芽孢杆菌(Bacillus spp.)是食品腐败的主要致病菌之一,其耐药性及芽孢结构导致传统灭菌手段低效,严重威胁食品安全[1]。据统计,法国2007—2014年发生的140起食源性疾病,其中74起与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)相关,B.cereus是仅次于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的第二大常见食源性病原菌[2],在我国是仅次于沙门氏菌(Salmonella spp.)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、致泻大肠埃希菌(Diarrheagenic Escherichia coli)和S.aureus的第五位食源性致病菌[3],而枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)因极端耐热性(需121 ℃高压灭菌方能杀灭)被广泛用作食品杀菌效能的评价标准[4]。此外,萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)作为灭菌生物指示菌,其抗性进一步凸显现有化学和物理杀菌技术的局限性[5]。因而,开发高效、安全的天然抑菌剂已成为食品保鲜领域的迫切需求。
石榴皮提取物(pomegranate peel extract,PPE)作为植物源抗菌剂的潜力已有多项报道证实。相关研究表明,PPE提取物对革兰氏阴性菌[如大肠杆菌(Escherichia coli)[6-7]、Salmonella spp.[8-9]、V.parahaemolyticus[10]、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[11]]和阳性菌[单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)[11]、S.aureus[7,11]]等均表现抑菌作用,且其最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)可低至0.062 5 mg/mL;本课题组前期研究表明,PPE对3种食源性芽孢杆菌(B.subtilis、B.cereus、B.atrophaeus,下同)的抑菌活性(MIC 1.2～2.0 mg/mL)显著优于其对多种真菌[如产红青霉Penicillium rubrum、损毁链格孢菌(Alternaria destruens)、串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)]的抑制活性(MIC>5 mg/mL),且处理组的可溶性总糖含量、可溶性蛋白含量、核酸泄露量和电导率均较对照组有显著升高[12],提示其靶向作用于细菌特异性膜脂代谢通路的可能性。
因此,本研究聚焦PPE通过诱导膜脂过氧化抑制芽孢杆菌的分子机制。膜脂过氧化是活性氧(reactive oxygen species,ROS)攻击膜不饱和脂肪酸引发的链式反应,其终产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)可交联膜蛋白与磷脂,导致膜通透性改变及细胞凋亡。本研究将系统评估:PPE处理对3种芽孢杆菌的氧化应激响应即ROS生成动力学、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、过氧化物酶(peroxidase,POD)活性变化;膜损伤标志物含量变化:即丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)含量和细菌细胞超微结构破坏情况。该研究不仅可以为植物源防腐剂开发提供理论支撑,亦可为石榴皮高值化利用开辟新途径。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 材料与试剂
