张良姜(Zingiber officinale var.zhangliang)为姜科姜属多年生草本植物,主产于河南省鲁山县张良镇。其皮肉深黄、气味辛辣芳香、质实丝多、久储不腐,享有 “姜中之王”的美誉[1]。张良姜富含姜黄素、姜辣素、挥发油、微量元素硒等活性成分,在抑菌、抗炎、抗氧化、抗癌等方面具备一定药用价值[2]。特别是其富含的精油,气味浓郁芳香,是衡量其品质的关键指标之一[3]。但因张良姜精油具有挥发性、不稳定性和低水溶性等特性,极大限制了其实际应用效果,故而开发有效的精油封装体系尤为重要。
脂质体是由一个或多个磷脂双层包围水核组成的纳米级球形囊泡,是由分散在水溶液中的磷脂形成的球形中空结构。在结构上,脂质体与生物膜相似,具有优良的生物相容性和生物降解性[4]。此外,由于脂质体不仅可以包埋水溶性物质,还能同时包裹油溶性的物质[5],在包埋精油领域展现出其独有的优势。因此,可以通过脂质体包埋技术将精油包裹在脂质体中,增强精油的稳定性,提升其生物利用率,使其在抗菌、抗炎以及抗氧化等方面发挥作用。
目前,有很多关于脂质体包封不同精油的研究。GAN等[6]制备的柠檬草精油双层脂质体,能有效延缓鸡肉中总细菌数量的增长。CUI等[7]开发出一种山苍子精油脂质体,在4 ℃条件下延缓了鲑鱼的氧化,并控制了副溶血弧菌的生长,具有显著的抗氧化、抗炎和抗菌活性。公丕森[8]通过乙醇注入法-超声波法,以卵磷脂和β-谷甾醇为壁材对生姜精油进行包埋,确定了生姜精油脂质体的表征、稳定性和抗氧化性能。这些研究均显示出不同植物精油通过脂质体包埋后提高了生物利用度,但目前关于脂质体包埋张良姜精油的研究尚未有报道,因此,为了探究张良姜精油脂质体的理化性质和功能特性,本研究采用水蒸气蒸馏法提取张良姜精油,并以卵磷脂和胆固醇为壁材,通过薄膜分散法制备脂质体作为精油的封装体系对其进行包埋,同时探究张良姜精油脂质体的粒径、多分散指数(polydispersity index,PDI)、Zeta电位和包封效率,并通过热稳定性、贮存稳定性实验及抑菌活性实验评估其生物利用度,为解决张良姜精油的后续应用拓宽了思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
张良姜,由平顶山市农业科学院提供;卵磷脂(纯度≥90%)、胆固醇(纯度≥96%),阿拉丁生物科技有限公司;DPPH、ABTS,上海麦克林生化科技有限公司;大肠杆菌(ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC 29213),河南城建学院健康食品生物制造团队。其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
RE-52A旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂;UV-2600i紫外分光光度计,上海百贺仪器科技有限公司;Zetasizer nano ZS激光粒度分析仪,英国马尔文仪器有限公司;HS-TGA-103热重分析仪,上海合晟科技有限公司;SCIENTZ-ⅡD超声波细胞破碎机、SCIENTZ - 12 N冷冻干燥机,新芝生物科技股份有限公司;JEOL JEM-1200 EX透射电镜,日本电子株式会社;Nicolet iS10傅里叶变换红外光谱仪,赛默飞世尔科技有限公司;FE20K酸度计,梅特勒-托利多仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 张良姜精油的制备
选取新鲜的张良姜,清洗后切片,50 ℃条件下烘干,干燥后的张良姜用粉碎机打碎,过60目筛。将得到的张良姜粉按固液比1∶>10(g∶>mL)与蒸馏水混合于标准挥发油提取装置中,在50 ℃条件下提取3 h。随后将收集到的张良姜精油置于4 ℃冰箱中避光保存待用(记为E-O)。
1.3.2 张良姜精油脂质体的制备
采用薄膜分散法制备精油脂质体[4]。分别称取卵磷脂60 mg、胆固醇10 mg、张良姜精油50 mg于6 mL乙醇中作为油相放置茄型瓶中,在35 ℃,40 r/min条件下旋转蒸发15 min,使其在瓶内形成均匀脂质膜层。再向瓶中加入10 mL蒸馏水后放置在50 ℃水浴锅中充分水化2 h,形成脂质体水溶液,然后在300 W功率下使用超声波细胞破碎机对脂质体水溶液处理15 min,最后用0.22 μm微孔滤膜进行过滤,得到张良姜精油脂质体(记为E-L)。此外,空白脂质体(不含精油,记为B-L)的制备方法与前面描述的相同。
