心血管疾病(cardiovascular diseases, CVDs)是全球公共卫生领域的重大挑战,据世界卫生组织统计,每年因CVDs死亡的人数约有1 980万,占全球死亡人数的32%,而高胆固醇血症,尤其是低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)水平异常升高是诱发CVDs的关键可控因素[1]。他汀类药物作为常用的控制血脂水平的药物,会引起肌肉及肝功能等相关的副作用[2],相比之下,膳食作为调节人体胆固醇代谢的核心环节,其结构与组成直接影响血脂水平[3],通过天然食品或功能性食品实现胆固醇的温和调节,更符合当代消费者对“食养结合”的健康需求,也是食品科学领域聚焦代谢健康问题的重要研究方向。
植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)作为乳杆菌属中适应性最强的菌种之一,广泛存在于发酵食品、土壤及动物肠道中[4],其降胆固醇作用被认为与胆盐水解酶(bile salt hydrolase, BSH)催化结合型胆盐分解、肠道黏膜吸附游离胆固醇、抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶活性及改善肠道菌群结构等机制相关[5-6]。甘南藏族自治州位于青藏高原东北缘,平均海拔3 000 m以上,具有低温、缺氧、强紫外线的独特高原生态环境,极端环境对微生物形成了严苛的筛选压力,迫使微生物进化出更强的抗逆性(如耐寒、抗氧化、耐营养匮乏等)及独特的功能代谢通路[7-8],例如青藏高原发酵牦牛乳源乳酸菌的抗氧化活性显著高于低海拔参考菌株[9]。本团队推测抗逆性与降胆固醇功能存在机制关联:其一,极端环境常伴随高胆盐浓度或酸碱波动,而胆固醇同化率与BSH活性、胆盐耐受能力密切相关[10],胆盐耐受性越强的菌株可能具备更优胆固醇降解性能,如L.plantarum WCFS1的bsh1基因在胆盐暴露后表达量可诱导上调[11],进而促进胆固醇降解;其二,极端环境中细菌需维持稳定膜结构以抵御物理胁迫[12],而该特征同样有利于菌株对胆固醇的吸附。甘南当地传统发酵牦牛乳是藏族居民的核心膳食组成,其发酵过程依赖于自然存在的微生物群落,这种膳食组成结构很可能与当地人群较低的心血管疾病发生率相关[13]。这种特定生态环境下展现出优异的生理活性的特点,使得甘南地区成为挖掘功能性益生菌资源的重要“基因库”。
课题组前期从甘南传统发酵牦牛乳中,通过体外降胆固醇能力及BSH活性筛选,获得L.plantarum CW22,其表现出显著优于同批菌株的胆固醇降解率(89.17±3.72)%和BSH活性(3.15 U/mL),具备潜在的开发价值。目前,针对甘南发酵牦牛乳中微生物群落的研究多集中于多样性分析[14-15],对该来源菌株降胆固醇机制的系统研究匮乏。
全基因组测序技术已成为解析微生物功能机制的核心手段,能够从分子层面精准挖掘功能基因簇、关键代谢通路,为后续体外功能验证提供明确靶点,避免传统研究的盲目性[16],本研究创新性采用全基因组解析结合体外实验验证的系统策略,以L.plantarum CW22为对象,通过全基因组测序明确其基因组特征、功能基因组成及降胆固醇相关核心基因,再体外实验针对性验证其降胆固醇核心作用机制。预期结果为青藏高原功能性益生菌资源的挖掘提供理论依据,为开发靶向降胆固醇的乳制品、益生菌制剂等功能性食品提供优质菌株资源,极具理论创新价值与应用前景。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株、培养基和生长条件
实验所用2株L.plantarum(编号:CW22、EA3),均由本实验室前期从甘南藏族自治州传统发酵牦牛乳制品中筛选并保存。该地区地处青藏高原东北边缘,境内海拔1 100～4 900 m,属典型高原大陆季风气候,单日最高紫外线指数达12.5,年平均气温约1.7 ℃,近10年最高昼夜温差22 ℃,空气含氧量仅为平原地区的50%,年降雨量400～800 mm[14]。其中CW22经前期体外筛选验证,表现出高效降胆固醇能力[胆固醇降解率(89.17±3.72)%]和高BSH活性(3.15 U/mL),EA3则为同批筛选菌株中降胆固醇能力(53.16±0.88)%和BSH活性(0.099 U/mL)最低的菌株,作为对照菌。菌株于甘肃省功能乳品工程实验室- 80 ℃冷冻保藏,实验所用培养基为MRS培养基。
