开菲尔(kefir)是一种具有数百年历史的发酵乳制品[1],其不仅具有独特的美味,更含有丰富的益生菌群[2],被认为具有促进健康的功效[3]。开菲尔是由开菲尔粒发酵而成的,开菲尔粒是一种不规则的、类似花椰菜的乳白色微生物共生体,其复杂的微观结构主要由乳酸菌、酵母菌和醋酸菌,以及这些微生物代谢活动所产生的蛋白质和多糖等胞外基质组成[4-5],开菲尔粒稳定结构的关键正是在于其复杂的微生物群落及其形成的生物膜和胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)[6],生物膜是开菲尔粒形成的基础,EPS是开菲尔粒内的重要组成成分,两者通过形成稳定的“生物膜-EPS”复合体系,共同构成了开菲尔粒独特而稳定的物理结构基础。开菲尔粒的形成是一个复杂的过程,目前对于开菲尔粒内微生物的研究主要集中在以乳酸菌为核心的单菌功能或其与乳酸菌-酵母菌的双边关系[7],例如,研究较多的是乳酸菌分解乳糖产生半乳糖和葡萄糖,以供酵母利用,而酵母菌负责提供生长因子等[8]。相比之下,对于酵母菌与醋酸菌的互作机制,尤其是其对开菲尔粒形成的贡献,则缺乏系统性的阐释。
尽管近年来有研究开始关注酵母菌与醋酸菌的协同代谢,并初步揭示了“酵母菌产乙醇-醋酸菌氧化为乙酸”这一基础代谢互作机制的存在[9],但现有认知多停留在代谢物交换的层面,关于这种互作关系具体如何影响开菲尔粒形成,目前仍缺乏系统性的实验证据。开菲尔粒的稳定存在,归根结底依赖于其生物膜和EPS构成的基质。因此本研究从生物膜和EPS入手,采用前期实验室从开菲尔粒中分离出的酵母菌和醋酸菌并筛选优势菌株,重点观察酵母菌-醋酸菌共培养体系在生物膜的动态形成过程、EPS合成及相关生理特性(如疏水性和自聚集性)上的互作效应,最后通过傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)对比人工共培养形成的生物膜与天然开菲尔粒的结构相似性,为未来进一步探索开菲尔粒提供基础研究。本研究期望通过解析酵母菌-醋酸菌之间的互作关系,完善对开菲尔粒内微生物菌群在开菲尔粒体系中作用的认知,并为开发基于可控混菌体系的优质发酵剂奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 实验菌株
马克斯克鲁维酵母Y7(Kluyveromyces marxianus Y7)、K.marxianus Y9、K.marxianus Y37、可可豆醋杆菌A11(Acetobacter fabarum A11)、冲绳醋杆菌A15(Acetobacter Okinawensis A15)、巴氏醋杆菌A25(Acetobacter pasteurianus A25)、A.fabarum A26均分离于内蒙古自治区锡林郭勒盟牧民家的开菲尔粒。
1.1.2 材料与试剂
YPD培养基,青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;醋酸菌培养基,上海钰博生物科技有限公司;MRS培养基,广东环凯微生物科技有限公司;苯酚,天津市福晨化学试剂厂;甲醇,天津市富宇精细化工有限公司;重铬酸钾,天津市风船化学试剂科技有限公司;二甲苯,天津鑫铂特化工有限公司。
1.2 仪器与设备
INFINITE 200 PRO酶标仪,奥地利帝肯有限责任公司;U-5100紫外分光光度计,株式会社日立制作所;SX-300高压灭菌锅,日本Tomy Digital Biology公司;IRSpirit-T FT-IR仪,日本岛津制作所。
1.3 实验方法
1.3.1 菌株培养
将酵母菌和醋酸菌分别以3%的接种量接种于各自对应液体培养基于30 ℃下培养,活化3代后调节菌量至OD600nm为1左右,接于新鲜培养基中培养后进行相应指标的测定。酵母菌和醋酸菌涡旋混匀后以1∶1的比例进行混合培养(30 ℃、pH 6.5),在培养0～48 h内,每隔4 h取样进行各个指标的测定,以未接种的培养基作为空白,每个样3组平行。
1.3.2 EPS测定
取10 mL培养液加入4倍体积乙醇于4 ℃下醇沉24 h,取静置后的液体10 000 r/min离心10 min,弃去上清液,加入10 mL蒸馏水重新溶解沉淀后转入3 500 Da的透析袋中透析24 h,每隔4 h更换1次透析用蒸馏水。取透析完成的溶液使用苯酚硫酸法测定粗多糖产量[10]。