1.3.3 透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)观察
取适量张良姜精油脂质体样品,稀释100倍后滴在铜网上吸附2 min,吸去多余液体,用2%(质量分数)磷钨酸溶液(pH值=7.0)染色2 min后吸去多余染色液,自然干燥,然后用去离子水洗涤2次,自然干燥,在TEM下观察脂质体形貌[9]。
1.3.4 粒径、PDI和Zeta电位分析
取100 μL脂质体用1 mL无菌水稀释并混匀。设定条件:温度25 ℃,相对折光率1.330,重复测定3次[10]。
1.3.5 脂质体的包封率
张良姜精油标准曲线的制备:准确称取张良姜精油100 mg,用无水乙醇稀释定容至100 mL,以无水乙醇为参比,紫外分光光度计进行全波长扫描,测得张良姜精油紫外最大吸收峰波长为258 nm。随后将1 mg/mL张良姜精油-无水乙醇溶液分别配制为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL系列溶液,以无水乙醇为空白参比,在258 nm波长下测吸光度,以溶液浓度为横坐标、吸光值为纵坐标,得标准曲线为:Y=0.096 7X-0.000 86,R2=0.998 5。
张良姜精油脂质体包封率参照HU等[11]方法并略微调整。取10 mL脂质体样品在4 ℃条件下12 000 r/min离心30 min,去掉含有游离精油的上清液后加入等体积无水乙醇,超声处理15 min后在4 ℃条件下以12 000 r/min的转速离心20 min,取上清液于258 nm波长下测定吸光度。再根据浓度标准曲线,计算出脂质体中精油的含量。张良姜精油脂质体包封率由公式(1)计算:
包封率
(1)
式中:m1,离心后脂质体中包裹的精油质量,mg;m2,初始添加的精油质量,mg。
1.3.6 傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectrometer,FT-IR)
采用冷冻干燥法将脂质体样品制备成冻干粉。脂质体冻干粉与溴化钾粉末混合压片后,利用傅立叶红外光谱仪分析,采用ATR模式在4 000～650 cm-1进行测定。
1.3.7 热重分析(thermal gravimetric analyzer,TGA)
称取14 mg脂质体冻干粉将其放入坩埚中,在热重热炉中以10 ℃/min的速率在30～600 ℃加热以分析样品的热稳定性。
1.3.8 张良姜精油脂质体贮存稳定性分析
选取脂质体样品密封玻璃瓶中,分别置于4 ℃的冰箱和25 ℃的恒温培养箱中保存9 d。每隔2 d取一次样品,测定其粒径、PDI、电位及包封率,并利用pH计测定样品的pH,根据变化情况评估脂质体的贮存稳定性。
1.3.9 张良姜精油脂质体生物活性分析
1.3.9.1 DPPH自由基清除实验
将3 mL样品溶液与等体积DPPH溶液(0.1 mmol/L)混合。室温暗反应30 min后,在517 nm波长处测量吸光度(A1),用无水乙醇代替测试溶液,确定吸光度为A0。DPPH自由基清除率由公式(2)计算:
DPPH自由基清除率
(2)
式中:A0,对照品的吸光度;A1,样品溶液的吸光度。
1.3.9.2 ABTS阳离子自由基清除实验
参考LI等[12]的方法,略微调整。以7 mmol/L的ABTS阳离子自由基溶液与2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液在室温黑暗条件下反应12 h,得到ABTS阳离子自由基溶液。然后用PBS缓冲液将混合溶液稀释至734 nm波长处吸光度约为0.7±0.02,得到ABTS阳离子自由基标准液。将100 μL的样品溶液与100 μL的ABTS阳离子自由基标准液混合,置于室温黑暗反应30 min。在734 nm波长处测定该混合物的吸光度(A1)。用无水乙醇代替样品溶液,得到吸光度值A0。ABTS阳离子自由基清除率由公式(3)计算:
ABTS阳离子自由基清除率
(3)
式中:A0,对照品的吸光度;A1,样品溶液的吸光度。