1.1.2 试剂
甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠、PBS(pH 6.5)、胆固醇,北京索莱宝科技有限公司;无菌生理盐水,辰欣药业股份有限公司;使用试剂均为分析纯级。
1.2 仪器与设备
SW-CJH-2FD超净工作台,苏州净化设备有限公司;YX-280A压力蒸汽灭菌锅,上海三申医疗器械有限公司;HG303-4电热恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;QL-861旋涡振荡器,江苏省海门市麒麟医用仪器厂;ABI-2720型PCR仪、ABI 3730XL测序仪,美国Applied Biosystems公司;Mini Pro 300V Power Supply电泳仪,美国Major Science公司;Labnet Sub System 70电泳槽,美国莱伯特(Labnet)公司;TGL-20高速台式冷冻离心机,长沙湘仪离心机仪器有限公司;UV-1800紫外分光光度计,岛津企业管理(中国)有限公司;Scientz-IID超声破碎仪,宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 L.plantarum CW22全基因组分析
1.3.1.1 菌株DNA提取
菌株活化后,2%(体积分数)接种于MRS液体培养基中,37 ℃培养12 h,4 ℃,4 000×g离心10 min后收集菌体沉淀,基因组DNA的提取委托上海派森诺生物科技有限公司完成。采用十六烷基三甲基溴铵法进行。DNA质量经Qubit 4.0荧光定量系和NanoDrop One超微量紫外分光光度计进行双重检测,分别测定其浓度、纯度及完整性。
1.3.1.2 文库构建以及测序
测序文库使用TruSeq DNA Sample Preparation Kit和Template Prep Kit试剂盒构建,利用Nanopore PromrthION48及Illumina Novaseq平台进行基因组测序。测序数据采用Flye软件(v2.9)进行初步组装,Illumina短读段数据通过Unicycler软件(v0.5.0)进行混合组装。通过多平台数据整合策略优化组装结果,最终采用pilon软件(v1.24)进行基因组序列校正,获得完整闭合环状基因组。基因预测使用GeneMarkS软件(v4.32)进行,参数设置为默认模式。
1.3.1.3 编码蛋白基因注释
研究采用BLAST等比对算法,将菌株的编码基因序列与NR、eggNOG、KEGG、Swiss-Prot、GO、Pfam、转运蛋白分类数据库(Transporter Classification Database, TCDB)及MEROPS数据库中的已知功能基因序列进行相似性比对,从而获取基因的功能信息,通过比对得分、E值等关键参数进行综合评估,最终选取综合参数最优的注释结果,作为注释依据。基于KEGG开展代谢通路注释,通过GO实施基因功能分类注释,结合eggNOG解析基因家族进化关系。所有注释结果经交叉验证确保功能预测的准确性。
1.3.2 BSH基因的PCR检测
BSH由4个基因编码,分别命名为bsh1～bsh4[17],委托北京擎科生物科技股份有限公司完成BSH基因的提取扩增测序工作,引物设计见表1。PCR反应体系:2×T8 High-Fidelity Master Mix 20 μL、10 μmol/L Primer F 2 μL、10 μmol/L Primer R 2 μL、模板(cDNA)2 μL,反应体系总体积为40 μL,各组分加样后,以无酶超纯水(ddH2O)定容至目标体积。PCR反应程序:98 ℃预变性2 min;随后98 ℃变性10 s、退火10 s、72 ℃延伸20 s,35个循环;之后72 ℃延伸5 min;最后4 ℃保存。
表1 PCR引物信息
Table 1 PCR primer information
