黄花菜(daylily)又称金针菜,是百合科萱草属的多年生草本植物,为我国传统的药食两用资源,是宁夏地区重要的特色经济作物[1]。其花蕾富含多糖、酚类、膳食纤维及多种生物活性成分,广泛应用于功能性食品开发;其中,黄花菜多糖作为最主要的活性成分之一,已被证实具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、抗炎和降血糖等多种活性[2-3]。近年来研究表明,多糖可作为一种天然益生元,促进肠道中有益菌的增殖,调节微生态平衡。
肠道菌群是人体肠道内的复杂微生态系统,与宿主的营养代谢、免疫调节及疾病预防密切相关。稳定的肠道微生态对维持健康具有重要作用,而菌群失调则与多种代谢性和炎症性疾病相关。益生元是一类不被宿主消化、但能选择性促进肠道有益菌生长或活性的膳食成分,主要包括多糖、低聚糖等[4]。一些植物多糖已被证明在促进益生菌增殖方面发挥着重要作用,芦笋多糖做碳源时可显著促进双歧杆菌和乳酸杆菌的增殖[5];大豆壳多糖在发酵过程中提高了酸化活性,促进副干酪乳酪杆菌、鼠李糖乳酪杆菌和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的生长[6];从籽瓜分离得到的SMP-1、SMP-2和SMP-3 3个多糖组分均能明显促进青春双歧杆菌、长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)、婴儿双歧杆菌以及嗜酸乳杆菌的生长,且不同组分的促生长效果显著不同[7];黄花菜多糖显著提高嗜酸乳杆菌、干酪乳酪杆菌、青少年双歧杆菌和植物乳植杆菌菌株对Caco-2的黏附率,可作为维持肠道健康的潜在活性成分[3]。
目前,针对黄花菜多糖的研究多集中于提取工艺优化,组成成分分析和体外活性评价等方面,其深层结构及对肠道有益菌的调控机制仍不明确。多糖的生物活性与其分子质量、单糖组成、糖苷键类型等结构密切相关,需进一步研究揭示其构效关系。因此,本研究以宁夏黄花菜为原料,提取纯化多糖并初步解析结构,首次系统比较了黄花菜多糖对嗜酸乳杆菌、干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)、长双歧杆菌长亚种和两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)4种代表性益生菌的生长代谢差异;并结合短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)进行代谢层面的评价,深入探讨多糖结构与益生元活性之间的构效关系,为黄花菜多糖作为新型益生元在功能性食品中的开发提供理论依据,同时拓展植物资源在微生态健康领域的应用价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
干黄花菜,产自宁夏吴忠市;石油醚、无水乙醇、95%(体积分数)乙醇、苯酚,上海双双化学试剂有限公司;硫酸、葡萄糖、木瓜蛋白酶、单糖标准[半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、甘露糖、半乳糖醛酸、木糖、核糖、氨基葡萄糖、岩藻糖(色谱纯)],上海源叶生物科技有限公司;嗜酸乳杆菌(CGMCC 1.2686)、长双歧杆菌长亚种(ATCC 15707)、干酪乳酪杆菌(ATCC 393)、两歧双歧杆菌(ATCC 29521),北京菌种保藏中心;MRS琼脂培养基、MRS液体培养基,青岛高科园海博生物技术有限公司;其他试剂均为分析纯。
1.2 主要仪器与设备