选用甘肃省天水市农户自产临潼石榴(Punica granatum ‘Lintong’),该品种栽培过程中未施用化学农药。
牛肉膏、琼脂、胰蛋白胨,北京奥博星生物技术有限责任公司;NaCl、KH2 PO4、Na2 HPO4,西陇科学股份有限公司;2.5%(质量分数)戊二醛、无水甲醇、无水乙醇,国药集团化学试剂有限公司;硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA),亚索(山东)化学试剂有限公司;Tris-HCl缓冲液、SOD试剂盒、CAT试剂盒、POD试剂盒、Na+-K+-ATP酶活性试剂盒、AKP含量试剂盒、超氧阴离子自由基
含量试剂盒、过氧化氢(H2O2)试剂盒,北京索莱宝科技有限公司;三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)、叔丁醇、乙腈,上海麦克林生化科技股份有限公司。
1.1.2 菌种来源与处理
B.cereus、B.subtilis及B.atrophaeus均由甘肃农业大学微生物菌种保藏中心提供。所有菌株使用前经LB培养基(37 ℃,200 r/min)活化培养24 h,4 ℃保存备用。
1.2 仪器与设备
722 N 紫外分光光度计,上海仪电分析仪器有限公司;Regulus 8100扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM),日立公司;YXQ 50A 立式高压蒸汽灭菌锅,上海博讯实业有限公司;QYC-N2102C 恒温摇床振荡培养箱、超声波工作台,上海福玛公司;HH WS-Ⅱ-200 恒温恒湿培养箱,上海跃进医疗器械有限公司;TGL-20M 台式冷冻型离心机,上海土森视觉科技有限公司;IKARV10 旋转蒸发仪,苏州赛恩斯仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 石榴皮样品制备
采集成熟果实后,人工剥离外果皮,经去离子水清洗、避光通风干燥[(25±2) ℃,72 h],随后采用超微粉碎机(粒径≤100 μm)制备石榴皮粉,密封避光保存于干燥器中备用。
1.3.2 石榴皮乙醇提取物制备
参考房玉林等[13]、刘焕云等[14]的最佳工艺提取方案,采用超声波提取,称取10 g石榴皮粉于500 mL烧杯中,按1∶>30(g∶>mL)料液比加入70%(体积分数)乙醇300 mL,置于超声波工作台中,超声波功率100 W,温度50 ℃,处理4 h,进行离心,所得上清液用抽滤装置进行过滤。将滤液用旋转蒸发仪(50 ℃)浓缩至无溶剂蒸出,并于开放环境下使溶剂挥发,所得固体研磨后以无菌水稀释到所需浓度进行后续实验。
1.3.3 芽孢杆菌菌悬液的制备
活化菌株在恒温箱中培养24 h后取出,倒入10 mL无菌水制得悬浮液,吸取1 mL于无菌NB(nutrient broth)液体培养基中,并在27 ℃、180 r/min摇床培养8 h达到对数期(107～108 CFU/mL),采用平板菌落计数法测定菌液样本浓度。
1.3.4 样品的制备
收集培养至对数期的菌悬液,于8 000 r/min、4 ℃条件离心10 min,随后用PBS清洗2次,并重新悬浮。向菌悬液中添加石榴皮提取物至质量浓度为2 mg/mL,以无菌水为对照组,在27 ℃、180 r/min下摇床培养,分别于0、3、6、9、12 h取样待测,每个样品重复3次。
1.3.5 酶液制备
将5×106 CFU的细菌转移到离心管中,离心去除上清液;向离心管中添加1.5 mL的Tris-HCl缓冲液,使用超声波进行冷破碎处理;随后在4 ℃条件下以8 000 r/min离心10 min,取上清液置冰上保存。
1.3.6 酶活性测定
SOD、CAT、POD、Na+-K+-ATP酶活性均以试剂盒进行测定。
1.3.7 膜脂过氧化产物含量测定
AKP含量
含量、H2O2含量均采用试剂盒进行测定。