引物名称序列(5′-3′)扩增大小/bp退火温度/℃bsh1 FTGTACTGCCATAACTTATC70060bsh1 RGTTAACTGCATAGTATTGTGbsh2 FTGCACTAGTCTAACTTATACAAA70060bsh2 RATGGGCCGCTGGCAAbsh3 FTGTACTAGTTTAACGATTCA70060bsh3 RGTTTGCTAACCGGAACbsh4 FTGTACCAGCTTAACTTATCTTG70060bsh4 RATCGGCAGGAAAGAGGT
1.3.3 bsh相对表达量
取对数生长期的菌液1～2 mL,4 ℃离心集菌后迅速吸弃掉培养基,然后迅速氮冷冻后于-80 ℃冰箱保存,qPCR相对定量委托北京擎科生物科技股份有限公司完成,以L.plantarum 16S rRNA为内参基因[18]。根据NCBI数据库提供的基因序列分别设计引物如表2所示。
表2 RT-qPCR引物
Table 2 Primer sequences used for RT-qPCR
引物名称引物序列(5′-3′)产物大小/bpbsh1 FCCACTCTCTGTCTGCATCGG110bsh1 RAGTAGAGGAATGGGCGGACTbsh2 FGAATGTGGTGTCAGCATCGC113bsh2 RAGTACCCAGGCGACGAAATCbsh3 FCAAGTCAGCAATCCGTTCGC107bsh3 RAGCAGACTAAGGCTGGCAAGbsh4 F2ATCAGCCACAACTACACGCA123bsh4 R2GGTTGCTGCCATTTCAGGTG16S rRNA FCTAGATGGTGGGGTAACGGC6016S rRNA RATTACCCTCTCAGGTCGGCT
1.2.4 菌株解离胆盐与胆固醇的共沉淀
参照LIONG等[19]的方法,MRS培养基中单独添加6 mmol/L甘氨胆酸钠、单独添加6 mmol/L牛磺胆酸钠以及添加两者的混合物,其中甘氨胆酸钠浓度为2.8 mmol/L,牛磺胆酸钠浓度为1.2 mmol/L。胆固醇溶液通过0.22 μm滤膜过滤除菌,将其添加到培养基中,使培养基中胆固醇的质量浓度达到100 μg/mL。菌株以1%(体积分数)的接种量接入,37 ℃培养24 h。将培养后的样品以10 000×g,4 ℃下离心10 min。
使用邻苯二甲醛法测定胆固醇含量[20],加入邻苯二甲醛工作液0.1 mL,充分振荡后静置10 min,加入混合酸溶液(冰乙酸与浓硫酸1∶>1体积比混匀)2.0 mL,在室温静置10 min,测定其OD550nm的值,制作胆固醇标准曲线:y=86.813x-13.588(R2=0.997 1)。设置不接菌的空对照,菌株胆固醇降解能力按公式(1)计算:
胆固醇降解率
(1)
式中:A,实验组胆固醇含量;A0,对照组胆固醇含量。
通过比较添加胆盐的实验组与未添加胆盐的对照组中胆固醇的质量浓度差异,确定胆盐对胆固醇共沉淀的影响,为明确其主要降胆固醇机制,采用同批L.plantarum中,降胆固醇能力为(53.16±0.88)%和BSH活性为(0.099±0.024) U/mL的最低菌株EA3为对照,下同。
1.3.5 胆固醇环境对超声处理菌株存活率的影响
通过测定不同培养基条件下菌株对超声波的耐受性,进而明确胆固醇在细胞膜表面的吸附情况。参照任大勇等[21]的方法稍作修改,将活化后的菌株以2%(体积分数)的接种量分别接种至3种不同配方的MRS液体培养基中,分别为普通MRS液体培养基、仅添加100 μg/mL胆固醇溶液的MRS培养基,以及同时含有质量分数0.2%胆盐和100 μg/mL胆固醇的MRS液体培养基。在37 ℃条件下培养24 h后,从每种培养基中分别取1 mL菌悬液置于冰浴环境,130 W、20 kHz、40%超声破碎10个循环(15 s/次),采用平板计数法分别对经过超声处理以及未经超声处理的菌株进行活菌计数,计算3种培养基条件下菌株的存活率。
1.3.6 菌株细胞状态对去除胆固醇的影响
热灭活细胞制作参考郑淼等[22]的方法并作修改,将活化后的菌株以2%(体积分数)的接种量接种于10 mL MRS培养基中37 ℃培养24 h,将培养后的菌液以4 ℃,1 800×g离心15 min,收集细胞,并用蒸馏水洗涤细胞2次。洗涤后的细胞重新悬浮于10 mL蒸馏水中,随后121 ℃灭菌15 min,制备热灭活细胞。将热灭活的细胞添加于含有甘氨胆酸钠(0.05 mmol/L)的胆固醇(100 μg/mL)MRS培养基中(pH 6.8)作为热处理组,未灭活细胞添加于相同条件的磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中作为静息细胞处理组,未灭活的细胞添加于相同条件的胆固醇MRS培养基中作为生长细胞处理组,测定3组培养基中胆固醇的含量。
