瘤、抗病毒、免疫调节功能等益生特性,还可作为益生元促进肠道内其他益生菌的生长[3]。
根据组成多糖的单糖种类不同,乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharide, EPS)可分为两大类:同型多糖(homopolysaccharides, HoPS)和异型多糖(heteropolysaccharides, HePS)。HoPS由单一单糖(如葡萄糖或果糖)聚合而成,HePS则由2～5种单糖构成重复单元,一般包含D-葡萄糖、D-半乳糖和L-鼠李糖,有时还含有甘露糖[4]。以及诸如N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine, GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine, GalNAc)和葡萄糖醛酸(glucuronic acid, GlcA)等衍生单糖,部分重复单元还含有乙酰基、磷酸基、丙酮酸盐和甘油等非糖基团[4]。HoPS的合成机制属于脂载体非依赖型的胞外合成途径,依靠特定酶及糖基供体直接在细胞外完成聚合[5]。相较之下,HePS的合成则是脂载体依赖型的胞内多步过程,主要分为2个阶段:a)糖核苷酸前体物质的合成;b)在EPS基因簇的调控下完成重复单元的组装、聚合和输出[5]。具体来说,碳源(如单糖或多糖)首先通过糖转运系统进入细胞内,在系列酶促反应下生成糖核苷酸前体,随后在相关基因调控下完成EPS的合成。
本研究根据分离自锡盟地区酸马奶中高产EPS的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)2-1的全基因组序列,从全基因组挖掘得到与EPS生物合成相关的基因簇和其合成途径。并通过实时荧光定量PCR技术(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)对EPS相关基因表达量进行表达验证,为研究乳酸菌EPS的合成和调控机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA),福晨化学试剂有限公司;无水乙醇、浓硫酸、苯酚、葡萄糖,国药集团化学试剂有限公司;M-MLV 4 First-Strand cDNA Synthesis Kit、Green qPCR MasterMix(High ROX),RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒,北京博迈德基因技术有限公司。
1.2 仪器与设备
Neofuge 15R高速冷冻离心机,力康生物医疗科技控股有限公司;Centrifuge 5420微型离心机,德国EPPENDORF公司;Bio Tek Epoch全波长酶标仪,美国Bio Tek公司;Lightcycler 96荧光定量PCR仪,瑞士ROCHE公司;Applied Biosystems梯度PCR扩增仪,美国ABI公司;LRH-250F生化培养箱,上海一恒科学仪器有限公司,Biodrop duo超微量紫外分光光度计,英国BIODROP公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌株和培养条件
L.fermentum 2-1以2%(质量分数)的接种量接种于MRS液体培养基,37 ℃培养24 h。活化2代后收集第2代菌体并用PBS清洗2次,重悬菌体至OD值为1.00。并以2%(质量分数)的接种量接种于MRS液体培养基,37 ℃培养3、6、9、12、15、18、21、24 h分别测定OD595 nm值并收集菌悬液备用。使用DNA提取试剂盒提取培养至24 h L.fermentum 2-1的DNA。
1.3.2 文库构建与测序
使用Nanodrop检测基因组DNA的纯度(OD260/280与OD260/230)、浓度、核酸吸收峰,并使用0.8%(质量分数)的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。样品检测合格后,使用gTube将基因组DNA打断至10KB;并去除3′端的单链末端;然后连接带barcode的SMRT哑铃型接头;最后使用0.45X的PB磁珠进行二次筛选纯化,使用PacBio Revio进行文库的测序。
1.3.3 基因组注释
