糖尿病相关认知功能障碍(diabetes-associated cognitive decline,DACD)是糖尿病患者常见的中枢神经系统并发症,主要表现为学习记忆能力下降、执行功能受损及认知处理速度减慢[1]。DACD不仅显著影响患者的生活质量,还增加社会与经济负担,因此探索安全有效的干预策略具有重要意义。“肠-脑轴”理论为糖尿病脑病的防治提供了新视角,肠道菌群作为其核心组成部分,通过代谢产物、神经内分泌信号和免疫调节等途径影响脑功能[2]。因此,通过调节肠道菌群及其代谢功能来改善糖尿病认知功能障碍成为当前研究热点。
黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)是一种传统药食同源植物,主要分布于我国西北地区,富含多糖、黄酮、花青素、多酚等多种生物活性成分。黑果枸杞多糖(Lycium ruthenicum polysaccharide,LRP)作为其主要活性成分之一,具有显著的免疫调节、抗氧化、降血糖及调节肠道菌群等生物学功能[3]。LRP含量可达果实干重的5%～8%,显著高于红枸杞,且其结构特征更为复杂。研究表明,LRP主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖等单糖组成,具有高度分支结构和丰富的糖醛酸残基,独特的结构特征赋予其更强的免疫调节和抗氧化活性[4]。近年来,LRP在神经保护方面的作用逐渐受到关注。体外研究显示,LRP能够通过激活核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)/血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)信号通路、清除活性氧自由基、抑制线粒体凋亡途径保护神经元免受缺氧缺糖/复氧诱导的氧化应激和凋亡损伤,并显著改善神经元存活率[5]。动物实验进一步证实,枸杞属植物多糖可改善阿尔茨海默病模型小鼠的学习记忆能力,其机制与调节磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)信号通路、抑制神经炎症、减少β-淀粉样蛋白沉积和tau蛋白过度磷酸化、改善突触可塑性有关[6]。然而,现有研究主要集中在单纯多糖对神经退行性疾病的直接作用,而在糖尿病认知功能障碍病理状态下的系统研究仍然缺乏。虽然LRP已被证实能够促进有益菌增殖、增强肠道屏障功能并通过短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)发挥抗炎和代谢调节作用[7],但其分子量大、生物利用度低、作用时间短等固有缺陷限制了其在功能食品的开发与应用[8]。为克服单纯多糖干预的局限性,通过发酵技术制备后生元成为研究热点。
后生元是指益生菌发酵产生的活性代谢产物或灭活菌体成分,相较于传统益生菌和益生元,具有化学组成明确、质量稳定、不受胃酸破坏、无需肠道定植即可发挥作用等优势[9-10]。将植物多糖与益生菌共发酵制备后生元可产生协同增效作用,多糖作为优质碳源促进益生菌代谢,显著提高SCFAs等功能性代谢产物的产量;益生菌分泌的多糖酶将大分子多糖降解为小分子片段,提高其生物活性和吸收利用率,从而克服单纯多糖干预的局限性[11-12]。植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)具有良好的耐酸性、耐胆盐性和多糖利用能力,能够高效发酵植物多糖并产生丰富的SCFAs[13]。
基于目前关于LRP与益生菌共发酵制备的后生元在糖尿病脑病中的应用研究尚未见报道,其调节肠-脑轴改善认知功能障碍的作用及机制仍不清楚。本研究选用L.plantarum与LRP进行共发酵,制备新型后生元(LRP Lactiplantibacillus plantarum,LRP-Lp),以高脂饮食联合链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病小鼠为模型,系统评价LRP-Lp对糖尿病小鼠认知行为、糖脂代谢、脑组织病理及炎症状态的影响,分析其对肠道菌群结构和短链脂肪酸水平的调节作用,探讨其基于“肠-脑轴”改善糖尿病认知功能障碍的可能机制。本研究不仅可为黑果枸杞资源的深度开发提供科学依据,也可为基于肠-脑轴理论防治糖尿病脑病提供新的干预策略和理论支持,同时为开发新型功能食品或保健品奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株与多糖
植物乳植杆菌(L.plantarum,CGMCC No.1.2437),中国普通微生物菌种保藏管理中心;LRP由实验室自提。前期研究发现LRP的总糖含量为93.58%,总糖醛酸含量为11.13%,未检测出蛋白。高效凝胶渗透色谱法分析显示LRP由高分子质量部分(Mw=55 070 Da,63.29%)和低分子量部分(Mw=8 897 Da,36.71%)组成。气相色谱分析表明,LRP由9种单糖组成,甘露糖∶>氨基葡萄糖∶>鼠李糖∶>葡萄糖醛酸∶>半乳糖醛酸∶>葡萄糖∶>半乳糖∶>木糖∶>阿拉伯糖=4.189∶>0.481∶4.809∶>3.645∶>6.685∶52.045∶>11.981∶>3.256∶>12.909(摩尔比)。
1.1.2 实验动物
