在食品体系中,食品组分如脂肪、淀粉、非淀粉多糖、多酚类物质等能通过非共价/共价相互作用与蛋白质形成复合物,来诱导蛋白质分子的构象发生变化,从而影响其功能性质。相对于其他食品组分,多酚类化合物具有抗氧化、抑菌、抗癌、增加抵抗力等生物活性功能[1]。利用多酚类物质与蛋白质的相互作用不仅可以调控蛋白质的功能性质还能赋予蛋白质一些生物活性,具有很好的应用前景,已成为功能性蛋白领域的一个研究热点。多酚可通过氢键、离子键、疏水相互作用等方式与蛋白质结合。例如,多酚中的羟基能与蛋白质中的羰基(C
O)、羟基(—OH)或氨基(—NH2)之间形成氢键,多酚中的非极性芳香环可以与蛋白质中的疏水性氨基酸残基形成疏水相互作用,多酚中带电荷的基团也能与蛋白质表面带相反电荷的基团以离子键结合。DAI等[2]研究发现儿茶素能通过疏水相互作用和氢键与大豆蛋白结合,使大豆蛋白的结构变得松散和无序,二级结构中α-螺旋和β-折叠向β-转角和无规则卷曲转变。YU等[3]的研究结果表明,绿原酸与大麻籽蛋白结合后,使蛋白质结构展开,增加了芳香族残基的暴露,从而提高了蛋白质在油水界面的亲和力,使得乳化活性增强。陈骐等[4]研究了黑米花青素对大豆11S/7S蛋白结构及界面功能特性的影响,结果表明花青素能促进蛋白结构的舒展,有利于蛋白在油水界面形成稳定且具有一定黏弹性的界面薄膜,乳化性能得到改善。可见,多酚与蛋白质结合后能诱导其构象发生变化,进而影响其功能性质。因此,更好地理解多酚与蛋白质之间的相互作用对于设计和开发功能性蛋白质产品至关重要。
大豆蛋白是少数含有全部9种人体必需氨基酸的植物蛋白,其氨基酸比例在植物蛋白中最接近动物蛋白。大豆蛋白的主要成分是β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin,7S)和大豆球蛋白(glycinin,11S),占大豆蛋白总量的70%[5]。其中,11S是一个六聚体,由5个亚基组成,每个亚基由酸性和碱性多肽通过二硫键连接。7S是一种糖蛋白,具有三聚体的分子结构,由3个亚基组成[6]。关于大豆蛋白与多酚的相互作用已有很多报道,但是大多集中于多酚与大豆分离蛋白的相互作用研究,而对于主要成分11S和7S与多酚的相互作用则少见报道。11S和7S在分子结构、多聚体组成和分子质量方面都存在很大差异,这些差异会影响多酚与它们的相互作用,从而影响其功能性质。因此,比较11S和7S与多酚相互作用的差异,对揭示多酚对大豆蛋白结构与功能性质的影响机制十分必要。
此外,多酚类化合物的分子结构特征,如羟基化程度、甲基化的差异,是调控其与蛋白质相互作用的关键因素。如LIU等[7]研究了表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)、绿原酸、白藜芦醇和阿魏酸与小麦胚芽蛋白之间的相互作用,小麦胚芽蛋白与EGCG之间的主要相互作用力是氢键和范德华力,与绿原酸之间的是静电相互作用,而与白藜芦醇和阿魏酸之间则是疏水相互作用。PAN等[8]在研究绿原酸、槲皮素、芸香苷和EGCG这4种多酚与牛骨蛋白的相互作用时,发现EGCG由于含有8个酚羟基和2个苯环,表现出与牛骨蛋白最高的结合率,大大增强了牛骨蛋白的抗氧化活性。可见,多酚的分子质量和酚羟基数量的不同对多酚与蛋白的结合力也不同,对蛋白质功能性质的改善效果也有所差异。单宁酸(tannic acid,TA)的分子式为C76H52O46,它属于水解单宁,由没食子酸酯或含糖基的鞣酸及其衍生物组成,含有25个酚羟基;EGCG的分子式为C22H18O11,属于儿茶素类黄酮化合物,含有8个酚羟基;没食子酸(gallic acid,GA)的分子式为C7H6O5,由一个苯环和一个羧基组成,苯环上连接有3个酚羟基组成。这3种多酚在分子结构、分子质量和酚羟基数方面存在很大差异,但是关于它们与大豆蛋白相互作用模式的差异以及内在规律的研究很少。