MDA含量的测定:采用硫代巴比妥酸法[15]测定并稍作修改。按1.3.3节、1.3.4节、1.3.5节进行菌株培养、酶液提取。将0.6 g TBA溶解于少量1 mol/L NaOH溶液,用100 mg/mL TCA稀释至总体积为100 mL,制成6.7 mg/mL TBA溶液。取1 mL待测酶液,加入2 mL的6.7 mg/mL TBA溶液,将混合物放入沸水浴中加热15 min。加热完成后,迅速冷却并进行离心处理,最后取上清液在450、532、600 nm的波长下进行比色测定,MDA含量的计算如公式(1)所示:
MDA含量/(μmol/mL)
(1)
式中:W 代表1 mL待测酶液的质量,g。
1.3.8 PPE对菌体形态的影响
将0.5 mL 20 mg/mL PPE加入到芽孢杆菌菌悬液中,在27 ℃、180 r/min摇床振荡培养12 h。培养结束后,取10 mL菌液,并以5 000 r/min离心5 min,弃除上清液。之后向样品中加入2.5%戊二醛进行固定,4 ℃环境下过夜。用pH值为7.4的PBS对样品进行3次洗涤。依次使用30%、50%、70%、90%和100%(体积分数)的乙醇溶液,对样品进行脱水处理,每次10 min;以5 000 r/min的速度离心5 min,去除上清液,然后用50%、75%、100%(体积分数)的叔丁醇溶液依次清洗,常温放置10 min。再次以5 000 r/min离心5 min,弃上清液,随后用叔丁醇与乙腈按体积比2∶>1和1∶>1混合的溶液依次冲洗,常温放置10 min。冲洗完成后,将干燥后菌体挑放到黑色导电胶上并平铺,使用离子溅射仪进行薄膜镀膜,最后在SEM下进行观察和拍照。
2 结果与分析
2.1 三种芽孢杆菌对PPE的氧化应激响应
2.1.1 PPE对芽孢杆菌
含量的影响
作为ROS的重要组分,在细胞信号传导和免疫防御中发挥双重作用[16]。研究发现,PPE处理显著改变了3种芽孢杆菌胞内
的动态平衡(图1),数据显示,处理组含量呈典型的三相变化:快速积累期(0～3 h)、波动调整期(3～9 h)和稳态维持期(>9 h),在6 h时,处理组水平较对照组极显著升高(P<0.01),最大积累量出现在4～6 h区间,各菌株增幅存在种间差异,范围为41.2%～61.5%(B.cereus>B.subtilis>B.atrophaeus)。
A-B.cereus;B-B.subtilis;C-B.atrophaeus
图1 PPE对芽孢杆菌
含量的影响
Fig.1 Effect of PPE on content of Bacillus spp.
注:相同处理时间时处理组与对照组间相比,“*”表示在P<0.05水平的差异显著性,“**”表示在P<0.01水平的差异显著性,“ns”表示差异不显著(下同)。
2.1.2 PPE对芽孢杆菌H2O2含量的影响
H2O2作为细胞内重要的ROS分子,在微生物生理过程中扮演双重角色:一方面作为氧化应激介质,可直接氧化修饰核酸、蛋白质等生物大分子,并引发膜脂过氧化反应,导致细胞结构和功能的不可逆损伤;另一方面作为信号分子参与调控抗氧化防御系统的应激响应[17]。如图2所示,对照组在整个监测周期内保持稳态水平,处理组H2O2含量均呈现典型的剂量依赖性积累模式,且3种菌株的H2O2积累动力学曲线呈现高度一致性(R2>0.95),与对照差异均达极显著(P<0.01),在12 h处理终点,3种芽孢杆菌胞内H2O2水平分别达到对照组的46.3倍、22.8倍和25.7倍,B.subtilis对PPE诱导的H2O2积累最为敏感。
A-B.cereus;B-B.subtilis;C-B.atrophaeus
图2 PPE对芽孢杆菌H2O2含量的影响
Fig.2 Effect of PPE on H2O2 content of Bacillus spp.
A-B.cereus;B-B.subtilis;C-B.atrophaeus
图3 PPE对芽孢杆菌SOD活性的影响
Fig.3 Effect of PPE on SOD activity of Bacillus spp.
