高温大曲作为酱香型白酒酿造的核心糖化发酵剂,其复杂的微生物群落通过协同代谢活动,直接影响白酒的风味品质与风格形成[1]。在高温制曲工艺条件下,微生物群落经历剧烈演替,产生丰富的酶系及风味前体物质[2]。其中,吡嗪类化合物是赋予酱香型白酒典型坚果香和烘焙香的关键风味组分,以四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine,TTMP)为代表[3]。已有研究揭示了高温大曲的微生物多样性及其部分风味物质组成,但关于TTMP生物合成的前体代谢途径,尤其是关键功能微生物的驱动机制及其在发酵与陈化全过程中的动态变化规律,仍有待深入解析[4-6]。
现有研究已证实,TTMP的生物合成高度依赖于前体物质乙偶姻的合成及氨基酸残基的释放[7]。然而,在高温大曲这一独特发酵体系中,支撑乙偶姻关键生成途径及促进氨基酸残基有效释放所依赖的具体遗传基础及其核心功能微生物,仍缺乏深入研究。同时,多数研究聚焦于单一发酵时间点的静态分析[8],未能系统追踪整个发酵周期至陈化阶段中,关键理化参数(如酶活力、水分、酸度)、特征风味物质(特别是TTMP)的动态变化、微生物功能基因表达谱(如碳水化合物/氨基酸代谢相关基因)与微生物群落之间复杂的协同变化规律及其关联性。此外,传统培养方法在揭示高温大曲复杂微生物群落(尤其是其中大量的不可培养微生物)的特定功能方面存在显著局限[9]。尽管宏基因组学技术为深入解析未培养微生物的功能潜力提供了强大工具,但该技术在系统阐明高温大曲特征性风味物质TTMP合成全过程的微生物驱动机制方面,尚未得到充分应用[10]。
因此,本研究以高温大曲为对象,整合理化分析、挥发性代谢物检测与宏基因组学技术,构建了全面的分析体系;系统追踪了发酵与陈化全过程中理化性质和酶活力指标的动态变化,解析挥发性化合物的阶段性积累特征;并基于碳水化合物活性酶数据库(Carbohydrate-Active enZYmes Database,CAZy)、KEGG等数据库进行功能基因注释与代谢通路重构,揭示了TTMP的2种关键前体物质——乙偶姻合成与氨基酸残基释放的核心代谢途径,以及由此驱动的功能微生物群落演替规律。本研究旨在阐明高温大曲中TTMP形成的微生物机制,为定向调控大曲品质提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
本研究所用高温大曲样品由甘肃滨河食品工业(集团)有限责任公司提供。其酿造工艺以小麦为主要原料,经与母曲接种混拌、模具压制成型后,置于标准化曲房进行为期45 d的自然发酵。发酵期间于第10天与第20天分别进行翻曲操作。发酵结束后,大曲转入库房陈化3～4个月后投入使用。
为系统解析高温大曲制作全过程中理化指标和挥发性风味物质的变化规律,本研究团队系统采集了4个关键发酵阶段[即发酵第0天(d0)、第1次翻曲(d10)、第2次翻曲(d20)和发酵终点(d45)]和3个陈化阶段[即陈化1个月(z1)、陈化2个月(z2)和陈化3个月(z3)]的代表性样品。采样方案采用空间多点取样策略,覆盖曲房内具有代表性的不同微环境区域(包括中心区、边缘区及通风口邻近区域)[11]。所采集样品经标准化粉碎处理及充分均质化混合后,分装并分别贮存于-4 ℃(用于后续风味物质与理化指标分析)和-80 ℃(用于微生物研究等),以确保实验材料的一致性与分析可靠性[12]。
主要化学试剂:氢氧化钠、葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、苯酚、过硫酸钠、谷氨酸、水合茚三酮、氯化亚锡、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、淀粉、冰乙酸、无水乙酸钠、环己酮(纯度>99%)、乳酸乙酯(纯度>99%)。以上试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.2 仪器与设备