基于此,本文研究大豆蛋白的2种主要组分(11S /7S)与3种不同结构多酚(TA、EGCG和GA)在中性pH值下的分子结合机制。首先通过紫外-可见光谱、荧光光谱、红外光谱和等温滴定量热研究11S/7S与不同多酚的相互作用,再通过圆二色光谱分析这3种多酚引起的11S/7S二级结构的变化,然后评估3种多酚对11S/7S抗氧化性活性和乳化性的影响,探讨多酚-大豆蛋白相互作用与调控功能性质之间的关联,为功能性蛋白质产品的开发提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
低温脱脂豆粉,山东温记食品有限公司;GA(纯度>99%)、TA(纯度>95%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;EGCG(纯度>98%),西安天广源生物科技有限公司;8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS,分析纯),上海源叶生物科技有限公司;大豆油,益海嘉里食品营销有限公司;其他常用试剂均为分析纯;实验室所用实验用水均为去离子水。
1.2 仪器与设备
SCIENTZ-12 N/A冷冻干燥机,宁波新芝冻干设备有限公司;JXN-26XPI高速冷冻离心机,上海安亭科学仪器厂制造;UV-2600紫外分光光度计,岛津仪器(苏州)有限公司;G9800A荧光分光光度计,安捷伦科技(中国)有限公司;NANO-TA等温滴定量热仪,美国沃特世科技有限公司;T25DS25高速均质机,德国IKA公司;Chirascan圆二分光偏振仪,英国应用光物理公司;傅里叶变换红外光谱仪,布鲁克(北京)科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 大豆11S/7S蛋白的制备
参考YANG等[9]的方法并作修改,将脱脂大豆粉按1∶>15的料液比(g∶>mL)称取,加水混合,调节pH值至8.0,放置于恒温磁力搅拌器中恒温磁力搅拌1 h,在4 ℃和9 000×g条件下离心10 min。向上清液中加入浓度为0.01 mol/L的NaHSO3,搅拌均匀后调节pH值至6.4,放置冰箱冷沉过夜。然后在4 ℃以及6 500×g条件下离心10 min,所得的沉淀为大豆11S蛋白,透析脱盐后调pH值至7.0,冷冻干燥保存备用。通过双缩脲法测得样品中蛋白质含量为(87.93±1.29)%。
在剩余的上清液中加入浓度为0.01 mol/L的CaCl2,将pH值调至5.0,放入45 ℃的恒温水浴锅中恒温水浴30 min,再调节pH值回调至5.5,在4 ℃、9 000×g条件下离心10 min,得沉淀为中间组分。向上清液中加入等体积的水,在室温下静置30 min,在4 ℃、6 500×g条件下离心10 min,取上清液,调节pH值至4.8,静置1 h 后,在4 ℃、6 500×g条件下离心10 min,得沉淀为7S,透析脱盐后调pH值至7.0,冷冻干燥保存备用。通过双缩脲法测得样品中蛋白质含量为(97.56±1.71)%。
1.3.2 大豆11S/7S与多酚复合物的制备
将大豆11S/7S以及TA、EGCG、GA充分溶解,控制其质量浓度为10 mg/mL,TA、EGCG、GA的摩尔浓度为5 mmol/L,混合后溶液pH值为7.0,搅拌使其充分溶解。纯蛋白溶液作为对照,置于恒温磁力搅拌器中搅拌1 h使其充分反应。然后在25 ℃、10 000×g条件下离心30 min,弃去沉淀,收集上清液用截留分子质量为3 500 Da的透析袋在去离子水环境下透析,每2 h换一次水,除去游离的多酚。将透析好的多酚与11S/7S的复合物放于4 ℃冰箱中冷藏备用。
1.3.3 紫外-可见光吸收光谱测定
参考刘金杰等[10]的方法并做修改,将大豆11S/7S蛋白-多酚复合物用去离子水稀释至蛋白质量浓度为0.125 mg/mL,在200～400 nm波长下扫描光谱曲线。
