羊肚菌(Morchella esculenta)作为珍稀食药用真菌,其多糖组分羊肚菌多糖(Morchella esculenta polysaccharides,MEP)因其具有显著的抗氧化、免疫调节及抗肿瘤活性,在功能性食品与生物医药领域展现出广阔的应用前景[1-3]。然而,天然多糖因普遍存在高分子质量、高黏度及水溶性不佳等特性,导致其生物利用度较低,极大地限制了实际应用。研究表明,多糖的生物活性与其精细结构密切相关,包括分子质量、单糖组成、糖苷键类型及空间构象等关键参数[4]。因此,在保持主链完整性的前提下,通过物理、化学或生物方法对其进行可控降解,以降低分子质量、暴露活性位点,已成为提升其生物功能并推动高值化利用的有效途径。
在各种多糖改性方法中,超声降解作为一种绿色、高效的物理手段,因其操作简便、无外源试剂引入且条件可控而备受青睐[5-6]。该技术主要依靠空化效应产生的瞬时高温、高压及强烈机械剪切力,在温和条件下精准断裂糖苷键,降低多糖分子质量[7]。近年来,超声降解在多糖改性与生物活性增强方面展现出重要研究价值[8],例如,超声处理可显著降低香菇多糖的分子质量与黏度,并在不改变其三螺旋结构的基础上增强其抗氧化性能;对灵芝多糖的研究也表明,超声降解在维持一级结构不变的同时,可提高其热稳定性并显著增强降血脂与抗氧化能力,这些结果均表明,超声降解在优化多糖结构与功能方面具有重要潜力。
尽管超声降解在多糖改性领域已有大量研究,但目前关于其对MEP理化性质及抗氧化活性的研究仍属空白。基于此,本研究以MEP为对象,系统考察超声降解对MEP分子质量分布、单糖组成、糖苷键构型及微观形貌的影响,并结合对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基清除实验评价其体外抗氧化活性的改变,旨在从结构-功能关联角度阐明超声降解对MEP理化特性及抗氧化活性的影响,为MEP的高值化开发与应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
羊肚菌,购自河南鲜达农业发展有限公司,于2023年6月采收并经热风干燥。葡聚糖(T-3、T-10、T-70、T-110、T-2000),上海源叶生物科技有限公司;单糖标准品(葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖),北京索莱宝科技有限公司;氢氧化钠、氯化钠、过硫酸钾、正丁醇,天津市大茂化学试剂厂;苯酚、四硼酸钠、三氟乙酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;DEAE-52纤维素,北京瑞达恒辉科技发展有限公司;高碘酸钠、琼脂糖凝胶CL-6B、乙二醇,上海麦克林生化科技股份有限公司;体积分数95%乙醇,天津市富宇精细化工有限公司;冰醋酸,江苏无锡市晶科化工有限公司;硫酸,洛阳昊华化学试剂有限公司;三氯甲烷,西安三浦化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
HHS-2S电热恒温水浴锅,上海宜昌仪器筛纱厂;TU-1810紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;TGL-16 H1650高速离心机,常州普天仪器制造有限公司;FS-300N超声波细胞破碎仪,上海生析超声仪器有限公司;安捷伦1260高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪,安捷伦科技有限公司;LC-20AT高效液相色谱仪,QP2010 Ultra气相色谱-质谱联用仪,岛津企业管理(中国)有限公司;Nicolet iS20傅里叶红外光谱(Fourier-transform infrared spectroscopy,FT-IR)仪,美国赛默飞世尔科技公司;ZEISS Sigma 360扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM),德国蔡司;日本Rigaku SmartLab SEX射线衍射(X射线衍射(X-ray diffraction,XRD))仪,日本理学。