DZF-0B电子天平,北京中兴伟业;101-1干燥箱,上海浦东跃欣科学仪器厂;ZYMICR0-Ⅲ 20T超纯水机,四川卓越水处理设备有限公司;LPH-A实验室pH计,北京兰杰柯科技有限公司;CF1524R台式高速微量冷冻离心机,赛洛捷克;HH数显恒温水浴锅,江苏金城国胜仪器;721可见分光光度计,上海佑科仪器仪表有限公司;7890B气相色谱仪、7890B-5977B气相色谱质谱联用仪,美国Agilent;NanoDrop 2000微量分光光度计,美国Thermo Scientific。
1.3 实验方法
1.3.1 大曲理化指标、酶活力和挥发性代谢物测定方法
大曲的理化指标、酶活力及挥发性代谢物的测定均参照YANG等[13]的方法。
1.3.2 大曲总DNA提取和宏基因组测序
准确称取10.0 g高温大曲样品,经液氮充分研磨均质化后,采用土壤基因组DNA提取试剂盒提取总DNA[14]。通过1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳评估DNA完整性,并使用NanoDrop 2000微量分光光度计检测DNA纯度(A260nm/A280nm、A260nm/A230nm值)及浓度[15]。符合质量要求的DNA样品经干冰速冻后寄送至上海凌恩生物科技有限公司,基于Illumina HiSeq X Ten测序平台进行宏基因组双端测序(PE150)。
采用Trimmomatic (v0.39) 对原始测序数据执行质控过滤(参数:ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:30:10 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:75),依次去除接头序列与引物二聚体,动态修剪3′端质量值低于Q20的碱基(残留碱基质量值
1.4 统计与分析
高温大曲的理化指标、酶活力及挥发性代谢物相对含量测定结果,均以3次平行实验的“平均值±标准差”表示。采用 Origin 2024 软件绘制柱状图与聚类热图,直观展示上述指标的动态变化。基于高温大曲不同发酵阶段所有主要挥发性化合物(置信度>80%)的相对含量数据矩阵,在R语言环境(v3.3.1)中调用 vegan(v2.5-3)和 ggplot2 包进行主成分分析(principal component analysis,PCA),以直观呈现样本间挥发性代谢物谱的整体差异及聚类模式。
比较特征时间点(d0、d10、d45、z3)样本中特定功能基因或代谢通路的标准化丰度,分析其动态变化。使用R语言VennDiagram包绘制特定代谢通路(丙酮酸代谢、亮氨酸降解)在不同时间点样本间共有及独有基因数量的Venn图,展示基因组成的时间特异性和相似性。针对目标代谢通路(丙酮酸代谢、亮氨酸降解),提取注释到该通路的所有基因及其对应的物种分类信息(属水平)。根据各属在这些通路基因总丰度中的占比,确定不同发酵阶段的关键功能微生物。
2 结果与分析
2.1 高温大曲制作全过程理化和酶活力指标的动态变化
高温大曲制作过程中理化及酶活力指标的变化情况如图1所示,整体呈现2阶段演化特征:发酵期各指标呈现显著动态波动;进入陈化期后,各指标则趋于稳定,大曲微生物代谢活动显著减弱。
a-水分;b-酸度;c-还原糖;d-氨基酸态氮;e-液化力;f-糖化力;g-酯化力
图1 高温大曲制曲过程中理化指标与酶活力的动态变化图
Fig.1 Dynamic changes of physicochemical parameters and enzyme activities during high-temperature Daqu fermentation
注:d0～z3为高温大曲制作全过程。