2.1.3 PPE对芽孢杆菌SOD活性的影响
SOD作为生物抗氧化防御系统的第一道防线,在维持细胞内氧化还原平衡中起着核心作用。该酶通过催化的歧化反应,有效减轻ROS对细胞的氧化损伤。数据表明(图3),对照组始终保持较高SOD活性(较处理组高21.3%～53.7%,P<0.01),而处理组在初期应激响应阶段(0～6 h),SOD活性呈快速上升趋势,在6 h达到峰值[B.subtilis(748.57 U/mL),B.cereus(730.82 U/mL),B.atrophaeus(771.22 U/mL)],表明细菌启动抗氧化防御机制;后期抑制阶段(6～12 h),活性极显著下降(P﹤0.01),降幅分别为40.5%、44.42%和47.92%,反映抗氧化系统失效。3种菌株的SOD活性抑制程度存在种间差异(B.atrophaeus>B.cereus>B.subtilis)。
2.1.4 PPE对芽孢杆菌CAT活性的影响
CAT作为生物体内重要的抗氧化酶,能够高效催化H2O2分解为H2O和O2,从而清除有害ROS,保护细胞免受氧化损伤。如图4所示,在0～9 h处理期间,PPE处理组的CAT活性持续下降,但其酶活性始终极显著(P<0.01)高于对照组。这表明在胁迫初期,芽孢杆菌能够通过上调CAT活性来维持基本的抗氧化防御功能,部分抵消PPE诱导的氧化压力。然而,随着处理时间延长(>3 h),CAT活性减弱(最低为对照组的1.62倍,P<0.05),导致H2O2清除能力显著下降,这种抗氧化系统的失效造成ROS大量积累。
A-B.cereus;B-B.subtilis;C-B.atrophaeus
图4 PPE对芽孢杆菌CAT活性的影响
Fig.4 Effect of PPE on CAT activity of Bacillus spp.
2.1.5 PPE对芽孢杆菌POD活性的影响
POD是生物体抗氧化防御系统的关键酶类,其主要通过催化H2O2的分解来保护细胞免受氧化损伤。如图5所示,PPE处理对3种芽孢杆菌POD活性具有显著影响。
A-B.cereus;B-B.subtilis;C-B.atrophaeus
图5 PPE对芽孢杆菌POD活性的影响
Fig.5 Effect of PPE on POD activity of Bacillus spp.
在0～6 h,POD活性呈现升高趋势,6 h时达到峰值,差异均达极显著(P<0.01),较对照组分别显著提高84.4%(B.cereus)、54.05%(B.subtilis)和44.12%(B.atrophaeus),表明细菌启动了抗氧化防御机制以应对PPE诱导的氧化胁迫;在6～12 h,POD活性逐渐下降,但仍维持在显著(P<0.05)高于对照组的水平,提示细菌持续激活POD抗氧化系统,但抗氧化能力已呈现减弱趋势,细胞逐渐丧失维持氧化还原平衡的能力。
2.2 PPE对膜损伤标记物的影响
2.2.1 PPE对AKP含量的影响
AKP在微生物体内可直接参与磷酸基团的转移和代谢,AKP仅存在于细胞壁和细胞膜之间,所以正常情况下胞外不能检测到AKP;细胞壁受损时,AKP由胞内渗出,细菌磷酸基团代谢途径受到影响[18]。如图6所示,经PPE处理后,芽孢杆菌AKP含量持续增加,在9～12 h时趋于平稳,维持在较高水平,说明PPE破坏了芽孢杆菌细胞壁完整性,使AKP从细胞壁中渗透出来。B.cereus处理组AKP含量均极显著高于对照组(P<0.01),而B.subtilis和B.atrophaeus在6 h后才与对照组差异显著。
A-B.cereus;B-B.subtilis;C-B.atrophaeus
图6 PPE对芽孢杆菌AKP含量的影响
Fig.6 Effect of PPE on AKP content of Bacillus spp.
2.2.2 PPE对芽孢杆菌MDA含量的影响
MDA是细胞膜脂过氧化程度的重要指标,它的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。其含量高低可从一定程度上说明细胞的健康水平。如图7所示,PPE处理前期(即<3 h时),3种芽孢杆菌MDA含量较对照有升高,但与对照差异不显著,6 h后处理组3种芽孢杆菌MDA含量显著增加,在12 h时,处理组相较对照组MDA含量分别提高2.82倍、1.98倍和1.93倍;对照组变化趋势较为平稳,波动不大。
A-B.cereus;B-B.subtilis;C-B.atrophaeus
图7 PPE对芽孢杆菌MDA含量的影响
Fig.7 Effect of PPE on MDA contentof Bacillus spp.