1.3.4 傅里叶变换红外光谱测定
参照黄国等[5]的方法并作修改。将11S/7S蛋白-多酚复合物样品冷冻干燥后与KBr按1∶>100的质量比混合,然后在压片机上压成薄片,进行红外光谱测量。测量波数为4 000～400 cm-1。扫描次数32次,分辨率为4 cm-1。
1.3.5 内源荧光光谱测定
根据CHEN等[11]的研究方法,略有修改。用去离子水配制质量浓度为0.5 mg/mL的11S/7S蛋白溶液,分别添加TA、EGCG和GA至其终浓度在12.5、25、50、100 μmol/L,然后在激发和发射狭缝宽均为5 nm、激发波长为290 nm、发射波长为300～450 nm条件下进行荧光光谱扫描。用下述Stern-Volmer公式(1)计算猝灭速率常数,用公式(2)计算猝灭率:
(1)
(2)
式中:F0,不添加多酚的大豆7S/11S蛋白的荧光强度;F,添加多酚的大豆7S/11S蛋白的荧光强度;[Q],不同多酚的浓度,mmol/L;Ksv,动态猝灭常数,L/mol;Kq,猝灭速率常数,L/(mol·s);τ0,不添加猝灭剂时荧光分子的平均寿命,10-8 s;QE,猝灭率。
1.3.6 等温滴定量热
参考周思多[12]的实验方法,用去离子水配制质量浓度为10 mg/mL的11S/7S蛋白溶液,在25 ℃、10 000×g条件下离心30 min,取上清液,脱气15 min。用pH值为7.0的磷酸盐缓冲液配制浓度为5 mmol/L的EGCG、TA和GA溶液,脱气15 min。将11S/7S蛋白溶液放入量热仪的样品池中,将多酚(TA、EGCG、GA)溶液放入进样注射器中,设定滴定次数为20次,搅拌速率为250 r/min,反应温度为25 ℃,滴定2 h。在相同条件下,以pH值7.0磷酸盐缓冲液作为滴定剂对去离子水进行同等次数的滴定,进行溶剂对照实验,用于数据校正,采用软件Launch NanoAnalyze进行数据处理并计算蛋白与多酚结合时热力学参数。
1.3.7 圆二色光谱测定
将11S/7S蛋白与多酚的复合物用去离子水稀释至蛋白质量浓度为0.2 mg/mL,在190～260 nm、扫描速度为100 nm/min、宽带为1.0 nm、响应时间为0.25 s和灵敏度为20 mdeg的条件下用圆二色光谱仪扫描光谱曲线。再用CD Pro软件进行圆二色光谱的数据分析并计算蛋白质二级结构的相对含量。
1.3.8 表面疏水性测定
参考HUANG等[13]的方法,使用ANS作为荧光探针来测定11S/7S与多酚(TA、EGCG和GA)复合物的表面疏水性。将11S/7S-多酚复合物用0.2 mol/L、pH值7.0的磷酸盐缓冲液稀释至蛋白的质量浓度为0.05～2.00 mg/mL。然后,取4 mL稀释后的样品溶液与20 μL、8 mmol/L的ANS溶液混合,进行荧光强度测定。实验参数设置如下:激发波长为390 nm,发射波长为470 nm,激发和发射狭缝宽均为5 nm。将测得的荧光强度与蛋白浓度作函数图,所得斜率即为表面疏水性。
1.3.9 抗氧化
1.3.9.1 ABTS阳离子自由基清除能力的测定
参考金花等[14]实验方法,称取0.192 g ABTS和0.033 1 g K2S2O8溶于50 mL的磷酸盐缓冲液中,等体积混合后避光放置12 h。稀释大豆7S/11S蛋白与多酚的复合物至质量浓度为0.1 mg/mL,取0.5 mL样液与4.5 mL ABTS溶液混合均匀,室温避光反应18 min,在734 nm波长处测定吸光度为A1;取0.5 mL样液与4.5 mL磷酸盐缓冲液混合均匀,室温下避光反应18 min,测定其吸光度为A2;取4.5 mL ABTS与0.5 mL磷酸盐缓冲液混合均匀后,测定其吸光度为A0。由公式(3)计算ABTS阳离子自由基清除能力:
ABTS阳离子自由基清除能力
(3)