大曲的水分含量初始值为(38.15±0.31) g/100 g,发酵期急剧下降至(10.96±0.46)g/100 g,陈化期维持动态平衡,稳定在约10%水平波动,符合出库标准。酸度初始值为(0.95±0.02) mmol/10 g,至发酵终点降至(0.51±0.04) mmol/10 g,进入陈化期后呈现先回升后下降的波动特征。还原糖初始含量为(40.18±1.55) g/kg,其变化受糖化酶作用与微生物消耗的动态协同影响,整体呈现“下降-回升-再下降”的3阶段波动模式[16]。氨基酸态氮在发酵前10 d快速积累,由初始含量(4.14±0.25) g/kg升至(23.28±0.41) g/kg,为微生物增殖及风味前体物质合成提供了充足的氮源,后期因微生物利用与蛋白质降解速率达到动态平衡,其含量进入相对稳定的波动阶段[17]。
在酶活力方面,液化力、糖化力和酯化力作为评价大曲质量的三大关键酶系活力指标,分别表征原料液化能力、淀粉分解效率和风味物质合成能力[18]。发酵前10 d,液化力与糖化力分别下降48.15%与59.80%,主要归因于高温环境下固有淀粉酶系的热失活,以及此阶段大曲微生物群落演替与代谢产酶(特别是耐热酶系)尚未达到稳定状态[19]。与之相反,酯化力随发酵进程持续增强,至发酵终点提升至初始值的7.14倍,这与产酯酶微生物的生长繁殖和代谢活动增强相关。发酵终点时,三大酶活力分别为:液化力为(0.656±0.088) g/(g·h),糖化力为(259.35±20.58) mg/(g·h),酯化力为(170.35±4.12) mg/(50 g·7 d)。进入陈化期,各酶系活力整体维持稳态波动。
2.2 高温大曲制作全过程挥发性代谢物变化情况
采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC/MS)技术解析高温大曲发酵与陈化全过程的挥发性代谢产物。如图2-a所示,发酵过程中共检出置信度>80%的主要挥发性化合物42种,包括酯类(14种)、吡嗪类(4种)、醇类(4种)、醛类(7种)、呋喃类(2种)、烷烃类(8种)和烯烃类(3种)。而陈化过程样品中主要挥发性化合物减少至23种(置信度>80%),分别为酯类(9种)、吡嗪类(1种)、醇类(2种)、醛类(4种)、呋喃类(1种)和烷烃类(6种)。值得注意的是,TTMP作为关键风味物质,在整个高温大曲制作过程中持续检出,其浓度随发酵时间呈动态变化(图2-b)。
a-不同阶段挥发性化合物特征谱图;b-TTMP浓度动态变化;c-PCA
图2 高温大曲制曲过程中挥发性代谢产物的特征分析图
Fig.2 Characteristic analysis of volatile metabolites during high-temperature Daqu fermentation
进一步通过PCA比较挥发性代谢物的表达模式差异(图2-c)。结果显示,发酵第0天样品形成独立簇群,第20天和第45天的样品聚类为另一簇群,第10天的样品在降维空间中的位置分布与前两者相距较远。进入陈化期后,所有样品聚集成另一簇群,此阶段微生物代谢活动显著减弱且缓慢,加之风味物质持续挥发,导致检出的风味成分的种类和含量相对较低。
2.3 高温大曲中功能基因注释与代谢潜力分析
基于大曲样品在理化性质、酶活性及挥发性代谢物方面的差异,选取编号为d0、d10、d45以及z3的样品进行宏基因组分析。将宏基因组测序得到的基因序列,分别比对注释至CAZy、KEGG数据库,以解析高温大曲制作过程中关键时间点的主要代谢功能变化[20]。
2.3.1 CAZy基因注释分析
基于CAZy数据库对比的结果如图3所示。在572 281个非冗余基因中,共有25 171条基因(4.40%)获得明确功能注释,对应321种CAZymes。这些酶涵盖六大类:糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GHs)127种、糖基转移酶(glycosyltransferase,GTs)77种、多糖裂合酶(polysaccharide lyases,PLs)26种、碳水化合物酯酶(carboxylesterase,CEs)17种、碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding modules,CBMs)59种及辅助氧化还原酶(auxiliary activities,AAs)15种。