A-B.cereus;B-B.subtilis;C-B.atrophaeus
图8 PPE对芽孢杆菌Na+-K+-ATP的影响
Fig.8 Effect of PPE on Na+-K+-ATP activity of Bacillus spp.
2.2.3 PPE对Na+-K+-ATP酶活性的影响
ATP作为一种高能磷酸化合物,广泛存在于细菌细胞膜中,主要通过糖酵解途径合成,是细胞最直接的能量载体。Na+-K+-ATP酶在物质代谢以及能量的释放、贮存和利用中发挥关键作用。当细胞受损或发生凋亡时,膜脂质过氧化会抑制线粒体功能,导致Na+-K+-ATP酶合成减少,进而加剧细胞能量代谢障碍[19]。如图8所示,与对照组相比,处理组Na+-K+-ATP酶活性呈时间依赖性下降,B.cereus的Na+-K+-ATP酶活性分别从初始的0.213、0.195、0.203 U/mL显著降至0.072(P<0.01)、0.068(P<0.01)、0.059 U/mL(P<0.01),降幅分别达66.2%、65.1%和70.9%。处理9 h后,3种芽孢杆菌处理组酶活性均极显著低于对照组(P<0.01)。该现象可归因于PPE破坏细胞壁结构,导致细胞完整性丧失,膜内外物质转运中断,从而降低了对Na+-K+-ATP酶的能量依赖,使其合成减少。此外,PPE促使ROS更易进入胞内并作用于ATP,进一步抑制Na+-K+-ATP酶活性。最终,ATP失活使细胞无法通过水解Na+-K+-ATP获得能量以维持基本生命活动,进而导致芽孢杆菌死亡。
2.3 PPE对菌体超微结构的影响
如图9所示,在对照组中,B.cereus呈现典型的杆状形态,表面粗糙,两端平整,周生鞭毛;而经20 mg/mL PPE处理后,菌体出现明显变形和破裂,部分细胞内容物发生外泄。对照组中的B.subtilis同样呈规则杆状,表面具鞭毛,轮廓清晰;经相同处理后,菌体形态严重受损,出现大量细菌聚集及内容物外溢。处理前的B.atrophaeus形态饱满、多呈成对排列,周生鞭毛;而经PPE作用后,菌体明显缩短,形态发生显著改变,周围可见内容物释放,部分菌体出现收缩或凹陷现象。
A-B.cereus;B-B.subtilis;C-B.atrophaeus
图9 PPE对芽孢杆菌细胞形态的影响
Fig.9 Effects of PPE on the structure of Bacillus spp.
上述形态学异常表明,PPE可破坏芽孢杆菌细胞的结构完整性,导致胞内物质外流,从而抑制细菌正常生理活动。
3 讨论与结论
3.1 讨论
3.1.1 ROS累积与膜脂过氧化的关系
ROS(如和H2O2)在正常代谢中作为信号分子发挥作用,但其过量积累会引发膜脂过氧化,破坏细胞膜完整性。PPE处理组芽孢杆菌的H2O2和含量均较对照组显著上升(P<0.01),表明两者过度积累干扰了细菌的氧化还原稳态,提示PPE诱导了明显的氧化应激。王星星等[20]研究发现茶树精油可诱导果蔬采后病原真菌灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)孢子内ROS和菌丝内H2O2的大量积累;丁德东等[21]也发现马铃薯糖苷生物碱处理可显著提高腐皮镰刀菌(Fusarium solani)孢子内H2O2和含量(P<0.05)。同时,上述研究中也得到SOD活性抑制、MDA含量升高和细胞膜完整性破坏等结果,这也可以与本研究结果相互印证。值得注意的是,H2O2的持续积累不仅直接造成氧化损伤,还可能通过激活凋亡相关通路(如SoxRS调节子)加速细胞死亡程序,这为深入解析植物源抗菌剂的分子靶点提供了新视角。