1.3.9.3 张良姜精油脂质体的抑菌活性
采用平板菌落计数法测定张良姜精油脂质体的抑菌活性[13]。将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌接种于培养基,在37 ℃下孵育24～48 h。在对数生长阶段收集细菌,用0.01 mol/L的PBS(pH 7.4)进行系列10倍稀释,通过平板计数法测定各稀释梯度的菌液浓度后,将菌液调整至105～106 CFU/mL。菌液中分别加入E-L、E-O样品至终体积分数为0.1%,该含量基于精油的体积计算,以不加样品为空白对照,置于培养箱中培养。每隔1天测定1次,共检测7 d。每次取100 μL溶液,稀释10倍直至达到预期菌落总数,在37 ℃条件下培养24 h后进行菌落计数。
1.4 数据处理
所有的数据均以3次独立实验的“平均值±标准差”表示。采用SPSS 26.0进行数据分析,并通过Origin 2024绘制图表。采用方差分析(ANOVA)进行比较统计分析。P<0.05表明差异显著。
2 结果与分析
2.1 脂质体的外观和紫外图谱分析
张良姜精油脂质体的外观形态与紫外图谱如图1所示。由图1-a可知,脂质体溶液呈淡蓝色均一状态。当一束光线透过脂质体分散体系时,可以看到一条明亮的“通路”,表明所制备的脂质体具备胶体性质(图1-b)。E-O的最大吸收峰在258 nm(图1-c),并且在紫外光区存在较强吸收,这可能因其具有共轭体系[14]。E-O被脂质体包埋后,最大吸收峰升高至266 nm,且发生右移,可能是精油的加入扰乱了脂质分子的堆积并与脂质酰基链形成作用力[15]。此外,E-L的紫外光谱出现2个吸收峰,表明精油已成功封装到脂质体中。
a-脂质体的外观形态图;b-激光笔照射下的丁达尔效应图;c-紫外图谱
图1 脂质体的外观及紫外图谱
Fig.1 Appearance and ultraviolet spectrum of liposomes
2.2 脂质体微观结构观察
脂质体透射电镜结果如图2所示。B-L(图2-a)和E-L(2-b)均呈球形囊泡结构,与脂质体的典型定义一致[16]。相较于B-L的外观,E-L的边缘较粗糙,这可能是由于脂质体包埋精油后,干扰了脂质体膜的流动性[17]。此外,B-L的膜表面轮廓光滑而包载精油的脂质体的轮廓较为分散,这可能是因为精油的脂溶性成分能够存在于磷脂双分子层内,占据脂质膜的相应部位,使得磷脂双分子层中酰基的排列方式从原本有序的状态转变为无序状态,进而导致双分子层紧密的结构有所降低[18]。
a-B-L;b-E-L
图2 B-L和E-L的透射电镜图
Fig.2 Transmission electron microscope images of B-L and E-L
2.3 粒径、PDI、Zeta电位和包封率分析
脂质体的粒径大小、分布及电位对其包埋率和生物利用度至关重要,因此,确保这些参数在一定范围内保持均匀分布具有重要意义。如图3-a所示,B-L和E-L的粒径均为正态分布,且呈现单峰状。B-L的粒径为91.3 nm,E-L由于精油的加入扰乱了磷脂双分子层的结构流动性[18],从而使粒径增大,为122.73 nm。此外,如图3-b所示,B-L和E-L的PDI均为0～0.3。研究发现张婷等[19]制得蛋清肽脂质体粒径为95.0 nm,PDI为0.210,与本结果相似。通常情况下纳米颗粒的Zeta电位维持<-30 mV和>+30 mV范围可以被认为是一个稳定的系统,即绝对值大于30 mV时,被认为是稳定的[20]。本研究结果显示的Zeta电位符合这个范围(图3-b)。此外,由于卵磷脂含有羧基,使得制备的脂质体的Zeta电位为负,这表明脂质体表面带负电荷,粒子间因相互排斥而无凝聚倾向,体系较为稳定[21]。包封率是评价脂质体优劣的一个关键指标,本研究制备的E-L的包封率为(41.53±0.02)%,与LIANG等[22]制备的高良姜精油脂质体的包封率为32.35%相比,该包封率较好。因为精油挥发性高、稳定性弱的特性会限制其应用,所以把精油载入脂质体是优化这些问题的理想解决办法[23]。
a-B-L和E-L的粒径分布;b-B-L和E-L的PDI、电位图
图3 粒径分布、PDI和Zeta电位分析图