1.3.9.2 DPPH自由基清除能力的测定
参考金花等[14]的实验方法,将大豆7S/11S蛋白与多酚的复合物稀释至蛋白溶液质量浓度为0.1 mg/mL;称取3.45 g DPPH,溶于50 mL无水乙醇。取1 mL样品与2 mL DPPH-乙醇,避光反应1 h,在517 nm波长处测定吸光度为A1;取1 mL样品与2 mL乙醇溶液混合均匀后避光反应1 h,在517 nm波长处测定吸光度为A2;取1 mL乙醇与2 mL DPPH-乙醇溶液混合均匀后避光反应1 h,在517 nm波长处测定为吸光度为A0。DPPH自由基清除率按公式(4)计算:
DPPH自由基清除能力
(4)
1.3.9.3 铁离子还原能力的测定
参考金花等[14]的实验方法,将0.3 mL大豆7S/11S蛋白与多酚的复合物(蛋白质量浓度为10 mg/mL)和3 mL 磷酸盐缓冲液(pH 7.0,0.2 mol/L)、3 mL K3[Fe(CN)6] (质量分数1%)混合,放于50 ℃的恒温水浴锅中水浴反应30 min后冷却至室温。加入3 mL的三氯乙酸溶液(质量分数为10%),混合均匀后避光静置30 min。在5 000 r/min条件下离心10 min,取上清液2.5 mL和0.5 mL FeCl3溶液(1 mg/mL)、3 mL去离子水混合均匀,避光反应10 min,在700 nm波长处测定其吸光度。
1.3.10 乳化性测定
参考PAN等[8]的方法,取16 mL 11S /7S-多酚复合物(蛋白质质量浓度为10 mg/mL)与4 mL大豆油混合于50 mL的离心管中,用剪切均质机在10 000 r/min剪切均质60 s,分别在0 min和10 min时于管底处取50 μL乳液加入到5 mL的质量浓度为0.1%的SDS溶液中,充分混匀后,用紫外-可见分光光度计在500 nm波长处测量其吸光度。乳化活性指数按公式(5)计算,乳化稳定性指数按公式(6)计算:
乳化活性指数
(5)
式中:A0,0 min的吸光度值;DF,稀释倍数100;C,蛋白的质量浓度,0.01 g/mL;θ,油的体积分数,0.2。
乳化稳定指数
(6)
式中:A10,10 min的吸光值;Δt,0～10 min的时间差,10 min。
1.4 统计分析
实验中图表所示的数据均为3次以上重复实验所得,数据以“平均值±标准差”的形式来表示,使用软件SPSS 27.0进行统计分析,用ANOVA中的邓肯检验计算数据间的差异显著性,P<0.05 表示差异显著,并使用Origin 2021进行绘图。
2 结果与分析
2.1 紫外-可见吸收光谱分析
蛋白质本身在紫外区有吸收,主要来源于其芳香族氨基酸残基:色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸,280 nm为色氨酸和酪氨酸的双键吸收峰,而257 nm附近为苯丙氨酸的吸收峰[15]。当多酚与蛋白结合后会使得蛋白的构象发生一些变化,引起发色基团微环境的变化,进而引起蛋白质吸收强度的变化和最大吸收峰的位移。所有样品的紫外-可见吸收光谱的图谱如图1所示。7S蛋白、11S蛋白及其多酚复合物的吸收特性存在显著差异。纯蛋白的最大吸收峰位于280 nm附近,与多酚形成复合物后,吸收强度增加,最大吸收峰也出现偏移,这可能是多酚与蛋白的结合使蛋白质构象发生改变,原本包埋在蛋白质内部的芳香族氨基酸残基暴露出来,使最大吸收峰发生偏移,这证实了这3种多酚与11S/7S之间发生了相互作用。刘金杰等[10]通过研究11S/7S与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside,C3G)相互作用也表明了加入C3G后紫外光谱发生了偏移,C3G改变了蛋白质氨基酸残基的微环境。由图1还可看出,11S/7S-TA复合物吸收强度增加的最多且最大吸收峰位移也最明显,这可能是因为TA与EGCG和GA相比,酚羟基数更多、分子结构也更为复杂,与11S/7S结合后,使其构象变得更为松散,更多的发光氨基酸残基暴露出来。XU等[16]研究β-乳球蛋白与3种多酚(茶黄素/绿原酸/矢车菊素-3-O-葡萄糖苷)结合时,发现3种多酚的结构不同对于蛋白紫外-可见吸收光谱的影响也不尽相同,茶黄素由于拥有最多的酚羟基,使β-乳球蛋白的紫外-可见吸收光谱变化最明显。