首先,利用Glimmer软件预测编码基因,并采用antiSMASH对次级代谢产物基因簇进行鉴定。随后,将预测获得的蛋白质序列比对至NR(Non-Redundant Protein Sequence Database, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/about/nonredundantproteins/)、SwissProt(Swiss-Prot Protein Knowledgebase, https://www.uniprot.org/)、COG(Clusters of Orthologous Groups of proteins, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/cog/)及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, https://www.genome.jp/kegg/)等公共数据库进行功能注释,同时使用InterProScan(Interactive protein sequence scan, https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/)进行蛋白结构域分析。进一步地,针对抗生素抗性基因(Comprehensive Antibiotic Resistance Database,CARD,https://card.mcmaster.ca/)、毒力因子(Virulence Factors Database,VFDB,http://www.mgc.ac.cn/VFs/)和碳水化合物活性酶(Carbohydrate-Active enZYmes Database,CAZy,http://www.cazy.org/)等进行了专项注释,以深入挖掘菌株的特殊生物学功能。
1.3.4 EPS产量的测定
分别取L.fermentum 2-1菌悬液5 mL离心(8 000 r/min,5 min,4 ℃),取上清液加入0.8 g/mL的三氯乙酸至终质量浓度为0.04 g/mL,4 ℃冷藏静置过夜,之后离心(10 000 r/min,20 min,4 ℃),取上清液,加入3倍体积95%(体积分数)的无水乙醇,然后4 ℃冷藏静置24 h后离心(10 000 r/min,20 min,4 ℃),弃上清液收集沉淀物溶于5 mL超纯水,透析24 h即得胞外多糖溶液。含量采用苯酚硫酸法测定,使用0.2 mg/mL葡萄糖标准溶液制作标准曲线,计算得出总糖含量[6]。
1.3.5 RNA的提取与反转录
根据RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒进行RNA的提取,使用超微量紫外分光光度计测定260/280 nm的吸光度值,检测样品的浓度和纯度。cDNA的合成参考M-MLV 4 First-Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒,反转录条件为50 ℃,30 min;85 ℃,15 min。
1.3.6 RT-qPCR
根据EPS相关基因设计荧光定量PCR引物(表1),并以16S rRNA作为内参基因,以反转录得到的cDNA为模板进行RT-qPCR,使用2-ΔΔCT法计算基因的转录水平,反应体系和反应程序如表2和表3所示。
表1 RT-qPCR引物
Table 1 RT-qPCR primers
基因名称引物序列(5′-3′)基因名称引物序列(5′-3′)16S-F16S-RGTCGTCCCCACCTTCCTCCCGGGAACGCAATGACAGGTrfbX-FrfbX-RCTCCGACACCTTTACCCCTGGCAATGTGGGGAAGCATAepsA-FepsA-RCGTCATCGCTTGGGGGATAGAGCTTGGCCGTTATTGTCATgalT-FgalT-RCAACAAGGTGCGTGCTTTAGTGGGGTCAGCAAGTCAAAGAGCepsD-FepsD-RAGACGGTTGCCTTTACCTCCAGAGGACCCGCTTACCTTgalK-FgalK-RCGTCTTCCCGTGTGCAATTACCACGTCGCCTTCCATATTepsB-FepsB-RCGCCCACGCCCTAGCCTGGTTGCCACTTCATCCGAACgalE-FgalE-RTGGTGGGGCGGGATACACGGGTCCACAGCCTTGCpglC-FpglC-RCTTTCGCCACTCATGTTGGTGGGGTGCATCATCACTCATGGgalF-FgalF-RCGGTGCATCAACCTTAGCAGCCTTTGGTTCCGGCTTTTCCtuaG-FtuaG-RATTCGGCAGTCAAAGGGTCACAGCAAACACAGACCGCTTTglk-Fglk-RCGCTGCCGGTAACTTCTTGCGGAAGCCGCCCCGATCACexoL-FexoL-RCTGTTCTTTACCGTTTGGGATAGCAAGATCACCGAGTCCApgm-Fpgm-RAGCACAACCACACCTTCATGTGCGGCCACTTCTGCCAACAwbbL-FwbbL-RAGGGGCGTTCATTCATAGAGTGTGCCGAACGACCTTCTTGCpgi-Fpgi-RATTGAGCCACTTGATGTGCTTACGTTCCTGCTTTGATTCCT
表2 RT-qPCR反应体系
Table 2 RT-qPCR reaction system