SQB分析天平,上海良平仪器仪表有限公司;722 N紫外可见光分光光度计,上海仪电分析仪器有限公司;YHG-400-S真空冷冻干燥箱,上海跃进医疗器械有限公司;HC-3018R台式离心机,安徽中科中佳科学仪器有限公司;SB-5200DTDN数控超声波清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司;600M 液体核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance,NMR)仪,德国布鲁克公司;Agilent1100高效液相色谱仪,美国安捷伦公司;Waters 2695高效液相色谱仪,沃特世公司,Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、GC-MS,美国赛默飞世尔科技公司。
1.3 实验方法
1.3.1 黄花菜多糖的提取与纯化
参考相关方法并作修改[8],干黄花菜粉末用滤纸包裹置于索氏提取器,加入10倍体积石油醚60～70 ℃回流脱脂3 h,20倍体积80%(体积分数)的乙醇溶液85 ℃回流6 h,结束后滤渣自然风干。选定料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1.25、1∶30,g∶>mL)、超声波功率(100、125、150、175、200 W)、提取时间(30、40、50、60、70 min)、提取温度(30、40、50、60、70 ℃)为提取条件,通过单因素结合响应面法确定最优提取工艺,在此基础下,取5 g黄花菜粉末滤渣进行提取,提取液过滤后加入4倍体积无水乙醇,4 ℃醇沉24 h,经4 000 r/min离心10 min,收集沉淀得到黄花菜粗多糖。参考关致敏等[9]方法,粗多糖配成50 mg/mL溶液,加入1.0%(质量分数)的木瓜蛋白酶,50 ℃水浴酶解1 h去除蛋白,反应结束后置于沸水浴中加热15 min 灭酶,冷却后离心,上清液再次进行醇沉、离心、干燥。取黄花菜多糖适量,采用Borui DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂(柱体积为5 mL)进行纯化。上样后,依次使用双蒸水及不同浓度的NaCl溶液(0.2、0.5、1.0 mol/L)进行阶段洗脱,每种洗脱液体积为5倍柱体积。洗脱过程保持流速为0.5 mL/min,每管收集10 min(约5 mL/管)。采用苯酚-硫酸法检测每管洗脱液在490 nm处的吸光度,将吸光度大于0.5的洗脱液视为含多糖组分,合并后进行透析、浓缩及冷冻干燥,最终得到纯化的黄花菜多糖。
1.3.2 多糖结构表征
1.3.2.1 分子质量分析
采用高效凝胶色谱法测定黄花菜多糖的分子质量,以葡聚糖系列(Dextran T-2000至T-5)及葡萄糖(180 Da)为标准品,以各标准品的重均分子质量(Mw)的对数值(lgMw)对其相应的保留时间(tR)进行线性回归,建立标准曲线。精确称取50 mg多糖,用流动相定容至10 mL(质量浓度5 mg/mL),经0.22 μm滤膜过滤后进样20 μL。采用高效液相色谱仪,以UltrahydrogelTM Linear色谱柱(300 mm×7.8 mm I.D.)为分离核心,在流动相0.1 mol/L硝酸钠(NaNO3)、流速0.5 mL/min、柱温40 ℃条件下分析多糖分子质量。
1.3.2.2 单糖组成分析