a-7S-多酚复合物紫外光谱图;b-11S-多酚复合物紫外光谱图
图1 11S/7S-多酚复合物紫外-可见光谱图
Fig.1 UV spectra of 11S/7S-polyphenol complexes
2.2 傅里叶变换红外光谱分析
分子可以选择性地吸收特定波长的红外线,从而引起分子中振动和转动能级的跃迁,因此采用红外光谱法来测量复合物中官能团以及化学键的组成。红外光谱分析蛋白及其复合物结构的核心在于分析蛋白质特征峰的变化,也就是酰胺带的变化。酰胺Ⅰ带1 600～1 700 cm-1,主要来源于蛋白质主链羰基。酰胺Ⅱ带1 480～1 580 cm-1,主要来源于N—H面内弯曲振动和C—N伸缩振动。酰胺A带3 300 cm-1附近,代表分子间的氢键以及O—H和N—H的拉伸振动;酰胺B带2 960 cm-1附近,代表蛋白质的C—H拉伸振动[17]。
如图2所示,加入3种多酚(TA、EGCG、GA)后,11S/7S蛋白的酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带吸收峰的位置发生了一定程度的偏移,可能是多酚中的酚羟基与蛋白质的CO、C—N和N—H基团结合,导致原有氢键断裂。黄国等[5]在研究7S/11S与EGCG的结合中也发现加入EGCG后7S/11S的酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带吸收峰均发生变化,表明了大豆蛋白通过CO、C—N和N—H与EGCG结合。由图2还可知,酰胺A带和B带的吸收峰也发生了偏移,这说明多酚与11S/7S之间可能通过氢键和疏水相互作用结合。这归因于多酚的酚羟基等与蛋白侧链的CO基团或C—N基团发生相互作用形成氢键,多酚的苯环和碳链等与蛋白的疏水性氨基酸残基发生疏水相互作用。WEI等[18]研究花色苷与β-酪蛋白相互作用机理时也发现多酚的苯环、羟基与β-酪蛋白中疏水性氨基残基、CO基团、C—N基团通过疏水相互作用、氢键结合形成复合物,导致蛋白质的构象变化,红外光谱中酰胺A带和B带吸收峰发生明显偏移。
图2 11S/7S-多酚复合物红外光谱图
Fig.2 Infrared spectra of 11S/7S-polyphenol complexes
2.3 荧光光谱分析
荧光光谱分析蛋白与多酚非共价结合,基于蛋白质内源荧光基团在结合发生时所处的微环境变化。将不同浓度下的多酚荧光强度与纯蛋白荧光强度的比值F0/F对多酚浓度作图,以多酚浓度为横坐标,F0/F为纵坐标,可通过其线性关系和斜率Ksv来判断其是由碰撞主导的动态猝灭还是由非发光基态复合物形成的静态猝灭。猝灭速率常数Kq均大于最大扩散碰撞猝灭常数2×1010 L/(M·s),故3种多酚对11S/7S的荧光猝灭不是由于动态碰撞引起的,而是因为形成了复合物引起的静态猝灭。根据公式(2)计算出当3种多酚添加量都在100 μmol/L时,11S与TA、EGCG和GA结合时猝灭率分别为:93.9%、58.3%、36.3%;7S与TA,EGCG和GA结合时猝灭率分别为:97.9%、59.3%、46.5%。这说明TA与11S/7S蛋白的相互作用最强,EGCG次之,GA最弱。11S/7S蛋白于3种多酚荧光强度图见电子版增强出版附图1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044530,下同)。