1.3.3 生物膜形成能力测定
参考HAN等[11]的方法并略做改动。菌株培养一定时间后弃去菌液(培养时间同1.3.1节,在培养0～48 h内每隔4 h进行取样),用200 μL PBS缓冲液轻轻冲洗培养孔3次,待培养孔干燥后加入200 μL 10%(体积分数)的甲醇固定15 min;弃去甲醇,待培养孔干燥后加入200 μL 0.1%(体积分数)结晶紫,室温静置20 min;用200 μL PBS缓冲液洗涤培养孔3次,待培养孔干燥后加入200 μL 95%(体积分数)乙醇溶液进行脱色,室温静置10 min后用酶标仪测其OD560nm,用生物膜形成指数(specific biofilm formation, SBF)判断生物膜的形成能力。其中SBF≥1.10代表强生物膜形成能力,0.70～1.09代表中等,0.35～0.69代表弱,SBF<0.35代表阴性。其计算如公式(1)所示:
(1)
式中:AB,黏附的菌体的OD560nm;CW,培养基的OD560nm;G,菌体的OD620nm。
1.3.4 发酵液乙醇含量的测定
参考何川等[12]的方法进行菌液乙醇含量的测定。
1.3.5 发酵液乙酸含量的测定
根据GB 12456—2021 《食品安全国家标准 食品中总酸的测定(含第1号修改单)》规定的酸碱指示剂滴定法,以酚酞为指示剂确定滴定终点,按照碱的消耗量计算食品中的总酸含量,最后根据乙酸换算系数计算发酵液中乙酸含量。
1.3.6 菌株疏水性测定
菌株疏水率的测定参考靳彩娟[13]的方法并略作修改,离心收集菌体,使用无菌生理盐水重悬2次后将菌悬液的OD600nm值调节到1左右,取2 mL菌悬液与400 μL二甲苯充分涡旋混匀后于室温下静置30 min。取1 mL水相于600 nm处测定吸光值。细菌表面疏水率的计算如公式(2)所示:
(2)
式中:H,菌株的表面疏水率,%;A0,混合前的OD600nm值;A,混合后的OD600nm值。
1.3.7 菌株自凝聚力测定
自凝聚力的测定参考靳彩娟[13]的方法,将培养好的细菌离心收集后使用无菌生理盐水重悬2次,然后使用无菌生理盐水将菌悬液的OD600nm值调节到1左右,取15 mL于室温静置1、2、3、4、5 h后吸取1 mL上层溶液于600 nm处测定吸光值,分别记为B1、B2、B3、B4、B5,每个样本3个平行。菌株自凝聚能力的计算如公式(3)所示:
自凝聚力
(3)
式中:B0,菌悬液的初始OD600nm,Bt,每个时间点下的OD600nm。
1.3.8 不同培养条件测定
根据1.3.3节中方法,选择温度28、30、37、42 ℃,pH 4.5、5.5、6.5、7.5、8.5进行菌株培养。测定其SBF。
1.3.9 FT-IR分析
将培养4 h的混菌生物膜样品与溴化钾按1∶100(质量比)的比例研磨使其混合均匀,压片成薄片。于4 000～400 cm-1下扫描,扫描64次,分辨率为4 cm-1。
1.4 数据处理与分析
使用Excel 2010、Origin 2021和SPSS 26进行作图与数据分析。每组实验3组平行,实验结果均以“平均值±标准差”表示。采用单因素方差分析法进行显著性差异分析,当P<0.05时,表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 酵母菌与醋酸菌初筛
通过EPS产量与生物膜形成能力2项关键指标,生物膜形成能力通过测得的SBF表示,对3株酵母菌、4株醋酸菌进行筛选。结果如图1所示,醋酸菌中A26的EPS产量和SBF显著高于其他菌株(P<0.05),其次是A15。酵母菌中Y7的EPS产量和SBF均为最优(P<0.05),其次是Y9。因此选定Y7、Y9 2株酵母菌,A26、A15 2株醋酸菌进行后续共培养研究,围绕菌株混合培养过程中的生物膜形成能力和EPS产量等指标的变化情况继续进行筛选,预期找到2株具有最佳协同作用的菌株。
A-酵母菌;B-醋酸菌
图1 菌株的SBF和EPS产量
Fig.1 SBF and EPS production of strains