Fig.3 Particle size distribution, PDI and Zeta potential analysis diagrams
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.4 FT-IR分析
使用FT-IR在4 000～650 cm-1分析了卵磷脂、胆固醇、B-L和E-L的二级结构,结果如图4所示。卵磷脂在3 419.13 cm-1处的峰值是由于氨基的伸展振动所致,而2 853.59 cm-1处的吸收峰则是脂肪酸的亚甲基弯曲振动。在1 738.01 cm-1处的吸收峰与饱和脂肪酸羧酸盐中碳-氧双键的伸缩振动有关[24]。1 466.48 cm-1是甲基弯曲振动的吸收峰,位于1 242.67 cm-1则属于卵磷脂中磷酸酯的P
O基团伸缩振动。在1 091.79 cm-1处的光谱带与磷酸基团(P—O—C)的振动有关。另一方面,胆固醇在3 385.70 cm-1处的吸收峰是由于羟基伸缩振动所致。吸收峰位于2 866.52 cm-1,对应于—CH3键的伸缩振动;而1 671.60 cm-1和1 466.07 cm-1处的吸收峰为CC双键和—CH3的伸缩振动。此外,出现在1 055.98 cm-1处的吸收峰可能是C—O—C的伸缩振动[25]。在B-L中,3 425.92 cm-1处的吸收峰属于游离OH的伸缩振动;位于3 009.85 cm-1处的吸收峰是由于烯烃C—H的伸缩;1 738.87 cm-1处出现的吸收峰是C—O功能基团;而1 235.67 cm-1处的吸收峰是卵磷脂中的P—O键合[26]。对于E-L来说,它的主峰与B-L呈现出高度相似性,这一现象表明E-O的添加对脂质体结构几乎未产生影响。在完成精油包裹后,吸收峰位置从3 425.92 cm-1迁移至3 430.74 cm-1,呈现出细微的蓝移特征。这一变化揭示了脂质体膜中通过氢键作用与水分子关联的O—H键拉伸振动特性。同时,精油的引入可能使脂质体膜的流动性略有提升,进而导致其稳定性出现轻微下降。这一结论与包埋精油后观察到的粒径微增现象形成呼应。另外,相较于卵磷脂在1 242.67 cm-1处的吸收峰,E-L与 B-L的吸收峰分别红移至1 238.07和1 235.67 cm-1。这一现象与卵磷脂极性头部PO键及酯基中CO键的伸长相关[27]。最后,当B-L与E-L比较时,两者吸收峰值差异不大,且E-L未出现新的吸收峰,这说明E-O与载体化合物之间无功能键形成,没有发生化学反应,表明功能活性得以保留。
图4 红外光谱分析
Fig.4 FT-IR analysis
2.5 热重分析
对冻干后的B-L和E-L进行热重分析,结果如图5所示。B-L的失重过程呈现3个阶段:室温至140.61 ℃时,发生5.83%的失重;157.86～391.71 ℃阶段,壁材复合物降解,失重率达59.77%;409.57～600 ℃为第3阶段,最终壁材复合物总失重率为61.81%。E-L也分为3个阶段,但各阶段表现略有不同。室温至134.40 ℃时,主要因水分损失出现5.97%的失重;151.67～409.45 ℃期间,脂质体壁材完全降解且包埋的E-O挥发,失重率为58.76%;第3阶段为427.21～600 ℃,失重率60.82%。整体总失重率与B-L无明显差异,进一步印证了包埋精油并没有影响脂质体热稳定性。此外,从相同失重比例所需温度来看,B-L和E-L达到10%质量损失时,对应的温度分别为220.82 ℃和220.54 ℃。由此可见,采用这种壁材包埋精油,不仅未降低脂质体热稳定性,反而为精油提供了保护,有效抑制其挥发[28]。
图5 B-L和E-L的热重图
Fig.5 Thermogravimetric analysis of B-L and E-L
2.6 贮存稳定性分析