采用高效液相色谱法分析黄花菜多糖的单糖组成。精确称取0.5 mg多糖样品,加入100 μL 2 mol/L三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)于充氮密封的玻璃水解管中,110 ℃水解4 h。水解结束后,在60 ℃条件下加入0.5 mL甲醇重复蒸干3次,以彻底去除残留TFA,得到干燥的水解产物。分别对混合单糖标准品(各单糖质量浓度约为0.36 g/L)及多糖样品水解液进行衍生化,吸取100 μL单糖标准液或样品水解液,加入100 μL 0.6 mol/L NaOH溶液,混匀后加入50 μL 0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone, PMP)甲醇溶液,涡旋混匀,置于70 ℃烘箱中反应100 min。反应结束后取出,冷却至室温,加入50 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和,再用超纯水定容至1 mL。随后加入等体积氯仿,涡旋混匀,静置分层后弃去下层氯仿相,重复萃取3次以去除过量PMP试剂。最终将水相经0.45 μm微孔滤膜过滤,得到衍生化样品。
色谱条件:采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm I.D., 5 μm),以0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8)-乙腈为流动相进行梯度洗脱,程序如下:0～15 min,乙腈由15%升至20%;15～30 min,乙腈由20%升至25%;30～40 min,乙腈由25%升至30%。柱温为30 ℃,流速1.0 mL/min,检测波长250 nm,进样量20 μL。通过对比单糖标准品的保留时间对样品中各单糖进行定性与定量分析,计算其摩尔比例。
1.3.2.3 液体NMR
将等量的30 mg纯化黄花菜多糖溶于0.5 mL重水中,进行冷冻干燥。残留物再次溶解在0.5 mL的重水中,彻底溶解后转移到NMR管中,置于25 ℃下的600 MHz NMR仪器中进行一维氢谱和碳谱NMR分析。
1.3.2.4 FTIR分析
使用Nicolet iS50型号光谱仪测定多糖的FTIR光谱。精密称2 mg纯化的多糖馏分,加入200 mg干燥的KBr研磨,然后将细粉混合物压成薄片并扫描(400～4 000 cm-1)。
1.3.2.5 扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)分析
将多糖样品直接黏到导电胶上,喷涂金粉。在10 kV 的加速电压下,观察多糖在不同放大倍数下的形貌。
1.3.3 黄花菜多糖益生活性评价
本研究选取的嗜酸乳杆菌、干酪乳酪杆菌、长双歧杆菌长亚种和两歧双歧杆菌4种菌株是肠道中的代表性益生菌,为益生元功效评价研究中广泛采用的菌种。嗜酸乳杆菌与干酪乳酪杆菌是肠道中常见的乳酸菌,具有较强的产酸和耐受能力;长双歧杆菌长亚种与两歧双歧杆菌是双歧杆菌属中的核心菌种,对宿主健康具有重要的调节作用。
参考WICHIENCHOT等[10]的方法,嗜酸乳杆菌、干酪乳酪杆菌在MRS液体培养基厌氧条件(37 ℃,12 h)下活化。长双歧杆菌长亚种和两歧双歧杆菌使用改良的MRS液体培养基活化,其组分为(g/L):蛋白胨10.0,牛肉膏10.0,酵母粉5.0,葡萄糖5.0,K2HPO4 0.45,KH2PO4 0.33,NH4Cl 1.0,MgSO4 7H2O 0.1,L-半胱氨酸0.5,刃天青0.001,Na2S9H2O 0.5,5半胱氨酸,使用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl将pH值调节至6.2～6.6。根据现有文献,选择质量分数为0.5%的低聚果糖(fructooligosaccharides,FOS)作为阳性对照组。实验组则是在无糖的MRS液体培养基中加入不同质量分数的黄花菜多糖(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%,质量分数)作为碳源,接种量4%(体积分数),37 ℃厌氧培养48 h。每3 h随机取样1次,测定培养基的OD值和pH值。
1.3.4 SCFAs分析