注:不同大写字母表示同一指标不同样品之间具有显著性差异(P<0.05)(下同)。
2.2 共培养对生物膜形成和EPS产量的影响
从图2中可以看出2株酵母菌的SBF远高于2株醋酸菌,并且在纯培养过程中SBF均随培养时间呈现出先增加后降低的趋势,而共培养则呈现出持续下降的趋势。对于2株酵母菌,可以看出在培养过程中Y7的SBF始终强于Y9,2株醋酸菌中A26的膜形成能力表现得更出色。值得关注的是在共培养体系中,与Y9相比,醋酸菌和Y7共培养后的SBF更高,其中A26与Y7共培养后的SBF始终高于其他菌株共培养,并且在4 h时超越了Y7纯培养的SBF峰值。另外2株醋酸菌与2株酵母菌共培养后,培养前期SBF均高于单菌株培养,说明共培养促进了菌株培养前期的生物膜形成能力。综上所述Y7与A26共培养后生物膜形成能力最强,推测后续的持续下降可能跟醋酸菌不断产酸有关。酸性条件下会影响菌体表面的电荷分布,从而改变菌体表面特性[14],酸性环境还可能影响EPS的构象与稳定性,从而削弱菌体间的黏附与生物膜结构的维持能力[15],致使生物膜形成能力下降。
A-酵母菌;B-醋酸菌;C-混菌
图2 酵母菌、醋酸菌和混菌培养过程中SBF值的变化
Fig.2 Changes in SBF values during the culture of yeast, acetic acid bacteria, and mixed strains
A-酵母菌;B-醋酸菌;C-混菌
图3 酵母菌、醋酸菌和混菌培养过程中EPS产量的变化
Fig.3 Changes in EPS production during the culture of yeast, acetic acid bacteria, and mixed strains
图3的结果表明在纯培养过程中,EPS产量随时间呈现出先增加后降低的趋势,这与菌株的SBF趋势一致,说明菌株生物膜的形成与EPS的产生存在一定联系[16]。但是与醋酸菌SBF不同的是醋酸菌EPS产量有很大提升,甚至A26的EPS产量在某些时间点超过Y7、Y9 2株酵母。有研究表示EPS可分为松散型EPS和紧密型EPS 2种类型[17],松散型EPS很容易释放到环境中[18-19],本研究数据显示A26多糖含量多,但生物膜形成量少,由此推测可能A26产生的大部分EPS为松散型,游离于环境中并不参与生物膜的形成。在纯培养过程中,酵母菌Y7的EPS产量高于Y9,醋酸菌A26的EPS产量高于A15。在共培养体系中,Y7和A26的EPS产量最强,并且本研究还发现只有Y7与A26 2株菌共培养后的EPS产量在12 h之前得到提升,12 h之后低于单菌纯培养,这与图2中2菌株SBF趋势相似,都是在培养前期得到提升。说明Y7和A26共培养后能够有效促进培养前期生物膜的快速形成,显著提高EPS产量。接下来,本研究将对酵母菌Y7、醋酸菌A26以及两者共培养后的一些特性展开分析。
2.3 最佳培养条件测定
2.3.1 不同温度下生物膜形成能力及OD600nm的变化
前面共培养结果显示4 h时生物膜形成能力最强,在此基础上,探索共培养菌株生物膜形成能力最优的温度条件。将菌株置于4种温度下进行培养,测定培养4 h时的SBF,结果如图4所示。醋酸菌、酵母菌和混菌的生物膜形成能力受温度的影响变化趋势一致,均在30 ℃最强、28 ℃最弱,其中混菌的SBF远大于其他2株单菌。而从图5中可以看到3组菌的菌密度随温度的升高而不断增加,单菌组和混菌组的菌株数量在30 ℃下均较少,这与测得的生物膜形成能力随温度的变化趋势及最适宜菌株生物膜形成温度的结果均不一致,推测两者之间无明显关联,ZHANG等[20]研究也出现了同样的结果。另外,混菌的OD600nm增长趋势与A26相似,这里再次验证了A26为混菌中的优势菌株。综上所述,最终确定30 ℃为菌株生物膜形成能力的最佳培养温度,后续实验将在此温度下进行。
图4 不同温度下的菌株SBF值
Fig.4 SBF values of strains at different temperatures
图5 不同温度下的菌株OD600nm值
Fig.5 OD600nm values of strains at different temperatures