图3 基于CAZy数据库的高温大曲特征时间点碳水化合物活性酶功能注释累积柱状图
Fig.3 The stacked bar plot of carbohydrate-active enzyme functional annotation in high-temperature Daqu characteristic samples based on CAZy database
发酵第0天检测到的CAZymes相对丰度最高,这主要源于原料本身携带的丰富酶系及初期微生物为快速适应环境、分解底物而大量合成的CAZymes[21]。随着发酵进程推进,微生物群落演替与环境参数变化导致CAZymes丰度呈现波动。至发酵后期及陈化阶段,因微生物活性减弱、环境趋于稳定、底物格局固化,CAZymes合成与降解达到动态平衡,丰度趋于稳定。
同时,在整个高温大曲制作过程中,GHs丰度始终占据主导地位,而PLs丰度水平最低。这一现象与酶的功能特性及工艺需求密切相关:GHs作为核心糖化酶系,直接水解淀粉、纤维素及半纤维素(如木聚糖、β-葡聚糖)中的糖苷键,为酒精发酵提供必需的可发酵糖[22]。而PLs专一性降解果胶等酸性多糖,但由于该类底物在谷物原料中的丰度较低,故其降解过程对于糖类生成的贡献甚微[23]。这些CAZymes在白酒酿造中发挥不可替代的作用,凭借其高温耐受性、微氧适应性及酸性环境稳定性,高效分解高粱、小麦等谷物中的复杂碳水化合物,驱动后续酒精发酵进程。
2.3.2 KEGG通路基因注释分析
基于KEGG数据库对高温大曲制作过程特征点样品进行功能注释。图4展示了基于KEGG代谢通路相关功能基因在一级、二级分类水平上的分布情况。
图4 基于KEGG数据库的高温大曲特征时间点代谢通路功能注释
Fig.4 Functional annotation of metabolic pathways in high-temperature Daqu characteristic samples based on KEGG database
根据KEGG数据库一级分类,所有注释基因归属于五大功能类别:细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、新陈代谢以及生物体系统。分析显示,在特征点微生物群落的代谢活动中,新陈代谢途径占据主导地位,其次为遗传信息处理。
在二级分类水平上,共注释到34条代谢通路。其中,全局与概览图的注释基因数量最多,达153 798条;碳水化合物代谢和氨基酸代谢亦位居前列,注释基因数量分别为34 632条和26 316条。这表明高温大曲微生物群落中编码碳水化合物和氨基酸代谢途径的功能基因丰度较高。大曲原料富含淀粉、蛋白质等大分子物质,其微生物群落能够高效降解这些底物,生成氨基酸、还原糖等关键代谢产物[24]。这些代谢产物不仅为微生物自身生长代谢提供物质基础,同时也是酯类、酸类等风味物质或其前体物质的重要来源,最终对白酒风味特征的形成具有决定性影响。
2.4 高温大曲中TTMP形成途径解析及关键功能微生物确定
除乙偶姻外,微生物发酵合成TTMP还高度依赖于游离氨的有效供应。其中,乙偶姻的生物合成主要依赖于丙酮酸代谢途径中的α-乙酰乳酸支路,游离氨则主要来源于氨基酸(尤其是支链氨基酸)的脱氨基反应[25]。研究表明,高温大曲富含蛋白质,经蛋白酶水解产生大量游离支链氨基酸,其中亮氨酸等是其中的主要支链氨基酸[26]。这些支链氨基酸的降解不仅能释放氨,还能同时提供乙酰辅酶A前体,实现了供氨和供碳的协同作用[27]。因此,深入解析丙酮酸代谢途径和支链氨基酸降解途径(以亮氨酸/异亮氨酸/缬氨酸降解途径为例,后简称亮氨酸降解)的基因组成及其驱动的功能微生物群落,将有助于阐明高温大曲中特征风味物质TTMP形成的微生物学基础。