试剂20 μL反应体系/μL终浓度2×Green qPCR MasterMix101×10×High ROX dye2—Forward Primer,10 μmol/L0.40.2 μmol/LReverse Primer,10 μmol/L0.40.2 μmol/LTemplate DNA1.2—H2O (RNase free)6—
注：“—”表示使用试剂盒推荐浓度。
表3 RT-qPCR两步法反应程序
Table 3 Two-step RT-qPCR reaction program
步骤循环次数温度/℃时间/s预变性19560变性/退火/延伸40～459515信号采集—6030熔解曲线分析1使用仪器默认熔解曲线采集程序
注：“—”表示无循环次数。
1.4 统计与分析
使用SPSS 23分析数据并进行单因素方差分析Duncan多范围检验,P<0.05被认为具有统计学显著性。使用Origin 2022和BIORENDER进行图形的绘制。结果以“平均值±标准差”表示,所有实验均一式3份进行。
2 结果与分析
2.1 L.fermentum 2-1基因组基本特征
如图1所示,L.fermentum 2-1基因组序列总长度为2 101 587 bp,平均GC含量为51.75%,编码基因2 095个,总长度为1 811 229 bp,GC含量为53%。COG数据库注释结果显示共有108个基因与细胞壁/细胞膜/细胞被膜生物合成相关,占比5.36%;GO数据库显示有967(15.14%)个基因被注释到代谢过程,986个基因被注释到细胞过程(15.43%);KEGG数据库比对显示在碳水化合物代谢途径中有139(10.15%)个相关基因被注释,聚糖生物合成和代谢途径中有69(5.04%)个相关基因被注释。特别地,在聚糖生物合成和代谢途径中注释到69个(5.04%)关键基因,它们广泛分布于多种聚糖的合成通路中,包括编码糖转运系统的基因、负责糖核苷酸前体合成的基因、编码糖基转移酶,负责将糖核苷酸转移到多糖链上的基因以及参与多糖链合成、聚合和输出的eps基因簇,它们与EPS的生物合成密切相关[7]。
图1 L.fermentum 2-1基因组圈图[7]
Fig.1 Circular genome map of L.fermentum 2-1[7]
注:bases modification(碱基修饰)、+(正链)、-(负链)、RNA processing and modification(RNA加工与修饰)、chromatin structure and dynamics(染色质结构与动态变化)、energy production and conversion(能量产生与转换)、cell cycle control, cell division, chromosome partitioning(细胞周期控制、细胞分裂、染色体分离)、amino acid transport and metabolism(氨基酸运输与代谢)、nucleotide transport and metabolism(核苷酸运输与代谢)、carbohydrate transport and metabolism(碳水化合物运输与代谢)、coenzyme transport and metabolism(辅酶运输与代谢)、lipid transport and metabolism(脂质运输与代谢)、translation, ribosomal structure and biogenesis(翻译、核糖体结构与生物合成)、transcription(转录)、replication, recombination and repair(复制、重组与修复)、cell wall/membrane/envelope biogenesis(细胞壁/膜/包膜生物合成)、cell motility(细胞运动)、posttranslational modification,protein turnover, chaperones(翻译后修饰、蛋白质周转、分子伴侣)、inorganic ion transport and metabolism(无机离子运输与代谢)、secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism(次级代谢物生物合成、运输与分解代谢)、general function prediction only(仅一般功能预测)、function unknown(功能未知)、signal transduction mechanisms(信号转导机制)、intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport(胞内运输、分泌与囊泡转运)、defense mechanisms(防御机制)、extracellular structures(胞外结构)、mobilome: prophages, transposons(移动基因组:原噬菌体、转座子)、nuclear structure(细胞核结构)、cytoskeleton(细胞骨架)、not aligned to COG database(未比对到COG数据库)、rRNA(核糖体RNA)、tRNA(转运RNA)、GC skew(GC偏移)、GC content(GC含量)。