SPF级健康雄性C57BL/6 J小鼠,6～8周龄,体重20～25 g,购自北京维通利华实验动物有限公司,许可证号SCXK(京)2021-0006。动物饲养于恒温恒湿环境,温度(22±2) ℃,相对湿度(60±5)%,光照/黑暗12 h交替,自由摄取食物和水。本实验已通过新疆医科大学动物实验中心伦理审查委员会审查符合(伦理审批号:IACUC-2025-03-10),实验操作符合GB/T 35892—2018《实验动物福利伦理审查指南》及本单位动物实验管理规范。
1.1.3 主要试剂
STZ(纯度≥98%,批号S0130),美国Sigma-Aldrich公司;德氏乳杆菌培养基(De Man, Rogosa and Sharpe,MRS,批号20241015),青岛海博生物技术有限公司;高脂饲料(60% kcal from fat,批号D12492),北京华阜康生物科技股份有限公司;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)、尼氏染色液(批号20240401、20240405),北京索莱宝科技有限公司;RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL化学发光检测试剂盒(批号20240115、20240121、20240121),上海碧云天生物技术有限公司;小鼠空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)ELISA试剂盒(批号20240620、20240705、20240710、20240710、20240712、20240715),上海酶联生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测试剂盒(批号20240601、20240605、20240608),南京建成生物工程研究所;toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)、髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response 88,MyD88)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)、B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)、β-肌动蛋白(beta-actin,β-actin)抗体(批号C98105、X3K1V7 W40111、231B4D6F8H1221、204M940611、A7P4QZ0611),美国Cell Signaling Technology公司;GFAP、Iba-1抗体(批号20240815、20240823),英国Abcam公司;辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记山羊抗兔IgG二抗、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 594标记山羊抗小鼠IgG二抗(批号20240215、20230511、20230717),武汉三鹰生物科技公司。
1.2 仪器与设备
Allegra X-30R高速冷冻离心机,美国Beckman Coulter公司;YQX-Ⅱ厌氧培养箱,上海跃进医疗器械有限公司;罗氏活力血糖仪,瑞士Roche公司;KEMaze动物行为轨迹分析系统,南京卡尔文生物科技有限公司;AU5800全自动生化分析仪,美国Beckman Coulter公司;Multiskan FC酶标仪,美国Thermo Fisher Scientific公司;BX53光学显微镜,日本Olympus公司;Mini-PROTEAN电泳及转膜系统,美国Bio-Rad公司;ChemiDoc XRS+化学发光成像系统,美国Bio-Rad公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样本制备
将L.plantarum活化后分别接种至MRS液体培养基或含5% LRP的MRS液体培养基中(接种量3%,体积分数),置于37 ℃厌氧培养箱进行厌氧发酵,待菌株发酵达到稳定期后(48 h,1×109 CFU/mL),将发酵液在4 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min,取离心后的上清液于80 ℃水浴灭活30 min,即可获得以MRS培养基制备的后生元(MRS-L.plantarum,MRS-Lp)和以LRP为碳源制备的后生元LRP-Lp,制备好的后生元直接用于动物干预。此外,称取5% LRP及1×109 CFU/mL的L.plantarum活菌,用无菌生理盐水溶解并按体积比1∶>1混匀,现配现用,即可得到合生元(LRP+L.plantarum,LRP+Lp),混合后30 min内灌胃。
1.3.2 实验分组与造模