2.3.2 不同pH值下生物膜形成能力及OD600nm变化
在2.3.1节确定的培养温度30 ℃下进行了各菌株在不同pH值的指标测定,结果如图6所示。与不同温度下培养的结果一样,混菌在不同pH值下的SBF均远大于其他2株单菌(P<0.05),并且单菌和混菌都在pH值=6.5时SBF达到最高。另外可以看到醋酸菌对pH值的变化最敏感,而与单菌培养相比,共培养体系的生物膜形成能力受到外界pH值变化的影响较小,这可能提示共培养后增加了体系的pH适应性。通过3个组别的SBF比较还发现生物膜形成能力在碱性条件下略强于酸性条件,这可能是由于在接近中性的偏碱条件下,菌体表面电荷与EPS的物理化学性质更利于菌体间的黏附和聚集[21]。这一发现与ÇAM等[22]的研究结果一致,他们也观察到有些菌株在碱性条件下可以形成更多的生物膜和EPS。图7为不同pH值下菌株的OD600nm值变化趋势,可以看出纯培养与共培养均随pH值的增加呈现不同程度的增长,在pH值=6.5时OD600nm值并不是最强,这与2.3.1节得到的结果相似。通过以上分析可知醋酸菌、酵母菌以及混菌的生物膜形成能力受不同温度、pH的影响趋势一致,由此确定了最佳培养条件为30 ℃、pH值=6.5。
图6 不同pH值下的菌株SBF
Fig.6 SBF of strains at different pH values
图7 不同pH值下的菌株OD600nm值
Fig.7 OD600nm values of strains at different pH values
2.4 共培养对菌体表面特性及代谢产物的影响
2.4.1 菌株黏附性
菌株黏附性是指微生物通过物理或化学作用附着于宿主细胞、生物材料或其他介质表面的能力,是微生物定殖、生物膜形成及环境适应的重要生物学特性[23]。
2.4.1.1 疏水率
微生物细胞表面疏水性是确定微生物黏附到惰性表面能力的相关特性[24]。本实验中菌株纯培养与共培养对二甲苯的疏水率如图8所示,不同组别与二甲苯结合后的表面疏水性存在显著差异(P<0.05)。疏水性判定标准为H≥71%为强疏水性,36%≤H≤70%为中疏水性,H≤35%为弱疏水性[25]。结果显示,酵母菌Y7疏水率显著高于醋酸菌A26(P<0.05),为(74.4±1.02)%,表现为强疏水性;醋酸菌A26疏水率为(28.56±3.68)%,为弱疏水性,这与图2中Y7较强的SBF和A26较弱的SBF结果相对应。有研究表明疏水性的大小一定程度上反映了其生物膜形成能力的强弱,疏水性越强成膜性越强,反之亦然[26]。另外本研究发现共培养后测得的疏水率并没有表现为强烈的增加或减少,整体上表现为中疏水性(63.13±0.93)%,高于醋酸菌A26(P<0.05)。之前的研究也有过报道,ALVAREZ-ORD
EZ等[27]在多物种生物膜中发现菌株间的协同相互作用,表现为弱生物成膜物会利用与强生物成膜物的相互作用来参与生物膜的形成[27]。因此本研究推测弱疏水性的A26与强疏水性的Y7共培养后,Y7首先自行聚集,随后A26借助Y7形成的菌体集团也开始聚集,从而增加了自身的疏水能力,但是由于A26自身疏水能力太低,导致共培养后的疏水能力仅提升到了中等,并没有超过Y7纯培养的疏水能力。
图8 纯培养和共培养菌株疏水率
Fig.8 Hydrophobicity of pure and co-cultured strains
另外,酵母菌Y7在疏水过程中会产生较大的气泡见电子版增强出版附图1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044579,下同),并且溶液相较其他2组更加清晰,表明菌体更加亲近油相,具有较强的疏水性。醋酸菌A26产生的气泡更小,分布也更加密集,由于溶液浑浊整体呈现白色,菌体在两相中均匀分布,可以看出其疏水性较弱。结合2.2节中的生物膜形成能力可以看出菌株疏水性与生物膜形成能力成正相关。相较于单菌A26,两菌混合培养后其浑浊度有所下降,更多的菌体进入油相,但整体情况与电子版增强出版附图1-B相似,可以推断出在混合培养过程中醋酸菌A26为优势菌株。
2.4.1.2 聚集性