2.2 L.fermentum 2-1糖转运系统
碳源从生长基质向细胞转运是受严格调控的过程,其转运方式通常有3种,磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP)-糖磷酸转移酶系统(sugar phosphotransferase system, PTS)、ABC型糖转运系统以及糖渗透[5]。最常见的PEP-PTS系统包含负责结合、跨膜转运和磷酸化多种糖底物的蛋白质,糖类物质在能量耦合蛋白酶(Enzyme I,EI)、磷酸载体蛋白(histidine-containing phosphocarrier protein, HPr )和碳水化合物特异性通透酶(Enzyme II, EII)的作用下形成EPS前体物质糖核苷酸[8]。然后在糖基转移酶(glycosyltransferase, GTs)的催化作用下顺序性转移至异戊二烯醇磷酸酯(脂载体)上形成HePS重复单元,构成EPS的主链和侧链,随后在聚合酶的作用下发生聚合形成完整的EPS,经翻转酶作用从细胞内膜输出至细胞外膜[9]。由表4可知L.fermentum 2-1具有编码甘露糖、蔗糖、纤维二糖和葡萄糖转运体亚基EII的糖特异性通透酶基因(manX、manY、manZ、scrA、celB、ptsG),编码半乳糖渗透酶、乳糖渗透酶和麦芽糖渗透酶的基因galP、lacS和malF。因此,推测L.fermentum 2-1可以利用的碳源为甘露糖、蔗糖、纤维二糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖和半乳糖。张敏等[10]也验证了具有PEP-PTS转运系统的嗜盐四联球菌CGMCC 3792可以利用甘露糖、果糖、麦芽糖、葡萄糖和纤维二糖作为碳源。此外,FAGBEMIGUN等[11]也发现从发酵乳制品中分离出的瑞士乳杆菌314,发酵粘液乳杆菌317、德氏乳杆菌328 M、嗜热链球菌252具有用于糖摄取的PEP-PTS甘露糖转运系统。
表4 L.fermentum 2-1糖转运系统相关基因
Table 4 Genes related to sugar transport systems inL. fermentum 2-1
基因名称编码蛋白manXPTS system mannose-specific EIIAB component(PTS系统甘露糖特异性EIIAB组分)manYPTS system mannose-specific EIIC component(PTS系统甘露糖特异性EIIC组分)manZPTS system mannose-specific EIID component(PTS系统甘露糖特异性EIID组分)scrAsucrose PTS system EIIBCA component(蔗糖PTS系统EIIBCA组分)celBcellobiose PTS system EIIC component(纤维二糖PTS系统EIIC组分)ptsGPTS EIIBC components, glucose-specific(葡萄糖特异性PTS EIIBC组分)galPgalactose permease(半乳糖通透酶)lacSlactose permease(乳糖通透酶)malFmaltose permease(麦芽糖通透酶)
2.3 L.fermentum 2-1核苷酸糖合成途径
转运至细胞中的糖会通过一系列代谢途径生成糖核苷酸前体。根据基因组结构注释和KEGG数据库注释预测L.fermentum 2-1的核苷酸糖合成基因及其EPS生物合成途径。由表5和图2可知,葡萄糖、蔗糖、纤维二糖和甘露糖经PEP-PTS转运系统进入细胞质,乳糖、半乳糖和麦芽糖则通过渗透酶进入细胞质。乳糖和半乳糖的代谢涉及由乳糖或半乳糖诱导的gal-lac操纵子编码的Leloir通路,lac操纵子包括编码β-半乳糖苷酶的lacZ,用于将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖。GalK、GalT、GalE和 GalM的gal操纵子负责L. fermentum 2-1的半乳糖代谢。乳糖在lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶的作用下,被分解为D-半乳糖和D-葡萄糖,其中GalM催化D-半乳糖形成α-吡喃型的α-D-半乳糖,随即被GalT转化为核苷酸糖的前体α-D-半乳糖-1-磷酸,GalK则负责α-D-半乳糖-1-磷酸和UDP-半乳糖之间的相互转换,形成的UDP-半乳糖还可以在GalE的催化下转化为UDP-葡萄糖。
图2 L.fermentum 2-1EPS生物合成途径
Fig.2 EPS biosynthesis pathway in L.fermentum 2-1
表5 L.fermentum 2-1核苷酸糖生物合成相关基因
Table 5 Genes involved in nucleotide sugar biosynthesis inL. fermentum 2-1