1.4 数据处理
采用Excel 2021记录数据,MEGA 12.0构建系统BSH的系统发育树,使用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析,选用Duncan多重比较进行显著性分析,以评估各组之间的显著性差异(P<0.05)。使用Origin 2018软件对实验数据进行可视化处理,绘制相关图表。
2 结果与分析
2.1 L.plantarum CW22全基因组特征
全基因组测序(表3、图1)结果显示,CW22基因组全长3 318 231 bp,GC含量44.48%,预测含3个质粒(质粒1:76 909 bp,GC 37.94%;质粒2:13 687 bp,GC 35.73%;质粒3:3 210 bp,GC 38.72%)。染色体区域预测出3 155个开放阅读框,总长度2 773 647 bp,占基因组全长的83.59%。基因组分析表明,CW22的染色体区域携带丰富的环境适应及BSH相关基因,包括耐寒基因(csp、cspL、cspLA)、耐胆盐基因(baiE)、抗氧化基因(trxA、trxB、gor、tpx、katA)、渗透压耐受基因(opuCA、opuCB、opuCC、opuCD、nhaC、treR、treA、treP、trePP)、耐酸基因(atpA、atpC、atpD、atpG、atpH)以及BSH基因(bsh1、bsh2、bsh3、bsh4)。此外,在质粒1中预测到耐酸基因yifK、抗氧化相关基因mntH以及多重应激响应基因uspA。
a-L.plantarum CW22染色体圈图;b-质粒1圈图;c-质粒2圈图;d-质粒3圈图
图1 L.plantarum CW22基因组圈图
Fig.1 L.plantarum CW22 genome circle map
注:从外向内第1、2圈表示位于正链和负链上的基因,第3圈表示GC含量,向外表示该区域GC含量高于全基因组平均值,峰值越高差值越大;向内表示低于平均值,第4圈表示GC偏移,最内圈表示基因组大小。
表3 L.plantarum CW22基因组基本信息
Table 3 Basic information of L.plantarum CW22 genome
序列类型序列长度/bp开放阅读框数量GC含量/%开放阅读框/基因组/%染色体3 318 2313 15544.4883.59质粒176 9098037.9476.97质粒213 6871735.7355.72质粒33 210338.7274.58
2.2 L.plantarum CW22基因组功能注释
为预测CW22编码基因的功能,本研究将其分别与多个权威生物信息学数据库进行比对注释,具体包括NR、eggNOG、KEGG、Swiss-Prot、GO、Pfam、TCDB及MEROPS。各数据库对该菌株基因的可注释数量存在明显差异,其中NR数据库的功能注释覆盖度最高,可搜索到的功能注释基因达3 147个;其余数据库的可注释基因数量依次为:eggNOG(2 655个)、Swiss-Prot(2 110个)、GO(2 220个)、Pfam(2 389个)、KEGG(1 424个)、MEROPS(1 098个)、TCDB(597个)。
2.2.1 KEGG通路富集
将CW22的序列与KEGG数据库进行比对,共注释到1 424个基因,结果如图2所示。其中代谢相关的基因数量最多,尤其是碳水化合物代谢(282个基因)、氨基酸代谢(164个基因)、辅因子和维生素代谢(85个基因)、能量代谢(83个基因)以及核苷酸代谢(69个基因)。这些代谢途径的富集表明CW22在能量获取与储存、蛋白质合成、细胞生长、辅因子和维生素的利用等方面具有高度的代谢活性和多样性;信号转导注释出63个基因、膜运输注释出153个基因,进一步表明CW22具备较强的环境适应能力与信号传递响应机制。在脂质代谢功能大类中,共注释到42个基因参与CW22的脂质代谢过程,涉及五类脂质代谢相关KEGG通路。其中,脂肪酸生物合成(KEGG:00061,15个基因)、甘油磷脂代谢(KEGG:00564,12个基因)及甘油酯代谢(KEGG:00561,11个基因)为高频优势通路;鞘脂代谢(KEGG:00600,3个基因)、次级胆汁酸生物合成(KEGG:00121,1个基因)属于该菌株脂质代谢网络中的低频通路。