菌株的聚集性分为单一菌株的自聚集性和混合菌株的共聚集性,从电子版增强出版附图2可以看出,3组凝聚率有明显的不同,酵母菌Y7的菌体几乎全部聚集在试管底部,上部溶液清澈透明,表明其自凝聚能力很强。醋酸菌A26的菌体在溶液中均匀分布,溶液较为浑浊,其自凝聚能力较弱,两菌混合培养后的溶液浑浊程度在Y7与A26之间,以上3组的凝聚能力与疏水性表现一致,表明实验结果较为准确。
菌株在快速增殖过程中会发生自聚集,这与黏附能力正相关[28]。如表1所示,3组的凝聚能力均随时间增加发生增强趋势。其中纯培养Y7的自凝聚能力最强(P<0.05),在3 h自凝率便达到(91.56±0.59)%,在5 h时更是达到了(98.27±0.16)%。A26的自凝聚能力显著低于其他菌株(P<0.05),在5 h时自凝率仅为(24.29±0.12)%,而共培养在5 h自凝率为(62.96±0.32)%。3组的自凝聚率与疏水率表现一致,并且结合2.2节的生物膜形成能力可以看出菌株自凝聚力同样与生物膜形成能力成正相关,在一定程度上反映了其生物膜形成能力的大小[29]。因此推测Y7和A26共培养后,A26会利用与Y7的相互作用来提升自身黏附性。
表1 纯培养和共培养菌株的聚凝力 单位:%
Table 1 Aggregation of pure and co-cultured strains
菌株编号时间/h12345Y760.85±0.74E86.86±0.86C91.56±0.59B97.57±0.37A98.27±0.16AA2619.53±0.75H20.45±0.27H23.84±0.35G23.65±0.55G24.29±0.12GY7+A2655.61±1.10F56.66±1.08F61.30±1.44DE62.96±0.57D62.96±0.32D
注：不同大写字母表示同一指标不同样品之间具有显著性差异(P<0.05)。
综上所述,共培养体系的疏水性和聚集能力虽然显著高于醋酸菌纯培养,但并未超过酵母菌纯培养的水平。研究推测,酵母菌和醋酸菌可能存在一种功能上的分工与协作。酵母菌本身具有较强的表面疏水性和自聚集能力,这使其擅长在初始阶段附着于表面,为生物膜的形成提供“基石”,而醋酸菌自身的这些特性较弱,但其与酵母菌共培养后,表面特性得到显著增强。这表明醋酸菌的角色可能是嵌入由酵母菌搭建的初始框架中,并通过其代谢活动(如产生乙酸)强化和扩大生物膜结构,大量合成EPS以形成稳定的基质。因此,共培养体系的成功不在于单个菌株属性的简单叠加,而在于功能的互补与整合,酵母菌负责“奠基”,醋酸菌负责“扩建与加固”。
2.4.2 菌株发酵液乙醇、乙酸产量
2.4.2.1 单菌培养与共培养酵母菌乙醇产量
从图9可看出,乙醇质量分数在0%～2.0%的范围内与吸光度A值之间呈线性相关,线性回归方程为y=4.072x-0.166 2(R2=0.998 5),其中x是吸光度,y是乙醇质量分数。葡萄糖质量分数在0.75%～2.0%的范围内与吸光度A值之间呈线性相关,回归方程为y=6.054 3x+0.338 6(R2=0.997 7),其中x是吸光度,y是葡萄糖质量分数。2个回归方程R2均大于0.99,均可用于定量分析。
A-重铬酸钾;B-DNS
图9 重铬酸钾标准曲线和DNS标准曲线
Fig.9 Potassium dichromate standard curve and DNS standard curve
实验结果如图10所示,在酵母菌Y7纯培养体系及其与醋酸菌A26的共培养体系中,乙醇代谢呈现显著差异。将两者结果进行对比,发现共培养条件下Y7的乙醇产量呈现全程性抑制现象,本研究推测其作用机制可能是由于在培养前期A26快速增殖,大幅利用Y7产生的乙醇,从而导致乙醇产量减少。随着培养继续进行,乙酸大量积累,导致体系pH值逐渐降低,超出Y7对酸性环境的承受范围,对Y7产生了抑制作用,从而出现乙醇产量低于纯培养的现象。值得关注的是,2种培养模式下的乙醇代谢动力学存在一定差异:纯培养体系中乙醇产量于20 h达到峰值(0.87%)后进入稳定期,而共培养体系提前至16 h即达峰值(0.8%),且最大产量较纯培养降低0.7%。
图10 纯培养和共培养乙醇产量变化
Fig.10 Changes in ethanol yield during pure and co-cultivation of the strain at different time points
