超高压处理对方竹笋细胞壁物质模拟体系的影响

果胶作为细胞壁中影响质构特性的主要多糖,其组分构成及分子结构对果蔬质地具有重要影响。在细胞壁组成成分方面,已有研究指出纤维素结构变化与果实软化过程存在一定关联[1],然而多项不同果实的研究表明,纤维素解聚并非导致软化的关键因素[2];在果蔬软化过程主要与细胞壁中果胶多糖的降解密切相关,而非纤维素的变化[3]。

在超高压处理(ultra-high pressure,UHP)对果蔬制品影响研究中,姚佳等[4]研究发现,UHP相比热处理(thermal processing,TP)在黄桃罐头质地保持方面具有显著优势。经600 MPa处理20 min后,3种形状果块的硬度分别是热杀菌样品的2.8倍(条状)、3.1倍(丁状)和2.9倍(块状),能够更好地保持黄桃原有的质地且细胞结构完整性更好,汤汁黏度更低。YANG等[5]研究发现,UHP能更好地维持腌制苤蓝的硬度,与其保留更多螯合性果胶(chelate-soluble pectin,CSP)和降低果胶酯化度密切相关,而TP则导致水溶性果胶(water-soluble pectin,WSP)大幅增加和细胞壁结构破坏,进而引起质地劣变。然而,对于液态果蔬制品(如果汁),UHP通常会使果胶酯化度降低,不利于其品质与口感。低甲酯化度的CSP易与钙离子发生相互作用,促进凝胶形成,并与蛋白质结合,加速不溶性大颗粒的生成,最终在重力作用下沉积于容器底部,影响产品稳定性与感官品质[6]。

目前,关于UHP对完整果蔬制品中细胞壁物质影响的研究已有较多报道,但针对细胞壁材料本身在UHP条件下的响应机制相关的报道尚不多见。在UHP过程中,果胶等细胞壁组分的结构与功能不仅受高压处理影响,还受到体系内部pH、可溶性固形物、离子强度及蛋白质等内源因素的调控。因此,为排除果肉体系中复杂内源因素的干扰,本文建立了以果胶主要成分的细胞壁物质为模拟体系,系统分析其持水性、果胶含量、酯化度、分子质量分布及单糖组成等指标的变化,探究持水性与果胶降解、酯化度及结构改变之间的相关性,阐明UHP作用下果胶水解、脱酯及分子链断裂等变化机制,以期揭示超高压处理影响竹笋等果蔬质构特性的潜在机制,对深入研究UHP对细胞壁果胶各组分的影响具有较大的理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要原料

方竹笋,采自重庆市南川区金山镇。

1.2 仪器与设备

SHPP-2L超高压设备,山西力德福科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 模拟体系制备

将方竹笋经去壳、清洗后,进行烫漂处理。以烫漂后的竹笋为样品,按照参考YANG等[5]的方法并略作修改,制备细胞壁物质(alcohol insoluble residue,AIR)。

AIR的制备:取50 g竹笋样品,加入150 mL 体积分数95%乙醇进行匀浆处理,随后用等体积乙醇冲洗匀浆机。将混合液在100 ℃加热20 min,冷却后经G4砂芯漏斗过滤。所得不溶物依次用200 mL体积分数95%的沸腾乙醇、200 mL氯仿-甲醇混合液(体积比1∶>1)及适量丙酮溶液进行洗涤,直至获得白色粉末状固体,最后在35 ℃烘箱中干燥,即得AIR。

称取AIR 0.5 g,加水50 mL,装入PA/RCPP蒸煮复合袋中,真空密封,并用手轻轻挤压包装袋,使之混匀后,得到竹笋细胞壁物质模拟体系,并于24 h内进行UHP和TP处理。

1.3.2 UHP组和TP组

UHP组:将样品置于压力舱中,设置压力条件为500 MPa/20 min、600 MPa/20 min和600 MPa/5 min,以水为传压介质,初始温度约为20 ℃,处理时温度低于40 ℃。

TP组:将样品在100 ℃热水下处理20 min,后立即冷却至室温。

将以上处理后的模拟体系样品放置于室温下保存过程中无胀袋或胖听现象发生,符合商业无菌要求。

1.3.3 持水性的测定

参考VAN AUDENHOVE等[7]的方法并略作修改。称取0.1 g细胞壁物质,放入50 mL离心管之中,加入20 mL蒸馏水,将离心管放在室温过夜。后以10 000 r/min速度离心20 min。离心结束后,弃去上清液,称重。按照公式(1)计算持水性:

式中:X,持水性,g/g;m1,残留水合物质量,g;m2,干物质质量,g。

1.3.4 果胶各组分的分离

基于1.3.1节所述AIR提取方法,分别从TP和UHP处理后的模拟体系样品中提取AIR。

果胶组分的分离:每个处理组收集1 g AIR,使用100 mL 0.05 mol/L乙酸钠缓冲液(pH 6.5)在相应条件下提取4 h,获得WSP。剩余沉淀用100 mL 0.05 mol/L EDTA溶液(含0.1 mol/L NaAC,pH 6.5)于23 ℃提取6 h,得到CSP。再将EDTA不溶残渣用100 mL 0.05 mol/L Na2CO3(含20 mmol/L NaBH4)在4 ℃提取6 h,再于20 ℃继续提取3 h,获得碱溶性果胶(sodium carbonate soluble pectin,NSP)。将WSP、CSP、NSP三种提取液分别用去离子水透析24 h,期间换水3次。透析液经旋转蒸发浓缩后,加入4倍体积的体积分数95%乙醇沉淀,静置后离心,收集沉淀并经真空冷冻干燥50 h,最终于-20 ℃避光保存备用。

1.3.5 果胶含量的测定。

果胶含量测定采用咔唑比色法[8]:取1 mL果胶提取液,依次加入0.25 mL 0.15%咔唑-无水乙醇溶液(咔唑质量浓度为1.5 g/L,由0.15 g咔唑溶于100 mL无水乙醇配制)和6 mL浓硫酸,混匀后立即置于沸水浴中加热20 min,冷却后于暗处静置2 h。以空白试剂作为参比,在530 nm波长处测定吸光度。根据标曲测定所得方程y=0.011 3x+0.081 5(R2=0.990 1)计算半乳糖醛酸含量,结果以每克细胞壁干物质所含果胶的质量表示。

1.3.6 果胶酯化度的测定

果胶酯化度测定参考ARACHCHIGE等[9]的方法略作修改。分别精确称取50 mg AIR、WSP、CSP样品,溶于50 mL经去除CO2处理的去离子水中,待完全溶解后滴加酚酞指示剂2～4滴,采用0.05 mol/L NaOH标准溶液滴定至出现持续30 s不褪色,记录所消耗NaOH体积为V1。随后向体系中加入20 mL 0.5 mol/L NaOH标准溶液,皂化反应30 min后,用20 mL 0.5 mol/L HCl进行中和,再次加入酚酞指示剂2～4滴,继续以0.05 mol/L NaOH滴定至终点,记录第2次消耗的NaOH体积为V2。酯化度按如下公式(2)计算:

1.3.7 细胞壁物质FTIR的测定

将干燥好的细胞壁物质磨成粉末后,用傅里叶红外光谱仪以4 cm-1的速率在4 000～600 cm-1波长范围内扫描并收集谱峰[10]。

1.3.8 果胶分子质量的测定

选取经500 MPa/20 min处理和TP的样品,利用高效体积排阻色谱法(high performance size exclusion chromatography, HPSEC)分析其中果胶组分的相对分子质量。将冻干果胶样品溶解并配制成浓度为2 mg/mL的溶液,经0.22 μm微孔滤膜过滤后进样分析。色谱条件如下:采用Shodex SR-805 HQ色谱柱,以0.01 mol/L NaNO3溶液作为流动相,流速设定为0.7 mL/min,柱温维持35 ℃;进样体积为20 μL,待基线稳定后进行测定[11]。

1.3.9 果胶单糖含量的测定

选取500 MPa/20 min处理和TP样品,采用PMP柱前衍生化高效液相色谱法对果胶单糖组成进行分析。

半乳糖醛酸含量测定:

果胶含量的测定基于1.3.5节中果胶含量测定方法。

中性糖(包括甘露糖、葡萄糖等)含量的测定参考周彦强等[12]的PMP柱前衍生化高效液相色谱法,部分内容略作修改,具体如下:

a)样品水解:准确称取10.0 mg果胶样品置于厌氧管中,加入2 mL 4 mol/L三氟乙酸,充氮气密封后,于110 ℃烘箱中水解2 h。冷却后加入适量甲醇并真空干燥,重复该步骤3次以彻底去除三氟乙酸。残留物用5.0 mL水复溶,混匀,得到浓度为2.0 mg/mL水解液。

b)衍生化处理:取500 μL混合单糖标准溶液或样品水解液于10 mL离心管中,加入500 μL 0.3 mol/L NaOH溶液混匀,再加入500 μL 0.5 mol/L PMP-甲醇溶液,涡旋混匀后于70 ℃反应100 min。冷却后加入500 μL 0.3 mol/L HCl中和,随后加入1.5 mL氯仿萃取,静置后弃去氯仿层,重复萃取3次。最终水相经0.22 μm滤膜过滤后用于HPLC分析。

c)色谱条件:采用SHIMADZU-C18色谱柱,以0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.85)-乙腈(82∶>18,体积比)为流动相,在250 nm波长下进行检测。流速为1 mL/min,柱温25 ℃,进样量10 μL,采用等度洗脱模式。

1.4 数据统计与分析

实验设置3个平行,采用Excel处理数据,结果以“平均值±标准差”来表示。采用Origin 2021软件作图,SPSS 27.0软件进行单因素方差分析,通过Duncan检验进行显著性分析,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 UHP对AIR模拟体系持水性的影响

持水性是细胞壁物质的关键特性之一,指其在无外力条件下能够吸收并保持水分的最大能力[13]。该性质与细胞壁网络结构的完整性密切相关,结构破坏往往导致持水性下降,因此也可间接反映细胞壁对果肉组织细胞的支撑能力。由图1可知,UHP会引起细胞壁物质持水性呈现不同程度降低。在500 MPa/20 min条件下,持水性下降4.47%;当压力升至600 MPa(保持20 min)时,持水性下降增至7.82%,表明较高压力对细胞壁结构破坏更为明显。而同等压力下600 MPa/5 min处理组持水性降幅最大为16.75%,且显著低于其他UHP组,短时间UHP对持水性的影响较压力更为突出,这可能是由于细胞壁上的纳米孔存在一个临界压力,当外界压力(如600 MPa)瞬间施加并超过该临界值时,细胞膜会通过纳米孔迅速膨胀,导致不可逆的结构破坏,这种“冲击式”破坏在短时间5 min内达到最大效应,而更长的处理时间20 min可能让细胞壁有一定时间进行应力松弛,反而减轻了瞬间破坏的程度[14]。相比之下,TP组持水性下降29.61%,更是显著低于所有UHP组。UHP和TP后均会引起果胶降解和流失,导致细胞壁多孔结构塌陷、完整性下降,削弱其与水结合的能力,从而使持水性降低[15],且这种降解效果TP组显著高于UHP组。

2.2 UHP对AIR模拟体系果胶含量的影响

UHP与TP后各果胶组分含量变化如图2所示。与对照相比,UHP使WSP含量上升:500 MPa/20 min、600 MPa/20 min 和 600 MPa/5 min 处理组分别提高3.82%、8.22%和10.55%,且500 MPa/20 min处理组的WSP含量低于其余2组高压处理;而TP组WSP含量更是显著高于各处理组,增幅达100.24%,这可能是由于高温促使果胶发生热溶解、β-消除反应及解聚所致[11]。UHP后CSP含量显著降低,而NSP含量显著上升,说明CSP可能部分转化为NSP,该变化趋势与果肉体系中的结果一致[16];而TP则同时降低了CSP和NSP的含量,降幅分别为27.24%和21.18%。综上,UHP组的WSP含量低于TP组,但CSP和NSP含量更高。较高的WSP含量通常伴随质地劣变,而CSP和NSP则有助于维持细胞壁结构完整性[17]。因此,UHP能够更好地保留AIR的持水性,这可能与其NSP含量高的组成特征密切相关。

2.3 UHP对AIR模拟体系果胶酯化度的影响

酯化度是表征果胶特性的关键指标之一。AIR模拟体系在经过UHP及TP后酯化度的变化情况如图3所示。经UHP和TP后,各处理组AIR酯化度均较对照组下降。在500 MPa压力下处理20 min后,AIR酯化度下降32.57%;而当压力升至600 MPa并保持20 min时,酯化度进一步下降约35.94%,表明压力升高可促进AIR酯化度降低。600 MPa/5 min处理组的酯化度下降幅度为29.30%。显著性分析结果表明,600 MPa/5 min处理组酯化度下降幅度显著低于600 MPa/20 min处理组,表明在相同压力下延长保压时间会进一步降低酯化度。上述结果说明,UHP可能对细胞壁物质中的果胶产生了脱酯作用,其原因可能是高压促使甲酯键断裂,进而引起果胶酯化度下降[18-19]。TP组 AIR模拟体系的酯化度较对照组下降26.86%,降幅明显低于超UHP组。TP组的AIR酯化度约为UHP组1.1～1.3倍,该趋势与TIAN等[20]的研究结果一致。