2.4.1 丙酮酸、亮氨酸代谢途径的基因组成
如图5所示,为表征丙酮酸代谢(图5-a～图5-b)与亮氨酸降解(图5-c～图5-d)途径在高温大曲发酵过程中的基因丰度动态,采用柱状图对特征时间点的相关基因数目进行了可视化分析。同时,为直观反映不同发酵时期样品间基因组成的相似性与独特性,采用Venn图解析了2条代谢通路在不同时期样品间共有及独有基因的分布格局。在检测的高温大曲样品中,参与丙酮酸代谢和亮氨酸降解的基因总数分别为3 694个和2 437个。值得注意的是,2条代谢通路的基因数目随发酵进程展现出高度一致的波动模式。
a-丙酮酸代谢基因数目;b-丙酮酸代谢基因Venn图;c-亮氨酸降解基因数目;d-亮氨酸降解基因Venn图
图5 高温大曲特征时间点丙酮酸代谢与亮氨酸降解途径的基因分析
Fig.5 Gene analysis of pyruvate metabolism and leucine degradation pathways in high-temperature Daqu at characteristic time points
具体而言,发酵第0天,2条通路的基因数量均处于最低水平,呈现为初始基因状态。至发酵第10天,伴随着微生物群落的快速增殖与代谢活性的急剧增强,2条途径的基因数量快速增长并达到峰值。此时涌现出大量发酵中期特异性基因,显著区别于初始基因库。丙酮酸代谢和亮氨酸降解在此阶段的代谢通量达到最高水平,发酵第10天是驱动乙偶姻合成、游离氨基酸脱氨及后续TTMP形成的核心关键期。至发酵后期(d45)及进入贮存阶段(z3),通路的基因组成相似性显著提高,共有基因交集大幅增加,可推测相关的功能微生物群落结构在发酵后期已趋于稳定。陈化过程本质上是发酵后期微生物代谢活动的延续,由核心功能微生物主导的特定功能基因持续表达所维系[28]。相比之下,发酵起始点样品与后期(d45及陈化期)样品间的基因交集有限,初始原料携带的微生物及其基因在发酵早期的激烈微生态竞争中逐渐被淘汰,其生态位与代谢功能被后续演替的优势微生物群落及其功能基因组取代[29]。
2.4.2 丙酮酸代谢和亮氨酸降解途径的功能微生物组成
高温大曲的成熟依赖于特定环境下微生物群落的协同作用。明确参与丙酮酸代谢和亮氨酸降解的功能微生物,对揭示TTMP的形成机制至关重要。基因组丰度分析(图6)表明,高温大曲中参与这2条代谢通路的主要优势微生物包括克罗彭斯特菌属(Kroppenstedtia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、丝状真菌属(Rasamsonia)以及曲霉属(Aspergillus)等,这与既往研究一致[30]。值得注意的是,这些功能微生物的基因丰度在不同时期呈现显著的动态变化,且2条途径的优势微生物演替展现出显著的同步性与阶段性差异。
a-丙酮酸代谢;b-亮氨酸降解
图6 高温大曲关键时间点相关途径功能微生物的TPM丰度变化
Fig.6 TPM abundance of functional microorganisms in relevant pathways at key time points of high-temperature Daqu
发酵第0天,丙酮酸代谢主要由糖多孢菌属(Saccharopolyspora)和魏斯氏菌属(Weissella)主导,而亮氨酸降解则以Saccharopolyspora和Bacillus为主。Saccharopolyspora在2条通路初期均占主导地位,暗示其在早期碳氮代谢中扮演重要角色[31]。至发酵第10天,海因德里克氏菌属(Heyndrickxia)在2条通路中均占据绝对优势地位,表明其在此阶段代谢活动高度活跃。此时TTMP浓度出现显著累积,直接对应乙偶姻生成和氨基积累的关键窗口期。Heyndrickxia的活跃代谢是驱动这一协同过程的核心动力。至发酵第45天及陈化阶段,宏基因组丰度分析显示,Kroppenstedtia取代Heyndrickxia,成为2条代谢通路共同的主要功能执行者。然而,考虑到陈化期水分含量已显著降低,微生物整体代谢活性受到严重抑制,此时Kroppenstedtia虽在基因丰度上占优,但其实际代谢贡献可能有限[32]。陈化期TTMP的稳定与风味熟化可能主要依赖于非生物转化过程(如美拉德反应)及前期积累的代谢产物,Kroppenstedtia在此阶段的实际代谢贡献有待通过宏转录组学等技术进一步验证。