脂质体稳定性是评价脂质体质量的重要指标之一。在脂质体的壁材中,卵磷脂作为制备脂质体的主要成分,易被水解氧化成游离脂肪酸[6]。通过测定不同贮存条件下的pH,可以有效反映脂质体的稳定性。E-L在4 ℃和25 ℃的条件下贮存9 d,pH均接近中性,变化不明显,表明E-L短时间范围内在4 ℃和25 ℃下均可以贮存,未分解产生过多的游离脂肪酸(图6-a)。脂质体在不同时间点的包封率如图6-b所示。结果显示,包封率随时间推移变化较小,在4 ℃和25 ℃贮存9 d后,包封率从(41.53±0.02)%分别降至(35.98±0.34)%和(32.94±0.22)%,25 ℃的变化相对更明显,可能因为高温会加剧脂质膜材的分子热运动,使体系失稳加快。但整体下降都不超10%,精油含量损失不大,因此,在该时间范围内脂质体能稳定封装精油。在4 ℃贮存条件下B-L的粒径从最初的81.19 nm增大到第9天的92.53 nm,PDI从0.271到0.323,Zeta电位从-33.80 mV到-30.73 mV,均在稳定的区间范围内,在低温下表现出高稳定性[29](图6-c)。与B-L相比,E-L的变化也呈现类似趋势(图6-d),表明精油的掺入对脂质体的贮存稳定性没有较大影响。25 ℃条件下B-L的粒径从82.16 nm增加至95.53 nm,PDI从0.273增加至0.454,Zeta电位从-43 mV增至-32.03 mV,但是脂质体仍然处于稳定的状态(图6-e),E-L的变化趋势与B-L的相似(图6-f),脂质体在25 ℃条件下贮存时的总体变化幅度均大于4 ℃贮存时的变化(P<0.05),可能是较高的温度使脂质氧化和颗粒碰撞速率加快,导致脂质体的凝聚速度加快,从而导致其变化明显[24]。
a-E-L的pH变化;b-E-L的包封率变化;c-在4 ℃条件下B-L的变化;d-在4 ℃条件下E-L的变化;e-在25 ℃条件下B-L的变化;f-在25 ℃条件下E-L的变化
图6 B-L和E-L的贮存稳定性分析
Fig.6 Storage stability analysis of B-L and E-L
2.7 生物活性分析
自由基清除能力实验结果如图7所示。B-L对DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的清除率分别为(12.92±2.51)%和(18.86±0.33)%,E-O的清除率分别为(47.11±1.25)%和(55.71±0.81)%,E-L的清除率分别达到(50.92±0.88)%和(53.82±0.10)%。上述研究结果表明,E-L具有与E-O相似的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力,这可能是由于E-L实现了有效释放[30]。
图7 抗氧化能力分析
Fig.7 Antioxidant capacity analysis
图8-a和图8-b分别是E-O和E-L对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。2种菌悬液初始浓度值为6.7×105 CFU/mL,接种培养后,E-O和E-L对2种菌均具有显著的抑制效果(P<0.05)。2 d后,由于E-O具有挥发性,菌落总数增长,分别为6.72×106、6.50×106 CFU/mL,并且呈现持续增长的趋势。而对于E-L,2种菌从接种后第1天起就呈现下降趋势,由于脂质体包被阻断了精油的挥发,第2～4天,精油被逐渐释放,且由于脂质体的粒径小,其磷脂膜层与细菌的生物膜具有一定相容性,精油可以进入菌体内抑制其生长繁殖,使抑菌效果更加显著(P<0.05)。此外,大肠杆菌由于其坚硬的外骨骼肽聚糖层,对抗菌药物的抵抗力高于金黄色葡萄球菌。而金黄色葡萄球的细胞壁成分单一,仅有肽聚糖层,缺乏这种保护性的外层,使其容易被抗菌物质裂解[31]。因此,相较于E-L对大肠杆菌的抑制效果而言,E-L对金黄色葡萄球菌的抑制效果更好。
a-大肠杆菌;b-金黄色葡萄球菌
图8 E-O和E-L的抑菌活性
Fig.8 Antimicrobial activity of E-O and E-L
3 结论
选取卵磷脂和胆固醇为壁材,成功制备了E-L。制备的脂质体粒径适中,PDI、Zeta电位处于较稳定的状态,贮存稳定性较好。在透射电子显微镜下观察,脂质体分布均匀,能够明显看到磷脂双分子层结构,且稳定性较好。此外,脂质体包封效率较高且具有较好的热稳定性。而且,脂质体包封张良姜精油后可以克服精油挥发的缺点,发挥长期抗菌作用。因此,脂质体包封张良姜精油有助于提高其生物利用度。综上所述,脂质体包封张良姜精油的研究为张良姜精油的后续开发与应用提供了参考。
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