2.3.2 WSP、CSP酯化度

经UHP和TP后,AIR模拟体系中WSP和CSP酯化度的变化如图4所示(NSP因提取过程中发生皂化反应未测定)。对照组中WSP和CSP的酯化度分别为43.52%和21.94%;各处理均会引起2种果胶酯化度下降,且下降幅度随压力增大或保压时间延长而增加。在500 MPa/20 min处理时,WSP和CSP酯化度分别下降22.31%和46.11%,压力升至600 MPa并保持20 min后,降幅增至27.96%和48.85%;而当压力为600 MPa、时间缩短至5 min时,酯化度下降幅度减至23.79%和43.99%,表明在相同压力下延长保压时间会进一步降低两者的酯化度。由此可见,压力越高、保压时间越长,果胶酯化度越低。而TP组WSP和CSP酯化度分别下降16.25%和26.86%,主要因高温引发的β-消除反应所致[21];且TP组酯化度整体上显著高于UHP组,这与前述AIR酯化度的变化规律相符。

2.4 UHP对AIR模拟体系AIR结构的影响

UHP和TP后AIR模拟体系AIR的FTIR结果如图5所示。各处理组的谱图形状未见显著差异,说明不同处理方式未明显改变AIR的官能团组成。在果胶的红外光谱中,3 600～3 000 cm-1的宽峰归属于O—H 伸缩振动;2 923 cm-1为C—H伸缩振动;1 732 cm-1和1 641 cm-1的吸收峰分别对应羧酸/酯和自由羧基的C

O伸缩振动;1 021 cm-1附近的吸收则与糖类的C—O振动有关。其中还值得关注的是1 641 cm-1和1 732 cm-1的特征峰是鉴别果胶类型(高酯或低酯)的关键依据[22]。由谱图可见,经UHP后,AIR在3 311 cm-1波长附近的吸收峰增强,这可能是高压作用下细胞壁多糖进一步伸展或果胶内基团重新排布,导致更多的O—H基团暴露。经UHP后2 923 cm-1波长附近的吸收峰比TP组稍强,这是由于压力导致多糖长链断裂,更多的—CH2、—CH3基团暴露所致[20]。经UHP及TP后,AIR在1 641 cm-1处的吸收峰增强,而1 732 cm-1处的吸收峰减弱,表明其酯化度呈下降趋势。与UHP相比,TP组在1 641 cm-1处的吸收峰明显更弱,1 732 cm-1处则相对更强,说明TP后AIR具有更高的酯化度[23]。不同条件的UHP后AIR在1 641 cm-1和1 732 cm-1处吸收峰强度无显著性差异。此外可以看出786 cm-1波长附近存在较弱吸收峰,表明AIR果胶单糖中有甘露糖的存在[24]。

2.5 UHP对AIT模拟体系果胶分子质量的影响

UHP和TP对细胞壁物质模拟体系果胶相对分子质量影响如表1所示。经UHP后,WSP、CSP、NSP的相对分子质量较对照组分别下降44.43%、8.73%、16.95%,该变化主要源于高压诱导的果胶主链及侧链解聚,其中羧基C—O键在机械压力作用下的断裂是导致分子质量降低的重要因素[25-26]。TP后,3种果胶的相对分子质量均呈下降趋势,且降幅显著高于UHP;与对照相比,TP组WSP、CSP、NSP的相对分子质量分别下降71.71%、33.26%、66.64%;UHP后的WSP、CSP、NSP相对分子质量分别是TP后的1.96倍、1.37倍、2.48倍。综上,2种处理后果胶分子质量都下降,归因于在高温、高压作用下果胶分子间糖苷键、以及羧基上的C—O键部分断裂,导致分子链变短,但相比UHP,TP的破坏作用更明显,这也从分子层面解释了UHP在保持果胶结构特性方面具有一定优势。