1.3 实验方法
1.3.1 MEP的提取
MEP的提取方法根据ZHANG等[9]的文献并略作修改。将羊肚菌粉碎过40目筛,用3倍量无水乙醇室温浸泡24 h,去除脂溶性杂质,随后将脱脂样品置于60 ℃烘箱中干燥至恒重;精密称取脱脂粉末200 g,按料液比1∶>25 (g∶>mL)加入蒸馏水,于85 ℃恒温水浴中提取4 h,提取液经4 000×g离心15 min,收集上清液并加入体积比为1/3的Savag试剂[V(三氯甲烷)∶>V(正丁醇)=4∶>1],充分振荡混匀后静置30 min,4 000×g离心15 min去除蛋白质,重复操作6～7次至无白色沉淀产生;将脱蛋白后的上清液与4倍体积预冷无水乙醇混合,4 ℃静置过夜,4 000×g离心15 min收集沉淀,沉淀用适量蒸馏水复溶后,采用截留分子质量3 500 Da的透析袋流水透析48 h,最后经冷冻干燥获得精制MEP。
1.3.2 MEP超声降解单因素试验
将精制的MEP溶解于适量蒸馏水中,量取50 mL待测溶液置于100 mL烧杯中,于冰浴条件下采用超声波细胞破碎仪进行降解处理,使用直径6 mm的变幅杆探头(尖端浸入液面下2 cm),采用脉冲模式(工作1 s,间歇2 s)控制温升。试验按单因素变量法依次进行:首先在超声功率300 W与超声时间60 min固定条件下,考察MEP溶液质量浓度(2、4、6、8、10 mg/mL)对降解效果的影响;基于此确定的最佳质量浓度,固定超声时间60 min,考察超声功率(50、100、150、200、250、300 W)对降解效果的影响;再基于确定的最佳浓度和最佳功率,考察超声处理时间(10、20、40、60、80 min)对降解效果的影响。所有样品处理后,均通过高效凝胶渗透色谱法测定分子质量变化。
1.3.3 MEP超声降解响应面实验
基于单因素试验结果,设计3因素3水平的Box-Behnken的中心组合实验优化提取工艺,实验因素设计水平见表1。
表1 响应曲面实验因素水平表
Table 1 Response surface test factor level table
水平因素A(溶液质量浓度)/(mg/mL)B(超声功率)/WC(超声时间)/min-132005004250601530070
1.3.4 MEP及其超声降解产物(UMEP)的结构表征
1.3.4.1 多糖分子质量测定
分子质量使用HPGPC进行测定分析[10]。采用HPLC系统配备TSK-gel G4000PWXL色谱柱检测MEP及其超声降解产物的分子质量。待测多糖样品用超纯水配制质量浓度为1 mg/mL,过0.22 μm滤膜后进行测定。色谱条件:流动相为超纯水,流速为0.5 mL/min,柱温为35 ℃,进样体积20 μL,示差折光检测器(RID)温度为40 ℃,洗脱时间为30 min。通过标准葡聚糖 T 系列(T-3、T-10、T-70、T-110和 T-2000)建立校准曲线,采用外标法确定多糖的分子质量分布。
1.3.4.2 单糖组成
采用三氟乙酸水解PMP,柱前衍生化结合HPLC测定MEP及UMEP的单糖组成[11]。精确称取5 mg多糖样品置于1 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液中,密封后120 ℃酸催化水解6 h,水解完成后加适量甲醇溶解产物,经减压蒸发(重复3 次)去除多余三氟乙酸;衍生化采用PMP柱前衍生法,取上述水解产物加入500 μL 0.3 mol/L氢氧化钠溶液和500 μL PMP甲醇溶液(含871.0 mg PMP,甲醇定容至10.0 mL),混匀后避光70 ℃水浴反应1 h,冷却至室温后用0.3 mol/L盐酸中和至中性,再以等量氯仿萃取3 次去除非极性杂质及过量 PMP,收集上层水相;样品经0.22 μm微孔滤膜过滤后,采用HPLC分析,色谱条件为:Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相0.1 mol/L乙酸钠溶液-乙腈(82∶>18,体积比),流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,检测波长254 nm,进样量10 μL。