基因名称编码蛋白lacZβ-半乳糖苷酶(β-galactosidase)galM半乳糖变位酶(galactose mutarotase,GalM)galT半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(galactose-1-phosphate uridylyltransferase,GalT)galK半乳糖激酶(galactokinase,GalK)galEUDP-葡萄糖4-差向异构酶(UDP-glucose 4-epimerase,GalE)galFUTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase,GalF)sacA蔗糖-6-磷酸水解酶(sucrose-6-phosphate hydrolase,SacA)bglA6-磷酸-β-葡萄糖苷酶(6-phospho-β-glucosidase,BglA)glk葡萄糖激酶(glucokinase,Glk)scrK果糖激酶(fructokinase)pgi葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase,Pgi)pgm磷酸葡萄糖变位酶(phosphoglucomutase,Pgm)mapA麦芽糖磷酸化酶(maltose phosphorylase,MapA)rmlA葡萄糖-1-磷酸胸苷酰移酶(glucose-1-phosphate thymidylyltransferase,RmlA)manA甘露糖-6-磷酸异构酶(mannose-6-phosphate isomerase,ManA)manB磷酸甘露糖变位酶(phosphomannomutase,ManB)rfbBdTDP-D-葡萄糖4,6-脱水酶(dTDP-D-glucose 4,6-dehydratase,RfbB)rfbCdTDP-4-脱氢鼠李糖3,5-差向异构酶(dTDP-4-dehydrorhamnose 3,5-epimerase,RfbC)rfbDdTDP-4-脱氢鼠李糖还原酶(dTDP-4-dehydrorhamnose reductase,RfbD)rfbAdTDP-葡萄糖焦磷酸化酶(dTDP-glucose pyrophosphorylase,RfbA)
Pgm是UDP-葡萄糖生物合成途径的一部分。D-葡萄糖则首先在 Glk的催化下形成D-葡萄糖-6-磷酸,然后在Pgm的作用下实现和D-葡萄糖-1-磷酸的相互转化,D-葡萄糖-6-磷酸还可以在Pgi催化下形成D-果糖-6-磷酸,另一方面D-葡萄糖-1-磷酸经 GalF催化转变为UDP-葡萄糖,或在RmlA作用下生成dTDP-葡萄糖,然后依次经 RfbB、 RfbC、 RfbD形成dTDP-4-氧代-6-脱氧-D-葡萄糖、dTDP-4-氧代-L-鼠李糖和dTDP-L-鼠李糖。
转运至细胞质的纤维二糖在 BglA的作用下磷酸化为D-葡萄糖-6-磷酸,然后进入糖酵解途径。麦芽糖则经 MapA直接磷酸化为D-葡萄糖-1-磷酸和D-葡萄糖。D-甘露糖和蔗糖经酶的作用被磷酸化为D-甘露糖-6-磷酸和蔗糖-6-磷酸,ManB的作用下转化为D-甘露糖-1-磷酸,随后生成EPS重复单元合成前体GDP-甘露糖,SacA作用形成D-果糖-6-磷酸。纤维二糖、D-葡萄糖、蔗糖和D-甘露糖经酶促反应形成的纤维二糖-6-磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、蔗糖-6-磷酸和D-甘露糖-6-磷酸在磷酸异构酶的作用下发生相互转换。
L.fermentum 2-1可以生成UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、dTDP-L-鼠李糖、GDP-甘露糖、4种糖核苷酸,然后由糖基转移酶作用在脂质载体相邻的糖核苷酸上形成重复单元,并由翻转酶将EPS运转至细胞外。
2.4 L.fermentum 2-1 EPS重复单元的合成、聚合和输出
EPS重复单元的生物合成由位于LAB质粒或染色体上的EPS生物合成基因簇调节和决定[12],由表6和图3可知,L.fermentum 2-1的eps基因簇由13个基因组成,总长度12 679 bp,包含EPS转录基因epsA和epsB,链长决定基因epsD,糖基转移酶基因pglC、amsE、tuaG、exoL、wbbL和EPS转运基因wzx。epsA为LytR家族转录调节因子,与发酵粘液乳杆菌AGR1485有97.28%的同源性,负责调控EPS的产生,由N末端的胞浆区和跨膜区组成的信号锚定区域组成。EPS还由编码酪氨酸蛋白磷酸酶且未磷酸化的基因epsB驱动[10],与发酵粘液乳杆菌A10有相似的同源性。epsD为EPS链长调节基因,与发酵粘液乳杆菌VSI05中epsD的同源性达到97.98%,其编码的酪氨酸蛋白激酶控制EPS链上重复单元的数量调节链长。
图3 L.fermentum 2-1中与EPS合成相关的基因簇