图2 KEGG通路富集
Fig.2 KEGG pathway enrichment
2.2.2 GO功能分类
对CW22进行全基因组测序后的GO富集分析结果如图3所示,代谢相关基因表现出显著富集,在小分子代谢过程和生物合成过程中,基因富集表现突出,分别包含554和729个基因,这表明菌株在物质转化和代谢调控方面具有强大的基因基础。此外,响应胁迫过程富集了100个基因,表明菌株具有良好的环境耐受能力。在分子功能层面,水解酶活性在作用于碳-氮键的基因富集了43个,作用于糖苷键的基因富集了76个,这表明菌株可能在胆盐代谢和耐受性方面具有独特优势。核心发现是,在分子功能分类中,CW22内4个基因(chr_2171、chr_2906、chr_3031、chr_72)均被注释GO:0045302,即为BSH的特异性功能注释,这一功能直接参与肠道胆汁盐代谢与胆固醇吸收调控,为CW22的降胆固醇特性提供了关键的分子层面证据。
图3 GO富集分析
Fig.3 GO enrichment analysis
2.2.3 COG功能分类
CW22的COG功能注释揭示了其在多个核心生命过程中的强大遗传潜力(图4)。其中,碳水化合物运输与代谢(类别G)相关基因数量共259个,表明该菌株具有较强的碳水化合物代谢能力,这对其在特定环境中的生长和适应可能至关重要。其次,氨基酸运输与代谢(类别E)和复制、重组与修复(类别L)分别富集了199和166个基因,这些基因的富集表明菌株在蛋白质合成和DNA维护方面具有高度的遗传潜力。此外,转录(类别K)和能量产生与转换(类别C)分别有271和123个基因,揭示了其在基因表达调控和能量代谢方面的精细调控能力。而功能未知(类别S)的基因数量共有684个,这表明菌株CW22中存在大量尚未明确功能的基因,为未来的功能研究提供了潜在的靶点。此外,COG结果显示,4个基因(chr_72、chr_2171、chr_2906、chr_3031)均被注释为BSH活性(ENOG4107QHE),归属于类别M,与GO注释结果一致;同时,基因组中含55个COG I类基因,可协同参与胆固醇代谢过程,为该功能的发挥提供基础支撑。
图4 COG功能分类
Fig.4 COG function classification
2.3 BSH基因鉴定与序列分析
以CW22的基因组DNA为模板,采用bsh基因特异性引物进行PCR扩增,成功获得4个同源基因(图5),分别命名为bsh1、bsh2、bsh3和bsh4。对这4个基因进行测序及同源性比对分析,结果显示其均隶属于L.plantarum的BSH基因家族;进一步测定基因全长发现,bsh基因长度为750～1 000 bp。该结果表明CW22携带完整的BSH基因簇,为其后续BSH活性表达及降胆固醇功能发挥提供了核心基因型基础。为进一步解析CW22的BSH亚型分布与其功能表型的关联,本研究选取了5种不同亚型的BSH序列,构建了CW22菌株同源的BSH系统发育树(图6)。从系统发育树的聚类结果可知,CW22菌株所携带的4种BSH分别聚类于A、B、C、E这4个进化分支,对应不同的BSH亚型。已有研究证实,多数归属于BSH A和BSH B亚型的BSH具有较高的活性[23],而本研究中CW22的BSH蛋白同时包含高活性的A、B亚型,这一结果从分子亚型的进化特征角度,为该菌株展现出高BSH活性的表型提供了关键的理论支撑。
图5 BSH基因的PCR电泳结果
Fig.5 PCR electrophoresis results of the BSH gene
图6 同源BSH的系统发育树
Fig.6 Phylogenetic tree of homologous BSHs
注:红色标注为CW22菌株的BSH,不同的大写字母则对应不同的BSH亚型。
2.4 bsh相对表达量