1.3.4.3 FTIR分析
采用KBr压片法表征MEP及UMEP的官能团结构,精密称取1 mg样品与100 mg光谱纯KBr(1∶>100)研磨混合,压制成透明薄片。使用FTIR仪在4 000～400 cm-1范围内扫描。
1.3.4.4 X射线衍射测定
采用X射线粉末衍射仪表征MEP和UMEP的结晶特性,将干燥样品置于样品架中,经玻璃片压平形成平整表面。测试条件:Cu Kα辐射源(λ=1.540 6 Å),扫描范围3～60°(2θ),步进扫描模式,步长0.02°,扫描速率5°/min,管电压40 kV,管电流30 mA。
1.3.4.5 刚果红实验
采用刚果红络合位移法表征MEP和UMEP的三螺旋构象[12],精密配制2.0 mL 0.5 mg/mL多糖溶液与等体积200 μmol/L刚果红溶液涡旋混合,室温避光静置后逐滴加入1 mol/L NaOH构建0～0.5 mol/L浓度梯度,使用UV-2600分光光度计扫描400～700 nm波长,同步测定多糖-刚果红复合物与刚果红溶液的最大吸收波长(λmax),通过比较波长变化判断多糖是否具有三螺旋结构。
1.3.4.6 碘-碘化钾实验
参照文献[13]方法,检测MEP及UMEP与碘试剂形成的复合物的特征吸收光谱。具体步骤如下:精密量取2.0 mL MEP或UMEP溶液(1 mg/mL,超纯水配制),分别与1.2 mL碘试剂(0.02 g/100 mL I2+0.2 g/100 mL KI)涡旋混合,避光静置30 min(25±1)℃使络合平衡。以空白碘试剂为参比,使用紫外-可见分光光度计在300～800 nm范围内扫描,记录复合物特征吸收峰。
1.3.4.7 多糖样品的表面特征分析
采用SEM观察MEP及UMEP的表面形貌。将多糖样品粉末均匀附着于导电胶上,随后置于离子溅射仪中进行真空镀金处理。在高真空条件下,设置电子枪加速电压为3 kV,对样品进行扫描分析。
1.3.5 抗氧化能力测定
1.3.5.1 DPPH自由基清除率的测定
参考文献[14]的方法稍作修改。精密量取100 μL梯度浓度多糖溶液与100 μL 0.1 mmol/L DPPH无水乙醇溶液(现配避光)混匀,25 ℃避光反应30 min,测定515 nm下的吸光度,以无水乙醇替代DPPH液为本底组,蒸馏水替代多糖液为空白组。DPPH自由基清除率计算如公式(1)所示:
清除率
(1)
备注:A0:为空白组吸光度;A1:为样品组吸光度;A2:为本底组吸光度。
1.3.5.2 ABTS阳离子自由基清除率的测定
参考文献[15]方法稍作修改。将7 mmol/L ABTS溶液与5 mmol/L过硫酸钾溶液等体积混合,避光反应12 h(25 ℃)生成ABTS阳离子自由基储备液。临用前用PBS(pH值7.4)稀释至阳离子自由基734 nm吸光度0.70±0.02。精密量取0.2 mL梯度浓度多糖溶液,加入3.8 mL ABTS阳离子自由基工作液,涡旋混匀后25 ℃反应6 min。立即测定其在734 nm处的吸光度,记为A1;以蒸馏水替代ABTS阳离子自由基工作液,测定吸光度,记为A2;以蒸馏水替代多糖溶液,测定吸光度,记为A0。ABTS阳离子自由基清除率计算如公式(2)所示:
清除率
(2)
备注:A0:空白吸光度;A1:多糖与ABTS阳离子自由基稀释液反应后的吸光度;A2:背景吸光度
1.3.5.3 羟自由基清除率的测定
参照文献方法[16]改良:取1 mL梯度浓度多糖溶液与1 mL 9 mmol/L 硫酸亚铁、1 mL 9 mmol/L水杨酸(体积分数为50%乙醇配制)涡旋混合,迅速加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2启动反应,37 ℃水浴30 min。立即加入0.1 mL 2 mol/L NaOH终止反应。以蒸馏水替代H2O2为背景组,蒸馏水替代多糖液为空白组,于510 nm测定吸光度,羟自由基清除率计算如公式(3)所示:
清除率
(3)
备注:A0:蒸馏水+H2O2的吸光度;A1:样品溶液+H2O2的吸光度;A2:样品溶液+蒸馏水的吸光度。