2.6 UHP处理对AIR模拟体系果胶单糖含量的影响

UHP及TP对AIR三种果胶中性糖组成的影响如表2所示,在3种果胶中同样检测到8种单糖组成,分别为半乳糖醛酸(galacturonic acid,GalA)、鼠李糖(rhamnose,Rha)、阿拉伯糖(arabinose,Ara)、半乳糖(galactose,Gal)、葡萄糖(glucose,Glu)、甘露糖(mannose,Man)、岩藻糖(fucose,Fuc)和木糖(xylose,Xyl),其中以GalA含量最高,其次为Ara、Gal和Rha。经UHP与TP后,多数中性糖含量均有所降低。与对照组相比,UHP组WSP、CSP、NSP的总中性糖含量分别下降8.82%、15.78%和16.53%;而TP组则分别下降22.48%、30.02%和38.86%。由Rha/GalA值可以看出,该模拟体系果胶组分均以RG-I结构为主。Rha含量的变化可以反映出果胶RG-Ⅰ结构主链的降解程度,Rha含量越低,果胶主链解聚程度越大。UHP后CSP中Rha含量变化较小,相比于对照下降了2.59%,WSP、NSP中Rha含量与对照组相比分别下降了5.61%、6.25%。经TP后,WSP、CSP、NSP均发生降解,Rha含量分别显著下降了17.40%、10.93%、15.68%。

Ara/Gal和(Gal+Ara)/Rha代表果胶RG-Ⅰ结构侧链的降解程度,Ara/Gal和(Gal+Ara)/Rha的比例越小,侧链的降解程度越大,反之亦然。经UHP后WSP、CSP、NSP的Ara/Gal值分别下降3.41%、6.08%、11.66%,(Gal+Ara)/Rha值分别下降了6.48%、15.67%、6.19%,说明高压会诱导果胶侧链发生部分降解。经TP后WSP、CSP、NSP的Ara/Gal值分别下降了11.50%、28.92%、18.39%,(Gal+Ara)/Rha值分别下降了14.86%、27.81%、17.71%。表明TP对侧链的降解作用更强,这是由于高温条件下果胶发生了β-消除反应,果胶侧链糖苷键水解所致[26],进而破坏细胞壁结构的稳定性;而相较于TP中常见的β-消除反应,UHP对果胶侧链的降解作用较为温和,对糖苷键的直接破坏较少,因此更有利于保持细胞壁结构的稳定性,进而能保持竹笋等果蔬原有质构。

2.7 UHP对竹笋质地的影响机理

基于上述实验结果,UHP通过以下途径作用于AIR(热烫已钝化内源酶排除酶影响):UHP促使果胶组分发生转化与重组,特别是促进NSP向CSP的转变,有助于维持细胞壁结构的稳定性。同时,高压显著降低果胶酯化度,且压力越高、时间越长,脱酯作用越强,这可能增强果胶分子间的离子交联,支撑细胞壁网络[27]。此外,高压引起果胶分子质量适度下降及侧链部分降解,但程度明显低于TP,因而对细胞壁整体骨架破坏较小。这些变化可能影响果胶与纤维素、半纤维素等其他壁组分的相互作用,导致细胞壁结构发生可控松弛。此外,UHP通过静水压与机械应力协同作用,引致果胶多糖主链及侧链发生局部断裂与降解,分子构象发生舒展与重排,进而削弱了果胶与细胞壁中其他大分子(如纤维素、半纤维素)之间的结合能力,最终导致细胞壁网络结构发生可控性松弛。在组织层面,AIR的结构稳定性得以保持,持水性下降较少,有利于维持细胞膨压和组织紧实度。果胶的适度转化与降解也减少了细胞间黏附力的损失,从而整体保持竹笋的质地特性。因此,UHP通过调控AIR的结构与组成,从而实现对竹笋质构的保持。

3 结论

通过构建以果胶为主的AIR模拟体系,系统比较了UHP与TP对方竹笋AIR结构及果胶组分的影响;相较于TP,UHP能更有效地维持细胞壁体系的持水能力,且显著降低对于果胶结构损伤,从而维持细胞壁网络结构完整性,有助于竹笋等果蔬质地特性保留。同时本研究从分子机制层面揭示了超高压技术在维持果蔬质构方面的显著优势,为其作为一种高效的非热加工技术应用于竹笋及其他相关果蔬品质调控提供了理论依据,且在清洁标签食品与功能性配料领域具有重要的应用价值。

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