此外,在高温大曲制作过程中出现的其他优势功能菌属,如Bacillus、Rasamsonia、Aspergillus等,虽然在特定时间点丰度并非最高,但作为整体群落的组成部分,它们在整个发酵过程中可能通过协同或竞争作用,间接影响核心功能微生物(如Heyndrickxia和Kroppenstedtia)的代谢活性,共同塑造了TTMP生成的微生态环境。
2.4.3 高温大曲中TTMP形成途径预测
基于宏基因组数据,进一步预测了高温大曲中TTMP的生物合成途径,包括相关的关键酶和来源微生物(图7)。首先,2分子丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶(即EC 2.2.1.6)作用下缩合生成α-乙酰乳酸。该酶主要来源于Heyndrickxia和Kroppenstedtia等细菌属,亦有少量真菌属参与。随后,α-乙酰乳酸脱羧酶(即EC 4.1.1.5)催化α-乙酰乳酸脱羧,生成乙偶姻。此转化主要由Bacillus、Weissella和Limosilactobacillus共同承担。游离氨基的供给依赖于氨基酸脱氢酶(如亮氨酸脱氢酶,EC 1.4.1.9)和支链氨基酸转氨酶(EC 2.6.1.42),这一过程同样主要由Kroppenstedtia、Heyndrickxia等细菌属驱动。热图显示,EC 2.2.1.6、EC 1.4.1.9和EC 2.6.1.42编码微生物在发酵第10天以Heyndrickxia为主,至发酵后期则转由Kroppenstedtia主导。该动态变化与丙酮酸代谢途径和亮氨酸降解途径的时序特征一致,进一步强调了Heyndrickxia和Kroppenstedtia在高温大曲TTMP生物合成途径中的功能分类。
a-为丙酮酸代谢支路(a1、a2-分别为酶EC 2.2.1.6和酶EC 4.1.1.5的注释微生物来源及其丰度变化);b-为亮氨酸降解支路(b1、b2-分别为酶EC 1.4.1.9和酶EC 2.6.1.42的注释微生物来源及其丰度变化)
图7 高温大曲中TTMP形成途径预测
Fig.7 Prediction of tetramethylpyrazine formation pathway in high-temperature Daqu
注:热图表示注释微生物的来源及其丰度变化。
3 结论与讨论
本研究通过整合理化分析、挥发性代谢物检测与宏基因组学技术,系统揭示了高温大曲中TTMP合成的微生物驱动机制与动态规律。结果表明,TTMP的合成是由具有特定代谢功能的微生物群落,依时序演替规律协同驱动的复杂过程。具体而言,发酵第10天Heyndrickxia成为优势菌属,通过主导丙酮酸代谢与亮氨酸降解途径,驱动乙偶姻合成与氨基释放,直接促进了TTMP的快速积累;而在发酵后期与陈化阶段,Kroppenstedtia取代其成为优势菌属,可能对维持相关代谢功能的延续具有潜在作用。
值得注意的是,基于宏基因组学所揭示的微生物“功能潜力”与其在特定环境下的“实际代谢活性”可能存在差异。未来的研究应着力于整合宏转录组学与代谢组学技术,旨在直接监测关键功能基因的表达动态与代谢通量变化,从而在实时代谢活性层面精确验证各阶段核心微生物的功能角色。同时,需进一步量化非生物转化在TTMP合成与风味熟化过程中的贡献,以全面、精确地揭示TTMP合成的完整调控网络,为定向调控大曲风味品质提供更坚实的理论依据与实践策略。
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