1.4 数据处理
所有实验均重复 3 次,数据结果用“平均值±标准差”表示。使用IBM SPSS Statistics 24软件对数据进行统计学分析,并用Origin 2018软件绘图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 不同多糖质量浓度对降解效果的影响
超声降解处理后UMEP的平均分子质量随MEP溶液质量浓度的增加呈现先降低后升高趋势[见电子版增强出版附图1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.045506,下同)],这可能是由于在低质量浓度区间(≤4 mg/mL),多糖分子在溶液中分散良好,超声空化产生的局部高温高压环境能够有效破坏分子内糖苷键,导致分子质量下降;而随着MEP溶液浓度的进一步增大,分子间氢键增强和溶液黏度上升抑制了空化效率,并可能引发分子聚集,导致分子质量增加,这与金针菇多糖呈现一致的降解规律[17]。由附图1可知,4 mg/mL时可能是空化作用与分子间相互作用的平衡点,因此选择4 mg/mL为最佳降解MEP溶液质量浓度。
图1 MEP和UMEP的单糖组成
Fig.1 Monosaccharide composition of MEP and UMEP
注:Man:甘露糖(mannose);Rha:鼠李糖(rhamnose);GlcA:葡萄糖醛酸(glucuronic acid);GalA:半乳糖醛酸(galacturonic acid);Glc:葡萄糖(glucose);Gal:半乳糖(galactose);Xyl:木糖(xylose);Ara:阿拉伯糖(arabinose)。
2.1.2 不同超声功率对降解效果的影响
羊肚菌多糖分子质量随超声功率变化呈先降后略升趋势(附图2)。在50～200 W范围内,增加的超声功率通过强化空化效应,降低空化阈值,增加气泡数量,产生高温高压,从而增强分子链断裂和分子间力破坏,导致分子质量降低。当超声功率超过250 W时,空化泡体积浓度超过阈值,引发“饱和效应”。此时,超声探头周围的气泡形成“屏蔽效应”,阻碍能量传递,气泡碰撞导致非球形坍塌,降低能量效率,减少有效降解能量,分子质量下降趋缓,甚至略有回升。基于此,本研究选定250 W为最佳超声降解功率。
图2 MEP和UMEP的FTIR结果
Fig.2 Infrared spectra of MEP and UMEP
2.1.3 不同超声时间对降解效果的影响
羊肚菌多糖分子质量随超声时间先快速下降,后略有回升(附图3)。在超声处理的初期,空化气泡的破裂产生强烈的摩擦作用,这种作用对大分子链尤为明显,导致其快速断裂,分子质量迅速降低;随着超声时间的延长,小分子链占比增加,而空化作用难降解小分子链,降解速率变慢。同时,长时间超声可能因局部环境变化,引发小分子链轻微聚集或交联,导致分子质量后期略有回升,这与金针菇多糖等降解规律及动力学特性一致[17]。
图3 MEP和UMEP的X衍射分析
Fig.3 X-diffraction analysis of MEP and UMEP
2.2 响应曲面法优化超声降解羊肚菌多糖工艺
2.2.1 响应面实验设计与结果
根据单因素试验结果,采用三因素三水平响应面实验对超声降解羊肚菌多糖工艺进行优化,实验设计和结果见表2。
表2 响应面实验设计方案和实验结果
Table 2 Matrix and experiments results of response surface methodology
编号A(溶液质量浓度)B(超声功率)C(超声时间)Y(多糖分子质量)/kDa11-102 522.2521012 535.8230002 652.9240-1-12 522.185-1102 454.7161102 527.5370-112 519.8580002 654.8290002 596.35100002 655.451101-12 539.571210-12 544.00130002 644.0514-1-102 434.2615-10-12 482.57160112 553.5017-1012 504.10
2.2.2 模型的建立及显著性检验