由附图1可以看出,多酚的添加使11S/7S的最大吸收峰发生了红移现象,这是由于多酚与11S/7S结合后,使蛋白质的结构变得松散,原本埋藏在蛋白质内部的色氨酸残基更多地暴露到蛋白质表面的水溶液中,或者结合位点本身引入了更多极性基团,使得色氨酸所处的局部微环境变得更加亲水。CHEN等[11]的研究也表明了茶多酚与大豆蛋白结合后诱导了蛋白的构象变化,导致色氨酸残基暴露于更亲水的环境中,最大吸收峰红移。
2.4 热力学参数分析
等温滴定量热(isothermal titration calorimetry,ITC)是研究蛋白质-多酚相互作用的技术之一,其无标记、在溶液中直接测量、一次性获得完整热力学参数的核心优势,使其在理解结合强度、化学计量、特别是结合驱动力和机制方面具有重要地位。11S/7S与3种多酚的等温图见附图2。由附图2看出,11S/7S与3种多酚的结合是明显的放热反应,具有明显的放热峰,随着多酚的不断加入,放热量逐渐减少,结合附图2中滴数-Q(热量)图可以看出随着多酚滴数的增加,释放的热量逐步趋于0,这表明11S/7S与多酚的结合过程逐渐减少,结合位点逐渐饱和。使用软件模拟计算,分别得出3种多酚与11S/7S结合时热力学参数,如附图2所示。
研究发现7S/11S与多酚反应的ΔG<0、ΔH<0,表明蛋白与多酚的结合反应是自发进行的放热反应。11S-EGCG与11S-GA的ΔH<0,ΔS>0,这表明了结合是焓驱动与熵驱动的协同过程,疏水作用和范德华力是主导作用力[19]。7S-TA、7S-EGCG、7S-GA以及11-TA的ΔH<0,ΔS<0,表明其为焓驱动主导的过程,氢键和静电作用为主导作用力[20]。
由附图2可以看出,3种多酚与7S的结合位点数(n)不同,其中7S-TA的结合位点数为8.6,7S-EGCG的结合位点数为6.7,而7S- GA的结合位点数仅为5,这可能与多酚的酚羟基数量有关,TA具有最多的酚羟基数量,GA的酚羟基数较少,从上面的分析可知,3种多酚与7S之间主要是靠氢键和静电相互作用结合,酚羟基数多有利于氢键的形成。3种多酚与11S的结合位点数均为10,这可能是由于11S是一个六聚体,由5个亚基组成,每个亚基由酸性和碱性多肽通过二硫键连接,自身分子较大,可为多酚提供足够多的结合位点。周思多[12]也采用等温滴定量热技术研究了大豆蛋白与不同多酚的相互作用,发现不同多酚与大豆蛋白的结合位点数受多酚分子大小、结构的影响而有所差异。WANG等[21]发现原花青素与不同植物蛋白发生相互作用时,由于不同蛋白质的构象不同,与原花青素的结合位点数也不一样。
2.5 圆二色光谱分析
圆二色光谱可以用于分析蛋白质二级结构的变化。从图2中可以看出11S/7S蛋白在约208 nm处出现的负峰表明其富含α-螺旋结构;而217 nm附近轻微左移的肩峰则表明存在较高比例的无规卷曲结构[22]。EGCG和GA与11S/7S形成的复合物的谱图与纯11S/7S蛋白相似,但TA与11S/7S形成的复合物的谱图变化明显,说明TA对11S/7S蛋白的二级结构扰动较大。由表1可以看出,TA的加入使11S/7S二级结构中α-螺旋和β-转角含量大幅度降低,而β-折叠和无规则卷曲含量大幅度增加,说明蛋白质的结构变得更加无序;EGCG的加入,使11S/7S二级结构中α-螺旋含量稍有增加,β-折叠和β-转角含量降低,无规则卷曲含量增加,但增加幅度不如TA;GA的加入,相比TA和EGCG,使11S/7S的二级结构变化相对较小。这可能是由于多酚结构的原因,TA含有多个邻位酚羟基和大分子平面结构,能与蛋白质形成多位点结合,使蛋白质解折叠,结构变得更加无序。而GA是单酚酸,结构简单,结合位点少,对蛋白二级结构的干扰也相对较小。LIU等[23]在研究乳清蛋白与EGCG、槲皮素、芹菜素和柚皮素之间的相互作用时也发现,由于多酚结构及酚羟基含量的差异,乳清蛋白与EGCG相互作用引起的二级结构变化更为显著。