Fig.3 Gene cluster associated with EPS biosynthesis in L.fermentum 2-1
表6 L.fermentum 2-1 EPS基因簇功能
Table 6 Functions of the EPS gene cluster in L.fermentum 2-1
基因编码蛋白相似菌株基因号同源性/%epsALytR家族转录调节因子L.fermentum AGR1485CP047584.197.28epsD酪氨酸蛋白激酶L.fermentum VSI05CP118092.197.98epsB酪氨酸蛋白磷酸酶L.fermentum A10CP188318.196.89pglC糖转移酶L.fermentum EFEL6800CP124737.194.37amsE糖基转移酶L.fermentum 3872CP011536.199.03unknownIS30转座酶L.fermentum NS2301G2CP165726.199.71tuaGGT2家族糖基转移酶———exoLGT4家族糖基转移酶———waaL假定蛋白———unknownIS30转座酶L.fermentum AGR1485CP047584.198.70wbbLGT2家族糖基转移酶———wzx翻转酶———
注：“—”表示NCBI数据库中没有检索到相似菌株。
糖基转移酶可以催化碳水化合物(低聚糖和多糖)等多种糖轭合物的形成,负责将前体糖核苷酸作为糖基供体转移至内膜脂载体,形成脂载体焦磷酸化糖重复单元从而完成EPS的合成[9]。L.fermentum 2-1中负责编码糖基转移酶的基因有pglC(CP124737.1,94.37%)、amsE(CP011536.1,99.03%)、tuaG、exoL和wbbL。其中pglC可将UDP-糖基供体通过碳与载体磷酸结合,形成启动EPS重复单元的磷酸糖键[13]。tuaG和wbbL编码的酶属于GT2酶类家族,tuaG作用于UDP-葡萄糖底物,形成糖苷键延长链条,生成α-或β-键[14],wbbL编码已知的鼠李糖转移酶,可将dTDP-鼠李糖以α-1,3-键连接到半乳糖或脂质载体[15]。exoL编码的酶属于GT4酶类家族,通常将UDP-葡萄糖以β-1,4-(或β-1,3-)键整合到EPS重复单元中[16]。此外,还注释到IS30转座酶基因,可以通过切割和连接DNA来实现转座子在基因组内的重新定位[17]。
大部分EPS在革兰氏阴性和革兰氏阳性菌中通过翻转酶(O-antigen flippase, Wzx)/外膜聚合蛋白(O-antigen polymerase, Wzy)依赖型途径合成,其合成过程包括4个步骤:碳源的运输和磷酸化;糖核苷酸前体的形成;重复单元的合成;重复单元的聚合和释放[18]。L.fermentum 2-1基因簇中含有一个编码翻转酶的基因(wzx)。该基因参与重复单元(包括含有O型抗原的重复单元)的膜转运[7],单个重复单元与内膜上的十一烯醇二磷酸锚点(C55)连接,由几种糖基转移酶组装,并通过Wzx蛋白转运到细胞质膜上。下一步,它们在周质空间由Wzy蛋白进行聚合并被输出至细胞表面。eps基因簇在多糖合成过程中发挥重要作用,如赵雪芳[19]基于全基因组序列发现,植物乳杆菌MC5的eps基因簇1中具有编码Wzx的基因,且具有较强的重复单元运输能力,MANNINEN等[20]通过基因组测序在清酒乳杆菌中发现了与EPS的糖代谢和多糖产生相关的基因簇。
2.5 L.fermentum 2-1 EPS重复单元的合成、聚合和输出
通过对L.fermentum 2-1不同生长阶段的EPS产量进行测定,结果如图4所示。L.fermentum 2-1的EPS产量在9 h(857.15 mg/L)和21 h(842.33 mg/L)达到最大,9～18 h时菌株的EPS产量先下降然后趋于平稳,而18～24 h EPS的产量先上升后趋于平稳。研究表明,EPS的产量与菌株的不同生长阶段密切相关[21],通常在对数期或平稳期大量积累。如植物乳植杆菌在36 h左右达到EPS产量峰值,超过48 h后EPS产量趋稳或下降[22]。而与18 h相比,21 h和24 h L.fermentum 2-1 EPS的产量又显著增加(P<0.05)。此时,营养和碳源基本消耗完毕,细胞虽然无法继续分裂,但细胞内残留的少量多肽和死细胞裂解产物仍可被部分细胞利用作为碳源来合成EPS[23]。例如长时间饥饿培养中,乳酸乳球菌就利用培养基中的痕量多肽和细胞碎片获得能量[24],这间接为EPS合成提供了原料。EPS能为细胞提供物理和化学保护,在营养缺乏、脱水等胁迫条件下,EPS可保持细胞周围的水分和稳定细胞膜,抵御逆境,因此,细胞会继续消耗能量合成EPS[25]。例如,有研究表明EPS过度产生的菌株在长期培养时存活时间明显延长,而EPS缺失菌株则早期死亡,表明EPS有助于菌株在营养耗尽后的存活[26]。EPS产量涉及EPS合成相关基因的调控,黄淑婷等[27]研究发现敲除植物乳植杆菌YZH81的cps2基因簇后其EPS产量显著下降。
图4 L. fermentum 2-1在不同生长阶段的菌体密度和EPS产量