采用Design-Expert 12.0软件进行回归拟合,得到二次多项回归方程为:Y=2 640.718 0+31.745 0A+9.596 3B+3.118 8C-3.792 5AB-7.427 5AC+4.065 0BC-86.591 5A2-69.439 0B2-37.504 0C2
由表3可知,该模型的P值(0.000 5)远小于0.01,表明该实验设计合理,模型能够有效解释因素与响应值之间的关系,结果可信。失拟项的P值为0.797 6,表明模型对数据的拟合是充分的,其他未知因素对实验结果的影响很小,模型的预测能力较好。模型的决定系数R2=0.958 0,表明该模型能解释响应值(Y)95.80%的变异,说明模型拟合效果良好。校正决定系数
虽然
略低于R2,但两者均处于较高水平(>90%),且其差值(0.054)小于0.2,表明模型整体拟合性良好,过拟合风险低,可用于分析和预测羊肚菌多糖的超声降解工艺。变异系数为0.84%,该值远小于10%,表明实验的准确度和重复性非常高,实验操作稳定可靠,结果的可信度强。模型的信噪比为12.273,远大于经验阈值4,表明模型具有良好的分辨能力,能有效区分信号(真实效应)与噪声,适用于工艺参数的预测与优化。本实验中因素B和C的线性项不显著,但其二次项(B2,C2)均显著,这表明因素B和C对响应值的影响并非简单的线性关系,而是存在明显的弯曲(存在最优值点)。综合考虑线性项和二次项的显著性及F值大小,3个因素对羊肚菌多糖超声降解目标(Y)的影响主次顺序为:A(溶液质量浓度)>B(超声功率)>C(超声时间)。
表3 二次回归模型的方差分析结果
Table 3 Analysis of variance for each term of developed quadratic regression model
方差来源平方和自由度均方和F值P值显著水平模型72 939.5198 104.3917.470.000 5∗∗A8061.9618061.9617.650.004 0∗∗B736.701736.701.610.244 7C77.81177.810.170.692 1AB57.53157.530.130.733 1AC220.671220.670.480.509 4BC66.10166.100.140.714 9A231 570.90131 570.9069.12<0.000 1∗∗B220 302.21120 302.2144.450.000 3∗∗C25 922.3215 922.3212.970.008 7∗∗残差3 197.107456.73失拟项652.693217.560.340.797 6净误差2 544.414636.10校正项76 136.6116
注：**表示极显著影响
变异系数(CV)=0.84%。
各两因素交互作用对羊肚菌多糖降解影响的响应面与等值线图(附图4),从图中可以看出,所有3D响应面均呈现开口向下的凸形曲面,且等高线呈椭圆形分布,证实实验设计范围内存在羊肚菌多糖降解的最优工艺参数。因素影响强度分析显示:溶液质量浓度(A)的曲面陡峭度最大,超声功率(B)次之,超声时间(C)最平缓,影响主次顺序为A>B>C,这与之前的方差分析结果一致。总的来看,3个实验因素对多糖降解响应值的影响均不是简单的线性关系,交互项对响应值也有较大影响。
图4 MEP和UMEP的刚果红实验结果
Fig.4 Diagram of Congo red experiment of MEP and UMEP
通过响应面分析软件优化获得羊肚菌多糖超声降解的最优工艺参数为:溶液质量浓度3.06 mg/mL、超声功率200 W、超声时间69.9 min,理论预测多糖分子质量2 421.52 kDa。基于设备可操作性将参数修正为溶液浓度3 mg/mL、超声功率200 W、超声时间70 min。经验证,此条件下多糖分子质量由未降解的2 735.19 kDa降至(2 453.00±4.38) kDa,降解幅度为10.30%,且实测值与模型预测值(2 421.52 kDa)相对误差仅为1.30%,表明该模型(R2=0.958 0)具备高度预测准确性与操作稳定性,由该理论模型得到羊肚菌多糖最优降解工艺是可行的,具有一定的实际应用价值。