表1 11S/7S-多酚复合物的二级结构相对含量
单位:%
Table 1 Relative secondary structure contents of 11S/7S-polyphenol complexes
样品α-螺旋β-折叠β-转角无规卷曲7S30.17±0.31b28.77±1.15b19.23±0.21b22.07±1.61c7S-TA9.57±0.37c38.22±1.58a∗13.56±0.081a∗38.69±0.81a7S-EGCG31.97±0.785a∗18.83±1.64d17.20±0.44c∗32.00±1.23b7S-GA31.87±1.10a∗32.03±1.25c∗19.80±0.17a∗16.10±2.86d∗11S30.23±0.153B27.17±1.35C19.13±0.12A23.40±1.28D11S-TA10.14±0.32C35.66±0.66A13.47±0.04A40.87±1.15A11S-EGCG34.80±2.05A15.30±1.85D16.27±0.55C33.77±0.35B11S-GA30.27±0.32B24.20±0.79B18.47±0.15B27.07±0.85C
注：不同大写字母表示不同11S-多酚复合物组间的差异显著(P<0.05);不同小写字母表示不同7S-多酚复合物组间的差异显著(P<0.05);*,不同蛋白与相同多酚二级结构相对含量之间的差异显著(P<0.05)。
2.6 表面疏水性分析
3种多酚对11S/7S表面疏水性的影响如图3所示。由图3可以看出,11S/7S与多酚结合后表面疏水性降低,这是因为一方面当蛋白质与多酚通过疏水相互作用结合时,蛋白质的疏水性氨基酸残基被占用,无法再与荧光探针(ANS)结合,使测得的荧光强度值减小,表面疏水性降低;另一方面多酚与蛋白质结合后,引入了大量羟基,使蛋白质处于更加亲水的环境中,表面疏水性降低。结合ITC等温滴定量热结果分析,7S与TA、EGCG和GA之间以及11S与TA之间是以焓驱动主导的结合过程,多酚的酚羟基与蛋白质极性残基之间形成氢键网络,使复合物表面亲水性增强,疏水基团折叠内埋,表面疏水性降低。而11S与EGCG和GA之间的结合是焓驱动与熵驱动的协同过程,EGCG和GA的苯环与11S的疏水区域结合,形成亲水性“外壳”,直接覆盖暴露的疏水基团(如亮氨酸、苯丙氨酸残基),表面疏水性降低。HUANG等[13]研究也表明EGCG使7S表面疏水性降低40%。另外,3种多酚中,TA和EGCG由于其相对复杂的的结构和更多的酚羟基,对11S/7S表面疏水性的影响相对较大,而GA结构简单、酚羟基数少,对表面疏水性的影响相对较小。
a-7S-多酚复合物圆二色光谱图;b-11S-多酚复合物圆二色光谱图
图3 11S/7S-多酚复合物的圆二色光谱图
Fig.3 Circular dichroism spectra of 11S/7S-polyphenol complexes
2.7 抗氧化性能分析
DPPH和ABTS阳离子自由基清除试验以及铁离子还原试验被用来检测11S/7S-多酚复合物的抗氧化性能。11S/7S蛋白于3种多酚的抗氧化活性图见电子版增强出版附图3。由电子版增强出版附图3可知,在添加3种多酚(TA/EGCG/GA)后11S/7S的DPPH自由基清除能力、ABTS阳离子自由基清除能力和铁离子还原能力均提高,表明多酚的加入有助于提高蛋白质的抗氧化性能。金花等[14]研究发现黑豆蛋白与绿原酸结合后,抗氧化性能提高,这与本文的研究结果一致。这是由于多酚含有酚羟基,可以提供大量的H+和电子,导致自由基链反应终止,因此可以提高蛋白的抗氧化活性[24]。TA对11S/7S蛋白的抗氧化性能提升最强,EGCG次之,GA最弱,这与TA含有较多的酚羟基,而GA含有较少的酚羟基有关。
2.8 乳化性分析