将4种益生菌菌株在37 ℃下培养48 h,发酵菌液加入2 mL酸化水(1∶>3磷酸水溶液,体积比),涡旋均浆2 min,冰浴条件下以1 mL乙醚萃取2次(10 min/次,4 000 r/min离心20 min),合并萃取液并浓缩至1 mL后进样分析。采用GC-MS测定样品中SCFAs含量。色谱分离使用TG-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),载气为氦气,流速1 mL/min,分流比75∶>1。程序升温条件:初始100 ℃保持5 min,以5 ℃/min升至150 ℃,再以30 ℃/min升至240 ℃并保持30 min。进样口温度240 ℃,质谱采用电子轰击(electron-impact ionization,EI)离子源(70 eV),离子源温度200 ℃,传输线温度250 ℃。采用选择离子监测(selected ion monitoring,SIM)模式进行定量,定量离子的选择依据为各SCFA在EI源下的特征碎片离子:m/z 60为乙酸、丙酸、正丁酸等直链脂肪酸的分子离子特征碎片;m/z 73为异丁酸、异戊酸、正戊酸等支链脂肪酸的特征离子。
标准曲线:称取0.125 0 g的乙酸,丙酸,异丁酸,正丁酸,异戊酸,正戊酸,于100 mL容量瓶中加入乙醚定容,作为储备液。分别取1.0、0.75、0.5、0.25 mL储备液于100 mL容量瓶,用乙醚定容。配制好后进样分析,绘制标准曲线。以目标SCFA的峰面积(y)对其质量浓度(x, μg/mL)进行线性回归。各SCFA在约31.25～125 0 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好,相关系数(R2)均大于0.999。
1.4 数据处理
每个实验进行3次测定,所有结果表示为“平均值±标准差”,采用SPSS 22.0进行单因素方差分析(ANOVA),使用Origin 2022进行数据统计分析和绘图,P<0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 黄花菜多糖的提取与纯化
超声辅助提取黄花菜多糖最佳工艺条件为:料液比1∶>20(g∶>mL)、超声功率150 W、提取时间50 min、提取温度50 ℃,此工艺下粗多糖的得率为8.86%。采用苯酚硫酸法测定,以葡萄糖为标准品,经DEAE-Sepharose FF离子交换柱层析纯化后,多糖纯度由粗提物的21.12%提高至64.47%。
2.2 结构与特征分析
2.2.1 多糖分子质量分析
采用高效凝胶渗透色谱法测定多糖的分子质量(图1)。以一系列葡聚糖标准品的保留时间(tR)对其重均分子质量的对数值(lgMw)进行线性拟合,获得标准曲线:lgMw=13.5-0.531tR (R2=0.996 2)。根据该曲线计算,样品中主要组分的保留时间为19.58 min,其重均分子质量(Mw)为1 917 Da,Mn为987 Da,分散指数数均分子质量(Mw)/Mn的值为1.94,比值较小,聚合物的分子质量较均匀。
图1 黄花菜多糖分子质量
Fig.1 Molecular weight of daylily polysaccharides
2.2.2 单糖组成分析
采用HPLC分析对黄花菜多糖的单糖组成进行分析,并以标准品为参照进行定性定量鉴定。结果如图2-a、图2-b、表1所示,共检测到11种单糖,其中半乳糖(51.89%)、阿拉伯糖(23.24%)和葡萄糖(13.44%)是主要成分,其余单糖为鼠李糖(3.55%)、葡萄糖醛酸(2.84%)、甘露糖(2.49%)、半乳糖醛酸(1.28%)、木糖(0.79%)、核糖(0.20%)、氨基葡萄糖(0.20%)、岩藻糖(0.08%)。这与刘艺株等[11]研究一致,黄花菜多糖是由多个吡喃糖环结构单元通过糖苷键连接而成的多糖。