Fig.4 Cell density and EPS production of L.fermentum 2-1 at different growth stages
注:不同小写字母表示各组之间差异具有统计学显著性(P<0.05)。
2.6 L.fermentum 2-1的基因表达量
乳酸菌的EPS合成是一个复杂的过程,因此对L.fermentum 2-1不同生长阶段与EPS合成有关基因的相对表达量进行测定,分析其对EPS产量的影响。如图5所示,epsA和epsD的转录水平在9 h达到最大(P<0.05),然后开始下降,15～21 h逐渐趋于平稳,24 h又显著升高(P<0.05)。epsB的相对表达量在9 h和24 h较高,且15～24 h的相对表达量与epsA和epsD有相同的趋势。因此,推测9 h L.fermentum 2-1的EPS产量最高,这与EPS产量的实验结果一致(图4)。eps基因簇的基因表达受生长阶段的影响,吴娜等[28]研究表明,副干酪乳酪杆菌ProSci-92中糖基转移酶和膜转位蛋白基因wze在6 h和18 h处于较高水平,而衰亡期的eps基因则处于较低水平。营养供给和群体感应对eps基因簇的表达也会产生影响。例如,在唾液链球菌嗜热亚种中,提升培养基中组氨酸浓度可导致epsA、epsB、epsD等基因的转录水平显著上调[29]。而缺失luxs基因的鼠李糖乳酪杆菌GG,其EPS分泌和生物膜形成能力也会降低[30]。此外,碳源种类和浓度对EPS相关基因表达亦有关键影响,如蔗糖、葡萄糖、乳糖等的丰度可调控eps基因簇的表达及相关酶活性[31]。
a-L.fermentum 2-1EPS基因簇相对表达量;b-L.fermentum 2-1核苷酸糖合成相关基因表达量
图5 L. fermentum 2-1在不同生长阶段与EPS生物合成相关基因的表达量
Fig.5 Expression levels of genes related to EPS biosynthesis inL.fermentum 2-1 at different growth stages
注:不同字母表示同一基因在不同生长阶段间的差异具有统计学显著性(P<0.05)。
pglC、tuaG、exoL和wbbL为糖基转移酶基因,pglC基因表达量在9 h最高,9～12 h下降,15～21 h逐渐趋于稳定,到24 h基因表达量又显著回升(P<0.05);TuaG的基因表达量在3 h和9 h最大,12～21 h先下降然后趋于平缓,24 h回升(P<0.05);exoL在3 h的转录水平最高,6～21 h相比3 h下降但逐渐趋于稳定,24 h转录水平相比21 h显著升高(P<0.05);wbbL的基因表达量在3～9 h先下降然后升高,9～24 h呈现先下降后趋于平稳然后升高的趋势。L.fermentum 2-1中调控糖基转移酶的基因在3、9、21～24 h处于较高水平,说明此阶段有大量糖重复单元的合成,这与图4中较高的EPS产量相一致。此外,乔少婷等[32]研究发现,唾液链球菌嗜热亚种IMAU2055基因簇中的epsE和eps1F等糖基转移酶的基因表达量在6 h和18 h处于较高水平,是菌株产生EPS的关键阶段。
在L.fermentum 2-1中,基因galT、galK、galE、galF、glk、pgm、pgi在9、12、15、21、24 h表现出更强的转录水平,表明菌株在此生长阶段合成了更多的UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖。galT活性的增加诱导菌株利用半乳糖合成更多的UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖,galE活性的提高有利于UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖的快速转变,满足单糖合成的需要[23]。
3 结论
本研究系统解析了L.fermentum 2-1的EPS生物合成途径。通过全基因组测序与功能注释,发现L.fermentum 2-1具有纤维二糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖转运系统,以及UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、dTDP-L-鼠李糖和GDP-甘露糖4种糖核苷酸前体合成潜力。同时,基因组中存在一个由12个基因组成的完整eps基因簇。RT-qPCR结果进一步验证,菌株的EPS合成受生长阶段调控,且基因表达水平与产量呈密切相关。该研究阐明了L.fermentum 2-1的EPS合成与调控机制,为其在功能性发酵制品中的应用提供了理论依据。未来研究可进一步探讨EPS结构与生物活性之间的构效关系,解析关键酶的催化特异性与转录调控机制,并通过基因改造与发酵工艺优化实现EPS的高效合成,为高附加值功能性发酵食品的开发提供科学支撑。
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