蛋白质既具有亲水基团又具有亲油基团,因此它能稳定在油水界面,表现出一定的乳化能力。乳化活性指数和乳化稳定性指数是衡量蛋白质乳化能力的重要指标。由图4可以看出,7S蛋白的乳化活性和乳化稳定性高于11S蛋白,这是由于7S是三聚体,蛋白质的柔韧性较好,7S蛋白在油水界面的吸附能力比11S更强。11S/7S与3种多酚(TA、EGCG和GA)结合后乳化活性明显增加,这是由于3种多酚与11S/7S蛋白结合后,使蛋白质的结构变得松散,导致它在油水界面的吸附能力增强,并降低了界面张力,因此乳化活性得到改善[25]。由于3种多酚自身结构的差异以及与蛋白相互作用原理的不同,使得它们对11S/7S乳化性的影响也不尽相同。对于7S蛋白而言,7S-EGCG的乳化活性和乳化稳定性最强,这是因为EGCG含有疏水性强的芳香环结构,同时具有多个酚羟基,当它与7S结合后,能使7S更好地吸附到油水界面,表现出比其他多酚复合物更好的乳化活性和乳化稳定性[26]。而对于11S而言,11S-GA的乳化活性最强,这是由于11S属于刚性结构,重排能力较弱,而GA属于小分子多酚,可以通过镶嵌进蛋白表面裂缝的方式提高它在油水界面的覆盖率,从而提高11S的乳化性。TA则由于含有的酚羟基数较多,与11S/7S结合后影响了其亲水/亲油平衡,对11S/7S乳化性能的改善不及EGCG和GA。PAN等[8]研究发现槲皮素、芸香苷、绿原酸以及EGCG与牛骨蛋白结合后,均能改善牛骨蛋白的乳化性能,但由于多酚结构和分子质量的不同,导致不同多酚与牛骨蛋白的相互作用有所差异,从而对牛骨蛋白乳化性能的改善效果也不尽相同,其中槲皮素的改善效果最佳。
图4 11S/7S-多酚复合物的表面疏水性
Fig.4 Surface hydrophobicity of 11S/7S-polyphenol complexes
注:不同大写字母表示11S以及11S与不同多酚形成的复合物疏水性数据具有显著性差异(P<0.05);不同小写字母表示7S以及7S与不同多酚形成的复合物疏水性数据具有显著性差异(P<0.05);*,相同多酚与不同蛋白形成的复合物疏水性数据具有显著性差异(P<0.05)(下同)。
a-11S/7S-多酚复合物的乳化活性;b-11S/7S-多酚复合物的乳化稳定性
图5 11S/7S-多酚复合物的乳化活性和乳化稳定性
Fig.5 Emulsification activity index and emulsification stability index of 11S/7S-polyphenol complexes
3 结论
本研究利用多重光谱分析和等温滴定量热技术分析了11S/7S与不同多酚之间相互作用的机理及相互作用后对11S/7S抗氧化活性和乳化性质的影响。紫外-可见光谱、荧光光谱和红外光谱证实了TA、EGCG和GA这3种多酚均能与11S/7S之间发生相互作用,使11S/7S的色氨酸和酪氨酸等氨基酸微环境发生改变。3种多酚与11S/7S发生相互作用的结合位点数和主要驱动力因多酚和蛋白质的结构不同而存在差异,表现为11S与多酚结合位点数多于7S,11S与TA之间主要由氢键和静电相互作用主导、与EGCG和GA之间主要由疏水相互作用主导,而7S与这3种多酚之间均由氢键和静电相互作用主导。3种多酚中,TA由于分子结构复杂、分子质量大,使11S/7S的二级结构变化最为明显,α-螺旋含量显著降低、无规则卷曲含量显著增加,结构变得更加无序。另外TA由于酚羟基数多,与11S/7S形成的复合物表现出最好的抗氧化活性,但是也正是由于它的酚羟基数多,给11S/7S引入了大量的亲水基团,影响其亲水/亲油平衡,对11S/7S乳化性的改善不及EGCG和GA。研究所得结果不仅有助于理解大豆蛋白与多酚相互作用的机制,还表明大豆蛋白-多酚复合物在抗氧化型乳液的设计和开发中具有广阔的前景。
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