表1 黄花菜多糖的单糖组成
Table 1 Monosaccharide composition of daylily polysaccharides
单糖组成相对含量/%外标法含量/%甘露糖2.491.29 氨基葡萄糖0.200.10 核糖0.200.11 鼠李糖3.552.40 葡萄糖醛酸2.842.82 半乳糖醛酸1.280.77 氨基半乳糖——葡萄糖13.449.45 半乳糖51.8924.16 木糖0.790.39 阿拉伯糖23.2411.25 岩藻糖0.080.08
注：—代表无数据。
a-多糖的单糖组成;b-单糖标准品图
图2 黄花菜多糖的单糖组成
Fig.2 Monosaccharide composition of daylily polysaccharides
2.2.3 液体NMR分析
通过NMR对多糖样品进行表征。1H NMR结果如图3-a所示,除4.7 ppm处溶剂峰外,质子信号主要集中在3.0～5.5 ppm,符合多糖的核磁氢谱特征。其中,4.8～5.5 ppm信号属于α构型糖残基,推测存在葡萄糖和阿拉伯糖单元;4.2～4.8 ppm信号对应β构型残基,推测是半乳糖,表明黄花菜多糖同时存在2种构型的残基且残基数量丰富;3.0～4.3 ppm为糖烷基C—H质子多重信号;1.17 ppm处弱峰与鼠李糖的H6相符,其信号强度较弱反映出含量较少,与单糖组成结果一致。
a-1H-NMR;b-13C-NMR
图3 黄花菜多糖的1H-NMR和13C-NMR图谱
Fig.3 1H-NMR and 13C-NMR spectra of daylily polysaccharide
13C NMR谱(图3-b)进一步提供结构信息。173 ppm附近的弱信号为酸性糖的典型羰基特征峰;异头碳出峰区域90～110 ppm内有多组信号,推测109 ppm为阿拉伯糖残基C1,103.77 ppm处的3组信号强度较大,判断为多糖中含量较多的半乳糖残基C1,99.54 ppm为葡萄糖残基C1,95、92 ppm附近的峰推测为游离的单糖;60～85 ppm为糖环碳信号,在80～82 ppm内的强信号推测为半乳糖残基1,3-糖苷键连接以及部分阿拉伯糖残基的C2/C5位;60.35～63.22 ppm的峰归属于未形成糖苷键的环外亚甲基—CH2—;57.40 ppm可能为形成酸性残基位置甲酯的甲基或者存在的甲氧基信号;16.78 ppm信号与鼠李糖C6一致,进一步支持单糖组成分析。
2.2.4 FTIR分析
FTIR分析结果如图4所示,黄花菜多糖呈现出典型多糖类大分子的特征官能团吸收。在3 445 cm-1附近的宽强峰归属于O—H伸缩振动,表明分子间有较强氢键及游离羟基的存在[12];在2 922 cm-1范围内出现的吸收峰为C—H伸缩振动[13];1 656 cm-1的峰对应羧酸根离子拉伸(COO—),表明具有酸性多糖的特性[14];1 426 cm-1左右范围内的吸收峰为C—H弯曲振动产生[15];1 200～800 cm-1的多处强峰为多糖指纹区核心信号,进一步证实碳水化合物的存在[16];在1 065 cm-1左右观察到的峰表明多糖存在吡喃环[17];850 cm-1的尖锐峰确认为α-糖苷键构型的C—H面外弯曲振动,与α-葡萄糖和半乳糖一致的峰形一致。上述结果表明,黄花菜多糖是以吡喃糖环为基本骨架的酸性多糖。
图4 黄花菜多糖的红外光谱
Fig.4 Fourier transform infrared spectrum of daylily polysaccharide
2.2.5 SEM分析
SEM结果如图5所示,在低放大倍数下(5 000×)观察到多糖表面呈片层状,具有分布均匀的纤维状聚集;在高放大倍数下(50 000×、80 000×)多糖表面结构更为清晰,表面粗糙含有许多微小孔隙,结构松散,可能与多糖分子间的相互作用以及超声提取过程中的空化效应有关。