CW22中bsh1～bsh4基因的qPCR定量数据及相对表达水平如图7所示,基因的相对表达水平呈现显著的层级分化特征,具体表现为bsh1>bsh3>bsh2>bsh4的明确排序。bsh1与bsh4的相对表达量差距最大,相差2.28倍,而bsh3与bsh2的表达量较为接近。这一结果明确bsh1是调控CW22菌株BSH活性的核心功能基因,其高效表达为菌株提供了强胆盐水解能力的分子基础,直接关联后续胆盐解离、胆固醇共沉淀及细胞膜吸附等功能表型。
图7 L.plantarum CW22的4种bsh相对表达水平
Fig.7 Relative expression levels of four types of bsh in L.plantarum CW22
注:不同小写字母表示4个bsh基因表达水平的显著性差异(P<0.05)。
2.5 菌株解离胆盐与胆固醇的共沉淀
CW22与EA3对不同胆盐的解离产生游离胆酸,与胆固醇的共沉淀作用如图8所示,两株菌均对2种胆盐有解离作用:CW22在甘氨胆酸钠条件下的胆固醇沉淀量最高,达40.67 μg/mL,在牛磺胆酸钠条件下最低,为12.45 μg/mL;EA3在甘氨胆酸钠条件下的胆固醇沉淀量为15.84 μg/mL,在牛磺胆酸钠条件下最低,为1.39 μg/mL。CW22在所有胆盐条件下的胆固醇沉淀量均显著高于EA3(P<0.05);CW22对甘氨胆酸盐的解离能力为最强,结合基因鉴定与bsh基因表达分析可知,正是由于CW22携带4个bsh同源基因且核心基因bsh1高效表达,使其能更高效解离各类胆盐(尤其对甘氨胆酸盐表现出偏好性),释放的游离胆酸与胆固醇形成大量不溶性复合物,证实了BSH介导的共沉淀是CW22降胆固醇的主要途径。
图8 胆固醇与胆盐共沉淀
Fig.8 Co-precipitation of cholesterol with bile salts
注:不同小写字母表示CW22对不同胆盐与胆固醇共沉淀量的显著性差异,不同大写字母则表示EA3对不同胆盐与胆固醇共沉淀量的显著性差异(P<0.05)。
2.6 胆固醇环境对超声处理菌株存活率的影响
菌株在不同培养环境下经超声处理后的存活率结果如表4所示。整体来看,CW22与EA3菌株的超声处理存活率,随培养环境中胆固醇、胆盐的依次添加呈逐步上升的趋势。在仅含MRS的基础培养基中,CW22与EA3的存活率分别为1.08%和0.05%;当培养基中添加胆固醇后,两株菌的存活率均出现显著提升(P<0.05),分别达到1.25%与0.17%;若培养基中同时添加胆固醇与胆盐,两株菌的存活率进一步升高,分别达到8.68%与0.73%,其中CW22的存活率提升幅度尤为明显。这一现象与胆盐水解结果直接相关:CW22通过高活性BSH高效解离胆盐生成的游离胆酸,与菌体细胞膜表面结合[24],并促进胆固醇吸附,增强细胞膜柔韧性与稳定性[25],进而提升对超声胁迫的耐受性[26]。该结果表明,BSH介导的胆盐水解不仅直接促进胆固醇共沉淀,还通过调控细胞膜结构增强胆固醇吸附能力,形成酶解-吸附的协同关联。此外,EA3在含胆盐环境中的存活率提升幅度不及CW22,这一差异与两株菌的BSH活性特征能够相互对应。
表4 超声处理对菌株存活率的影响
Table 4 Effect of ultrasonic treatment on the survival of strain
菌株培养环境破碎前活菌数/(CFU/mL)破碎后活菌/(CFU/mL)存活率/%MRS(5.4±0.2)×109(5.8±0.1)×1071.08CW22MRS+胆固醇(2.3±0.2)×108(3.0±0.3)×1061.25MRS+胆固醇+胆盐(3.1±0.3)×105(2.7±0.2)×1048.68MRS(5.1±0.1)×109(2.5±0.2)×1060.05EA3MRS+胆固醇(1.6±0.3)×108(2.7±0.1)×1050.17EA3MRS+胆固醇+胆盐(3.0±1.3)×105(2.2±0.2)×1030.73
2.7 菌株细胞状态对去除胆固醇的影响
对比生长、静息及热灭活3种细胞状态的胆固醇降解率发现(图9),CW22在生长状态下的降解率达90.3%,显著高于静息状态(43.08%)和热灭活状态(25.65%),且与EA3的降解率差距(生长状态差距39.1%,静息状态差距4.24%,热灭活状态差距4.6%)在生长状态下极为显著。结合以上所有结果可知,CW22基于多bsh基因携带,核心bsh1的高效表达,从而形成高BSH酶活性表现,达到高效胆盐水解与共沉淀、细胞膜吸附增强的完整链条,在生长状态下通过代谢活性支撑高效酶解介导共沉淀、强细胞膜吸附的协同作用,最终实现了远超对照菌的胆固醇降解效率。