2.3 MEP及UMEP的结构表征
图1表明,MEP与UMEP均保持由Man、GlcA、Glc及Gal构成的杂多糖特性,且Glc始终为优势单糖,这表明超声处理是一种温和的物理方法,在降解过程中未破坏糖苷键类型和单糖连接方式,基本保留了MEP的一级结构。这种处理方式不仅保持了多糖的复杂性和功能性,还为优化其应用性能提供了可能性。
2.3.2 FTIR分析
图2结果表明超声降解处理并未改变羊肚菌多糖的基本化学结构,MEP与UMEP均在3 386 cm-1(O—H伸缩振动)、2 930 cm-1(C—H伸缩振动)[18]及1 650 cm-1(酯羧基C
O振动)处呈现典型多糖特征吸收峰,表明糖醛酸结构及羟基、烷基等主要官能团均得以保留;1 416 cm-1处的峰归属于多糖C—H键的弯曲振动特性。1 028 cm-1左右的吸收峰可能源于葡萄糖苷键的C—O—C拉伸振动或侧链C—O—H的弯曲振动,这些特征表明MEP和UMEP中存在吡喃糖结构[19]。579 cm-1处的特征峰也进一步证实了它们为典型的吡喃糖。超声处理后,多糖样品的FTIR图未出现新的特征峰或原有官能团吸收峰的显著位移,说明超声处理未引起多糖分子化学结构的本质改变,尤其是糖苷键类型未发生改变。该结果与单糖组成分析相互印证,共同表明超声降解作为一种物理改性手段,能够在维持多糖基本骨架不变的前提下,通过糖苷键的机械性断裂实现分子质量的调控。
2.3.3 X射线衍射测定
由图3可知,在衍射角(2θ)为10°至30°的范围内,MEP和UMEP均呈现出一个宽泛弥散的“馒头峰”,此为典型无定形(非晶态)多糖物质的特征X射线衍射图谱[20],表明样品中不存在规则、有序的晶体结构,也说明超声降解处理未使MEP从无定形(或半结晶)转变为结晶态结构,基本的聚集态结构类型得以保留。进一步对比衍射图谱发现,MEP的衍射峰强度高于UMEP,说明超声处理降低了分子的有序排列和聚集程度,可能是由于超声空化效应导致分子链断裂和分散,破坏了原有的分子聚集结构。这与超声降解影响岩藻多糖聚集态的研究结论一致[21]。
2.3.4 刚果红实验
刚果红作为可识别多糖三螺旋结构的典型酸性染料,在弱碱性环境下,具有三螺旋结构的多糖能与刚果红形成稳定的络合物,导致光谱中最大吸收波长发生红移。由图4可知,在NaOH浓度为0～0.5 mol/L,MEP与UMEP表现出不同的红移行为,MEP在0～0.3 mol/L NaOH时呈现明显的红移现象(λmax上升),表明其具有稳定的三螺旋构象,该结构主要由氢键和疏水相互作用维持,当NaOH浓度继续升高至0.5 mol/L时,MEP的λmax略有回落,但仍明显高于初始值,说明其螺旋结构在强碱环境下仍保持较好的稳定性。UMEP在0.1 mol/L NaOH时即发生红移且更快达到饱和,同时λmax波动显著,说明其螺旋构象稳定性降低。该结果与红外光谱分析中超声未改变多糖基本化学结构结论高度一致:超声空化效应主要破坏维持三螺旋高级结构的分子间作用力(特别是氢键),导致构象由有序紧密向松散不稳定转变,而多糖的一级结构(糖苷键与官能团)未发生明显化学变化,但糖苷键的精细连接方式可能受到影响。
2.3.5 碘-碘化钾实验
图5的碘-碘化钾实验结果揭示了MEP和UMEP的分支结构特征。实验中,MEP和UMEP均在353 nm 处呈现明显吸收峰,而在565 nm处无吸收,表明二者均具有高度分支的链状结构,主链上连接有较长的侧链,且无淀粉类线性结构污染。超声处理后,UMEP在353 nm处的吸光度较MEP有所上升,但最大吸收峰位未发生偏移,表明超声处理未改变其核心的分支构象,但可能通过空化效应破坏了分子间氢键和糖苷键,导致链断裂和结构松散。这一现象与人参多糖[22]的超声降解行为一致,说明超声作为一种物理改性手段,可在保持多糖复杂分支结构的前提下,降低分子质量、提高溶解性和功能性质。
图5 MEP及UMEP的碘-碘化钾反应的紫外吸收光谱
Fig.5 UV absorption spectra of the iodine-potassium iodide reaction of MEP and UMEP