2.4.2.2 单菌培养与共培养醋酸菌乙酸产量
根据图11所示的乙酸代谢分析,纯培养醋酸菌A26与共培养体系Y7+A26在48 h内的乙酸合成呈现出一定差异,其乙酸代谢结果可分为以下3个阶段:A26在纯培养过程中,在初始20 h内乙酸产量快速上升,符合醋酸菌典型的好氧代谢特征[30]。然而,在共培养体系中,乙酸产生速率高于A26纯培养,可能是由于在初期阶段,Y7产生的乙醇被A26部分转化为乙酸[31],或者Y7在此阶段可能通过代谢副产物为A26提供额外的碳源[8],促进其乙酸合成,这一结果也验证了2.4.2.1节的推论。在培养20 h后,纯培养A26的乙酸产量达到峰值并趋于平衡,可能因pH逐渐下降从而抑制了其自身代谢活性。共培养体系中,16 h便达到峰值并趋于平衡,2种培养体系下其乙酸产量峰值大小并没有太大改变,只是达到峰值的时间发生改变。因此可以确定共培养只是加快了乙酸产生速率,使其乙酸产量提前达到峰值,并没有改变乙酸产量。
图11 纯培养和共培养乙酸产量变化
Fig.11 Changes in acetic acid yield during pure and co-cultivation of the strain at different time points
2.5 开菲尔粒与混菌生物膜的FT-IR分析
为从化学结构层面比较天然开菲尔粒与人工构建的混菌生物膜之间的相似性,采用FT-IR分析两者的二维结构。结果如图12所示,两者在4 000～1 000 cm-1范围内均显示出微生物胞外聚合物及生物大分子的典型吸收特征[32]。2 889 cm-1处的吸收峰归属于脂质及蛋白质侧链的C—H伸缩振动[33],而1 635 cm-1(酰胺Ⅰ带)和1 521 cm-1(酰胺Ⅱ带)是蛋白质肽键骨架的特征信号[34],这共同表明混菌生物膜与天然开菲尔粒均富含蛋白质与脂类物质,且蛋白质的二级结构极为相似。尤为重要的是,在3 268/3 183 cm-1及1 033/1 062 cm-1附近出现的强吸收峰,归属于EPS中O—H及C—O—C、C—O键的伸缩振动[33,35],是EPS的标志性特征,这2个峰表明了混菌培养产生了与天然开菲尔粒相似的EPS基质,两者之间具有相似性。本实验室前期研究采用了开菲尔粒中分离出的乳酸菌、酵母菌和醋酸菌各1株进行混合培养,将三菌混合培养所产生的生物膜与开菲尔粒进行二维结构的对比,同样发现两者主要组成相似。酵母菌为混菌中主要的生物膜产生菌,出现这种结果可能表明在开菲尔粒中,其胞外基质的组成结构主要为酵母菌所形成的。
a-混菌生物膜;b-开菲尔粒
图12 开菲尔粒与混菌生物膜红外光谱
Fig.12 Infrared spectrum of kefir grains and mixed-strain biofilm
综上所述,FT-IR分析从化学层面上证实,本研究构建的酵母菌-醋酸菌共培养体系所形成的生物膜,其主要化学组成(蛋白质、脂质、多糖)和结构框架与天然开菲尔粒高度相似,此实验结果为后续继续深入研究开菲尔粒的形成提供数据基础。
3 结论
本研究选择实验室前期从传统开菲尔粒中分离出的酵母菌与醋酸菌,通过构建共培养体系,深入探究了两者间的互作效应,并从生物膜形成、生理特性及化学结构等多角度进行了系统验证。本研究成功获得高性能菌株并筛选出最优共生组合,在共培养互作下酵母菌Y7利用其强表面特性初始定植,而醋酸菌A26则作为“强化者”被招募入生物膜框架中,且共培养为醋酸菌A26提供了更适宜的代谢环境。Y7与A26共培养形成的混菌生物膜与天然开菲尔粒具有高度相似性。本研究为完善开菲尔粒体系内菌株互作关系,解析开菲尔粒稳定机制提供一定的理论依据。需要指出的是,尽管本研究系统揭示了酵母菌Y7与醋酸菌A26之间显著的互利共生关系及其在构建生物膜结构中的关键作用,但仍存在一定的局限性。首先本研究仅探讨了酵母菌与醋酸菌的相互作用,未考虑开菲尔粒体系中乳酸菌对共培养体系的影响,其次本研究筛选的菌株组合有限,其结论的普适性有待在更广泛的菌株资源中进行验证。
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