图9 不同菌株状态胆固醇降解率
Fig.9 Cholesterol degradation rate of different strain states
注:不同小写字母表示CW22不同细胞状态降胆固醇能力的显著性差异,不同大写字母表示EA3不同细胞状态降胆固醇能力的显著性差异(P<0.05)。
3 讨论
团队前期从甘南传统发酵牦牛乳中筛选获得的L.plantarum中,CW22表现出显著优于同批菌株的降胆固醇活性(89.17±3.72)%和BSH活性(3.15 U/mL)。为系统揭示CW22高效降胆固醇的分子机制,明确其功能优势的遗传基础,本研究采用全基因组解析结合体外功能验证的系统策略,从分子层面挖掘降胆固醇相关功能基因与代谢通路,通过体外实验针对性验证核心作用机制,为该菌株的开发应用提供理论支撑。
CW22基因组全长3 318 231 bp,GC含量44.48%,预测的3 155个ORFs中,KEGG通路富集的碳水化合物代谢、氨基酸代谢及辅因子和维生素代谢,为降胆固醇功能的发挥提供了关键支撑。碳水化合物代谢通路的富集可通过高效能量转换保障菌株在肠道环境中的生长繁殖[27],而氨基酸代谢则为BSH等功能酶的合成提供原料[28];辅因子与维生素代谢相关基因,通过支持细菌的整体生长、维持关键酶的活性和表达,从而间接促进BSH介导的胆固醇降低作用[29]。此外,膜运输和信号转导相关基因的富集,增强了CW22对肠道胆盐[30]、胆固醇等环境因子的响应与物质转运能力[31],使其能够在复杂肠道微环境中稳定发挥功能。GO功能分类中,作用于碳-氮键、糖苷键的水解酶活性基因显著富集,这一特征直接指向BSH的潜在功能,为BSH基因鉴定与机制验证提供了重要线索。全基因组注释与PCR验证共同发现CW22携带4个bsh同源基因bsh1～bsh4。qPCR结果显示bsh1相对表达量显著高于其他同源基因,且与bsh4的表达量差距达2.28倍,表明bsh1是调控CW22 BSH活性的核心功能基因,系统发育树分析显示,CW22的4个BSH蛋白分别聚类于A、B、C、E这4个亚型,其中核心基因bsh1归属于A类,已有研究证实A类为BSH高活性亚型[23],这与bsh1的高水平表达特征直接呼应,为其高效发挥胆盐水解功能提供了分子亚型支撑。与已报道菌株相比,CW22的基因特征与功能表现均具独特优势:Ligilactobacillus sp.BD7642仅携带3个bsh基因[32],基因数量不足限制了底物覆盖与水解协同效率;虽有L.plantarum Y44等菌株同样携带4个bsh基因且与CW22高度同源[33],但CW22的BSH活性显著高于该菌株,进一步凸显其在功能表型上的不可替代性,构成其降胆固醇效能的核心特有优势。
BSH作为益生菌降胆固醇的关键酶类,其通过水解结合型胆盐释放游离胆酸,后者与肠道内胆固醇形成不溶性复合物并随粪便排出[34]。CW22的高BSH活性正是源于bsh1的高效表达,进而提升菌株整体胆盐水解能力,而bsh2～bsh4的表达可能起到辅助补充作用[35]。其对甘氨胆酸盐的偏好性水解,可能与bsh1编码酶的底物特异性相关,这一特征使其更适配人体肠道内甘氨胆盐占比更高的生理环境[6],进一步提升了其实际应用价值。
胆固醇共沉淀实验中,CW22在各胆盐条件下的胆固醇沉淀量均显著高于BSH活性极低的EA3(P<0.05),且在甘氨胆酸钠条件下达到峰值(40.67 μg/mL),占总降解率的45%以上,且该沉淀量远高于现有研究报道的L.plantarum C1、L.plantarum H13[21,36],这一结果直接证实BSH介导的胆固醇-胆酸共沉淀是CW22降胆固醇的主要途径,且凸显了CW22的功能优势与资源稀缺性。菌株间共沉淀量的显著差异,本质上是BSH活性差异的直接体现,高活性BSH能够更高效地水解各类胆盐底物,产生更高浓度的游离胆酸,进而与更多胆固醇结合形成沉淀。此外,共沉淀过程不仅直接降低了环境中的游离胆固醇浓度,还能通过消耗结合型胆盐,反馈性促进肝脏利用血液中的胆固醇合成新的胆酸[37],进一步降低体内胆固醇水平。