a-5 000×;b-80 000×;c-50 000×
图5 黄花菜多糖的扫描电子显微镜图
Fig.5 Scanning electron micrograph of daylily polysaccharide
2.3 多糖的益生元活性评价
2.3.1 四种益生菌生长拟合曲线
图6-a、图6-b中,嗜酸乳杆菌和干酪乳酪杆菌在18 h达到最大值,24 h后趋于平稳。2种菌在0.5%多糖培养基的增值效果同0.5% FOS相差不大,在1.5%多糖时益生菌的OD值最大,多糖质量分数持续增加,OD值不再升高。图6-c、图6-d中,长双歧杆菌长亚种和两歧双歧杆菌在30 h达到最大值,0.5%多糖增值效果低于0.5% FOS。长双歧杆菌长亚种和两歧双歧杆菌迟滞期较长,生长速度较缓慢,随着多糖质量分数的增加生长速率增加,2.0%多糖对2株菌促增殖效果最好。以上结果说明,黄花菜多糖均能促进4种益生菌生长,表现出良好的益生元活性,对干酪乳酪杆菌和嗜酸乳杆菌增殖效果较长双歧杆菌长亚种和两歧双歧杆菌好,更适合作为乳酸菌的碳源。
a-嗜酸乳杆菌;b-干酪乳酪杆菌;c-长双歧杆菌长亚种;d-两歧双歧杆菌
图6 四种菌的生长曲线
Fig.6 Growth curves of four species
a-嗜酸乳杆菌;b-干酪乳酪杆菌;c-长双歧杆菌长亚种;d-两歧双歧杆菌
图7 不同质量分数多糖对4种益生菌生长过程中pH值变化的影响
Fig.7 Effect of different mass fractions of polysaccharides on pH changes during the growth of four probiotics
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.3.2 不同质量分数黄花菜多糖对4种益生菌pH影响
细菌对碳水化合物的利用情况可通过培养液的pH值变化进行评价,益生菌生长越快产酸能力越强,pH值下降越显著。结果如图7所示,添加质量分数为0.5%～2.0%的多糖和0.5% FOS,4种益生菌培养基的pH均随多糖质量分数增加逐渐降低。与FOS培养基相比,多糖培养基的pH表现出显著差异(P<0.05),嗜酸乳杆菌和干酪乳酪杆菌在质量分数为1.5%的多糖时达到最低pH值,分别为5.05±0.015和4.88±0.02。长双歧杆菌长亚种和两歧双歧杆菌随着多糖质量分数的增加,产酸效果呈现增强趋势,在质量分数为2.0%的多糖时达到最低的pH,分别为5.26±0.02和5.27±0.02。干酪乳酪杆菌培养基最低pH低于其他3种菌,说明黄花菜多糖对干酪乳酪杆菌促产酸能力较强(P<0.05)。
2.4 四种益生菌菌株中SCFAs的产量
SCFAs结果如图8所示,4种益生菌在最佳质量分数多糖培养基中发酵48 h后生成乙酸、丙酸和丁酸。干酪乳酪杆菌的乙酸产量最高(13 219.63 μg/g),显著高于其他菌株(P<0.05);嗜酸乳杆菌乙酸产量为12 353.35 μg/g,而长双歧杆菌长亚种和两歧双歧杆菌的产量相对较低(2 100、1 469 μg/g)。发酵48 h后,嗜酸乳杆菌产生的戊酸、异戊酸含量显著高于其他组(P<0.05)。丙酸、异丁酸和正丁酸在4株菌中的含量都较低。以上结果表明,黄花菜多糖能够促进4种菌株增殖,增加SCFAs的积累,其中嗜酸乳杆菌和干酪乳酪杆菌利用多糖生成酸性代谢物的产量较高。
a-SCFAs组成堆积柱状图;b-乙酸产量
图8 四株益生菌发酵过程中SCFAs变化
Fig.8 Changes of SCFAs during fermentation of four probiotics
3 讨论与结论