2.3.6 MEP和UMEP的表面形态
如图6所示,通过SEM对MEP(图6-A～图6-C)与UMEP(图6-D～图6-F)的微观形貌进行了观察与比较。结果显示,未处理的MEP表面相对平整、结构致密,存在少量聚集碎片;相比之下,经超声降解后,UMEP呈现显著的结构松散、破碎及多孔化特征,尤其在较高倍数下可清晰辨识蜂窝状多孔结构及明显裂纹。该形态转变主要源于超声过程中空化气泡溃灭所产生的强烈机械剪切力与瞬时高压,引起糖苷键断裂,进而导致多糖分子链解聚和表面侵蚀。此外,这类结构变化显著增大了多糖的比表面积,有助于活性基团的暴露,从而有望提升其功能特性,如溶解性、吸附能力及生物活性。本研究结果与多项文献[23-24]中超声波处理多糖所引起的微观结构变化规律相吻合,进一步证实超声处理是一种高效且环保的物理改性策略,可在维持多糖一级结构稳定的前提下,通过控制超声参数定向其理化性质与生物活性。
A-MEP;B-UMEP
图6 MEP和UMEP的电子显徽镜图像
Fig.6 Electron microscope images of MEP and UMEP
注:1～3分别为500×、1 000×、3 000×的图像。
2.4 MEP和UMEP的抗氧化活性
自由基过量是诱发多种疾病的重要因素,多糖类化合物因其显著的抗氧化能力而备受关注。图7结果表明,MEP及UMEP对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基及羟自由基的清除率均随质量浓度升高而增加,呈现明确的剂量依赖关系,且UMEP在所有测试体系中的抗氧化活性均优于MEP。该结果与既往在黑加仑多糖、香菇多糖[8]等研究中观察到的降解后抗氧化增强现象一致。结合结构表征结果,其活性增强机制可归结为以下3个方面:首先,分子质量从2 735.19 kDa降至2 453.00 kDa,链长缩短使分子运动自由度增加,有利于活性基团与自由基的接触反应;其次,SEM显示微观形貌由致密块状转变为多孔碎片状,比表面积增大暴露了更多还原性末端和羟基,进一步提升了与自由基的接触效率;最后,刚果红实验证实三螺旋结构解离,由有序构象转变为松散构象,使原本包裹在螺旋内部的活性位点得以释放,增加了自由基清除位点,而FTIR证实羟基等官能团未被破坏,这些结构变化协同促进了电子或氢原子的供给能力,从而显著提升自由基清除效率。
A-ABTS阳离子自由基清除率;B-DPPH自由基清除率;C-羟自由基清除率
图7 MEP和UMEP的抗氧化活性
Fig.7 Antioxidant activities of MEP and UMEP
3 结论
本研究通过响应面法优化获得羊肚菌多糖超声降解最佳工艺参数:溶液浓度3 mg/mL、超声功率200 W、超声时间70 min,在此条件下,UMEP的平均分子质量为 (2 453.00±4.38) kDa,与模型预测值(2 421.52 kDa)的相对误差仅 1.30%,降解幅度达 10.30%,证实该工艺具有良好的可控性与可靠性。结构表征表明,超声降解在基本保留MEP单糖组成和官能团等基本化学结构的前提下,有效降低了其分子质量,并引起高级结构与微观形貌的显著变化,具体表现为三螺旋构象趋于松散、表面形态由致密平整转变为疏松多孔。抗氧化活性评价显示,UMEP对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基的清除能力均显著优于未处理MEP,其机制主要归因于分子质量降低、比表面积增大及活性基团暴露增多。本研究结果证实,超声降解是一种绿色且高效的物理改性策略,能够通过调控多糖的高级结构(如分子质量、构象与形貌)来提升其生物活性。
尽管如此,目前关于UMEP精细结构(如糖苷键构型)的解析尚不深入,且缺乏系统的细胞与动物体内生物利用度及功效评价,对于该降解工艺的长期稳定性与规模化生产可行性也尚未验证。下一步研究将重点利用甲基化分析与核磁共振技术阐明其精细结构与构效机制,开展系统的体内外功效评估,并探索其工业化生产潜力,以推动羊肚菌多糖在功能性食品及生物医药等领域的广泛应用。
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