超声处理存活率实验中,添加胆固醇与胆盐后CW22的存活率提升至8.68%,显著高于基础培养基组(1.08%),这一现象既反映了胆固醇与胆盐对菌株细胞膜结构的协同调控作用,也与菌株自身的BSH活性特征形成紧密关联。从机制层面分析,超声处理对菌体的损伤主要源于超声波引发的空化效应破坏细胞膜完整性[38],而存活率的提升本质上是细胞膜结构稳定性增强的直接体现。当培养基中同时添加胆固醇与胆盐时,存活率提升,这与胆盐的理化特性密切相关:胆盐作为两性分子,可嵌入细胞膜脂质双层结构,提升细胞膜通透性,进而促进胆固醇更高效地吸附于细胞膜表面或渗透至膜内[39],形成更稳定的膜结构,最终强化菌株对超声胁迫的耐受性。实验通过CW22与EA3的存活率差异,直接印证BSH活性是调控胆固醇吸附的核心因素,CW22凭借高活性BSH高效水解胆盐,其产物可调节细胞膜通透性与流动性[40],为胆固醇吸附创造有利条件,而EA3因BSH活性低下,难以实现细胞膜结构重塑与高效吸附。
细胞状态实验进一步得出:生长细胞展现出最高的降胆固醇效能,可能是在营养充足的生长环境中,CW22的代谢通路激活,基因组中丰富的碳水化合物代谢相关基因的存在,可以为蛋白质(如BSH)的合成、折叠及活性维持提供能量与物质保障[41]。此外,生长状态下CW22与EA3的降解率差距最为显著,本质可能是两者BSH活性差异在代谢活跃条件下的放大效应,CW22的高BSH活性在充足营养供给下充分发挥,而EA3因低BSH活性难以实现高效降解。静息细胞的降胆固醇率显著低于生长细胞,且两株菌的降解率差距明显缩小,静息状态下,菌株缺乏营养供给,代谢速率显著下降[42]。更关键的是,实验揭示细胞膜吸附胆固醇并非单纯物理结合,而是依赖菌株代谢活性、与胆盐水解及膜结构重塑紧密关联的主动调控过程,与前文共沉淀机制形成逻辑闭环,共同支撑起CW22高效酶解与主动吸附的协同降胆固醇模式,进一步凸显其相较于单一机制菌株的独特优势。
综上,L.plantarum CW22的降胆固醇功能是其基因组中丰富的代谢通路、核心bsh1基因的高效表达及细胞膜吸附辅助作用协同实现的。全基因组解析揭示的代谢网络为BSH活性提供了物质与能量保障,bsh1的高表达赋予菌株优异的胆盐水解能力,明确了胆固醇-胆酸共沉淀体系降胆固醇的主体地位,而细胞膜吸附则进一步增强了降胆固醇效果。该菌株不仅丰富了高原特色功能性益生菌资源库,其明确的分子机制与高效的降胆固醇活性,也为靶向降胆固醇发酵乳制品、益生菌制剂等功能性食品的开发提供了优质菌株与理论支撑。未来研究可进一步开展动物实验验证其体内降胆固醇效果,并优化发酵工艺以提升菌株的实际应用稳定性。
4 结论
本研究以甘南传统发酵牦牛乳源L.plantarum CW22为核心对象,首次系统揭示了该来源L.plantarum的优异降胆固醇性能及其分子机制,核心发现如下:
其一,CW22基因组富集碳水化合物代谢、氨基酸代谢、辅因子和维生素代谢及胆固醇代谢关键通路,为菌株生长繁殖及功能酶合成提供了坚实的能量与物质保障,而膜运输和信号转导相关基因的富集进一步增强了菌株对复杂环境的适应能力,为其降胆固醇功能发挥奠定了分子基础。
其二,基因组注释与PCR验证CW22携带4个bsh同源基因(bsh1～bsh4),明确bsh1编码的BSH A亚型与酶活性的强关联性,其中bsh1作为核心功能基因,其高效表达直接赋予菌株高BSH活性,成为介导降胆固醇作用的关键遗传支撑。
其三,体外功能实验证实CW22的降胆固醇作用由多机制协同实现:BSH介导的胆固醇-胆酸共沉淀为主要途径,菌株对甘氨胆酸盐表现出明确水解偏好性;细胞膜吸附为辅助途径,该过程依赖菌株代谢活性,在生长状态下作用更显著,热灭活细胞虽保留部分吸附能力但贡献度较低。
该研究的理论意义与前瞻性应用价值深远,不仅揭示了青藏高原植物乳植杆菌进化出高活性bsh基因精准高表达的功能适配模式,还完善了益生菌基因型-表达调控-多机制协同的降胆固醇关联理论,明确了BSH基因亚型,为同类研究提供参考依据;同时,优质菌株CW22的高效降胆固醇特性与肠道适配性,为靶向功能性食品开发提供了稀缺资源,核心基因与调控特征为益生菌基因工程改造奠定基础,更为研发安全温和的天然降脂替代方案提供了助力。
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