3.1.2 PPE对芽孢杆菌抗氧化防御系统的影响
在细菌的抗氧化防御体系中,SOD、CAT和POD共同构成关键的酶联防御系统,协同维持细胞内氧化还原稳态。本研究表明,PPE处理可显著抑制芽孢杆菌SOD的活性(P<0.01),导致超氧阴离子清除能力降低,进而引起细胞内ROS积累。作为ROS代谢的第一道防线,SOD活性下降阻碍了向H2O2的有效转化,从而加剧氧化应激。作为响应,细菌试图通过上调CAT和POD活性以分解过量生成的H2O2,以维持自由基稳态。然而,随着处理时间延长,CAT与POD的活性亦出现显著下降(P<0.05),表明其抗氧化防御系统最终失效,无法继续有效清除ROS。该结果与杨璟[22]报道脱镁叶绿酸钠可显著抑制樟子松黑点针枯病菌忽视拟盘多毛孢(Pestalotiopsis neglecta)SOD活性并提高PPO活性的结论基本一致;同时,窦勇等[23]研究表明,ε-聚赖氨酸(ε-polylysine,ε-PL)处理可通过显著降低苹果灰霉病菌(Botrytis cinerea)的SOD酶活性,破坏其抗氧化系统。因此,以上例证进一步支持PPE可通过破坏细菌的氧化应激防御系统,引发ROS介导的细胞损伤。
3.1.3 细胞壁完整性受损的证据
AKP是一种特异性分布于细菌细胞壁与细胞膜间隙的关键酶,其独特的定位特性使其成为评估细胞壁完整性的重要生物标志物——只有当细胞壁结构受损时,AKP才会外泄至胞外环境[24-25]。本研究中,经PPE处理的芽孢杆菌表现出AKP活性持续升高的特征(P<0.05),这明确证实了提取物对细胞壁结构的破坏作用。该结果与孙杨等[26]报道的柠檬草精油可引起V.parahaemolyticus的AKP活性上升,细胞边界模糊和内容物流失的抑菌机制高度一致;高娟娟等[27]在枯草芽孢杆菌细菌素A32作用于大肠杆菌E.coli和S.aureus的抑菌机理研究中也得出类似结论。
作为细胞的“能量货币”,ATP通过水解反应为Na+、K+泵等跨膜转运系统提供能量,对维持细胞离子平衡和正常生理功能具有决定性作用。本研究显示,PPE处理导致Na+-K+-ATP酶活性呈时间依赖性下降(降幅达70.9%),提示细胞能量代谢稳态可能因此遭到破坏。该结果与孙杨等[26]有关柠檬草精油降低V.parahaemolyticus ATP酶活性的报道相一致,表明植物源抗菌物质可能通过干扰能量代谢途径发挥抑菌作用。
3.2 结论
综上所述,在PPE处理条件下,3种芽孢杆菌和H2O2过量积累,胞内H2O2水平最高可达对照组的46.3倍,同时显著抑制关键抗氧化酶SOD活性(P<0.01)。尽管CAT和POD酶活性出现代偿性上调(CAT最低增加1.62倍),但仍无法维持细胞内自由基稳态,引发严重的膜脂过氧化反应;SEM扫描电镜证实,3种芽孢杆菌的菌体细胞形态出现塌陷皱缩,细胞边界模糊,胞内物质大量外溢,同步反应为膜损伤标志物MDA含量上升2.82倍,细胞壁完整性指标AKP外泄量增加为对照的5.23倍,表明细胞膜与细胞壁均遭到破坏,进一步阻碍Na+-K+-ATP酶介导的能量转运途径,导致细胞能量代谢紊乱,最终引发细菌凋亡。本研究首次系统阐明,PPE对食源性芽孢杆菌的抑菌作用关键机制在于诱发H2O2过度积累与SOD活性显著抑制,进而启动“氧化应激-结构破坏-能量代谢抑制”的级联反应过程。
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