肠道与宿主之间通过微生物群落形成紧密的互作关系,共同维持健康稳态并影响整体生理功能。大量研究表明多糖可作为益生元为肠道有益菌提供碳源,增强其代谢活性[18]。多糖的分子质量、单糖组成等对益生元活性有很大影响。黄花菜多糖分子质量较低,且分散指数较小,聚合度越低对益生菌促增值效果越好[19]。YWUNG等[14]研究表明低分子质量多糖更易被益生链长较短更容易被肠道微生物群发酵,促进菌体增殖与代谢。此外,单糖组成也是影响多糖促生长作用的重要因素之一,肠道菌群利用单糖的顺序是阿拉伯糖、葡萄糖、岩藻糖和半乳糖醛酸[20];MEI等[21]研究也表明双歧杆菌和乳酸菌更容易利用半乳糖单元构成的线性链,阿拉伯糖也能特异性刺激菌株的生长。黄花菜多糖单糖组成主要以半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖为主,并含有少量酸性糖,这一组成特征表明其具有良好的益生元活性。
通过生长曲线拟合和pH评价黄花菜多糖对4种益生菌的促生长作用,研究发现嗜酸乳杆菌和干酪乳酪杆菌生长和产酸能力优于长双歧杆菌长亚种和两歧双歧杆菌,这一差异可能与高质量分数多糖导致培养基渗透压升高,对部分菌株产生抑制,但在一定质量分数范围内仍表现出剂量依赖的促生长效应;另一方面可能与不同菌株多糖利用途径有关,干酪乳酪杆菌基因组具有多样化的糖苷水解酶及ABC转运系统,β-半乳糖苷酶和α-阿拉伯糖苷酶等能够高效水解利用多糖,表现出较强的生长能力,与CUI等[22]报道一致,该菌株作为高效产酸菌株,具有大量的碳水化合物利用相关基因;嗜酸乳杆菌有特定的糖苷酶转运系统,能够高效利用黄花菜多糖实现快速生长,与ALIDA等[23]研究相似,蘑菇多糖对嗜酸乳杆菌的益生元作用优于短双歧杆菌。此外,黄花菜多糖含有半乳糖醛酸等特定糖单元,可能调节乳酸菌代谢途径促进碳源的利用和能量的产生[24]。而双歧杆菌对碳水化合物的摄取是通过磷酸烯醇式丙酮酸-磷酸转移酶系统进行的,导致其对多糖的利用效率相对较低,表现为更长的迟滞期和更高的最适促生长浓度[5]。
SCFAs是益生元膳食纤维发酵产生的重要代谢物,主要由乙酸、丙酸和丁酸组成,少量为异丁酸和异戊酸,对人类健康起着至关重要的作用[22]。现有研究表明菊粉、低聚果糖等传统益生元不仅均衡促进乙酸、丙酸与丁酸的生成,还通过肠道菌群间的“交叉喂养”机制,显著增加丁酸的产量[25];黄花菜多糖的体外发酵是乙酸优势型发酵,与WEI等[26]研究相同,双歧杆菌发酵利用牛肝菌多糖主要产生乙酸、丁酸和正戊酸。乙酸被外周组织吸收后可通过转化为乙酰辅酶A进入三羧酸循环直接供能并对肝脏胆固醇代谢调控具有较好的作用[27];丙酸主要在肝脏中参与糖异生并抑制胆固醇合成,丁酸为结肠上皮细胞的重要能量来源[28];此外,嗜酸乳杆菌发酵黄花菜多糖产生较高浓度戊酸与异戊酸,这些支链短链脂肪酸在肠道免疫调节方面具有重要作用[29]。
综上所述,本研究从黄花菜中分离纯化得到多糖,其单糖组成以半乳糖(51.89%)、阿拉伯糖(23.24%)和葡萄糖(13.44%)为主,分子质量为1.917 kDa,并含有α-和β-糖苷键构型;体外实验表明,黄花菜多糖可以促进嗜酸乳杆菌、干酪乳酪杆菌、长双歧杆菌长亚种和两歧双歧杆菌的生长增殖,并代谢产生以乙酸为主的短链脂肪酸,使培养基pH值显著下降,表现出良好的益生元潜力;嗜酸乳杆菌和干酪乳酪杆菌在多糖质量分数为1.5%时表现出最优的增殖和产酸能力,而长双歧杆菌长亚种和两歧双歧杆菌则在2.0%下达到最佳生长状态,这可能与多糖的低分子质量及单糖组成对不同菌株代谢途径的影响有关。本研究系统揭示了黄花菜多糖的构效关系与益生菌生长代谢差异,为其作为新型益生元在功能性食品中的开发提供了理论依据与应用前景。
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