采用高脂饮食联合小剂量STZ诱导2型糖尿病小鼠模型。小鼠适应性喂养1周后,随机分为正常对照组(normal control,NC组)和造模组。NC组给予普通饲料,造模组给予高脂饲料喂养4周。第4周末,造模组小鼠禁食12 h后腹腔注射STZ溶液(60 mg/kg,用0.1 mol/L pH 4.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液新鲜配制),连续注射3 d;NC组同期注射等体积缓冲液。STZ注射1周后测定空腹血糖(禁食12 h),连续2次空腹血糖≥11.1 mmol/L且伴有多饮、多尿、体重下降者视为造模成功。将造模成功小鼠按体重和血糖水平随机分为4组,每组10只:糖尿病模型组(diabetes mellitus,DM组)、LRP-Lp后生元组(LRP-Lp组)、MRS-Lp对照组(MRS-Lp组)、合生元组(LRP+Lp组);另设正常对照组(NC组,n=10)。各组继续给予相应饲料(NC组普通饲料,其余各组高脂饲料),同时灌胃干预每日1次,连续8周,给药体积为0.1 mL/10 g体重。NC组和DM组灌胃生理盐水,LRP-Lp组灌胃LRP-Lp溶液,MRS-Lp组灌胃MRS-Lp溶液,LRP+Lp组灌胃LRP+Lp溶液。
1.3.3 行为学实验
1.3.3.1 旷场实验
采用KEMaze动物行为轨迹分析系统进行测试。实验装置为黑色敞箱(40 cm×40 cm×40 cm),底部划分为16个相等方格,中央4个方格定义为中心区域。将小鼠轻柔放入旷场中央,使其自由探索5 min,摄像头记录行为轨迹。系统自动分析以下指标:总路程、中心区域停留时间、中心区域停留时间占比、平均速度、进入中心区域次数。测试结束后立即将小鼠移出,清洁旷场。
1.3.3.2 Y迷宫自发交替实验
Y迷宫由3个完全相同的臂组成(长35 cm,宽5 cm,高15 cm),三臂夹角120°,臂末端分别标记为A、B、C。将小鼠轻柔放置于三臂交汇处,朝向随机,使其自由探索8 min。记录小鼠进臂顺序(四肢完全进入某臂即记为1次进臂)。连续进入3个不同臂定义为1次正确自发交替。按公式(1)计算自发交替率,评估小鼠短期空间工作记忆能力。
自发交替率
(1)
1.3.4 样本采集与处理
行为学实验结束后,收集新鲜粪便颗粒(每只小鼠约300 mg),液氮速冻后-80 ℃保存,用于16S rRNA基因测序和SCFAs检测。小鼠禁食12 h(不禁水)。腹腔注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉,待小鼠深度麻醉后,摘除眼球采集眼眶静脉丛血0.8～1.0 mL,室温静置30 min,3000 r/min、4 ℃离心15 min,分离血清,分装后于-80 ℃保存备用。
采血后迅速脱颈处死小鼠,完整取出全脑。随机选取每组4只小鼠的全脑,置于40 g/L多聚甲醛固定液中,4 ℃固定48 h,用于石蜡包埋切片、HE染色及免疫组织化学染色。另外6只小鼠的脑组织,在冰板上快速分离海马组织,立即投入液氮速冻,转移至冻存管,-80 ℃保存备用,用于生化指标检测和Western Blot实验。
1.3.5 指标检测
血清样本解冻后,测定空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、空腹胰岛素(fasting insulin,FINS、糖化血红蛋白(glycated hemoglobin,HbA1c)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)及高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)水平。按公式(2)计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR):
(2)
取海马组织,按料液比1∶>9(g∶>mL)加入预冷生理盐水,低温匀浆,3 000 r/min、4 ℃离心15 min,取上清液。采用BCA法测定蛋白浓度,采用相应试剂盒检测SOD活性、GSH含量、MDA含量以及炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平。
1.3.6 组织病理学观察
石蜡切片常规脱蜡至水,按试剂盒说明行HE染色和尼氏染色,中性树胶封片。光学显微镜下观察海马齿状回(dentate gyrus,DG)区病理变化。
1.3.7 海马组织免疫荧光染色
石蜡切片常规脱蜡至水,行抗原修复,室温封闭1 h,滴加一抗[抗GFAP抗体和抗Iba-1抗体均以含10 g/L BSA的PBS按1∶>200(体积比)稀释],4 ℃湿盒中过夜孵育。次日滴加荧光标记二抗(1∶>500),37 ℃避光孵育1 h,PBS洗3次。4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色细胞核5 min,PBS洗3次。抗荧光淬灭封片剂封片。荧光显微镜下观察并采集观察海马DG区图像,Image J软件分析荧光强度或阳性细胞数量。
1.3.8 Western Blot检测
取海马组织约30 mg,制备蛋白样本。BCA法测定蛋白浓度,SDS-PAGE凝胶电泳分离,湿转法转移至聚偏二氧乙烯膜,5% 脱脂牛奶室温封闭1 h,加入一抗(TLR4、MyD88、NLRP3、Bcl-2、Bax,稀释比例1∶>1 000;β-actin为1∶>2 000)4 ℃过夜。次日加入HRP标记二抗(1∶>5 000)室温孵育1 h。ECL(enhanced chemiluminescence)化学发光显影,Image Lab软件分析条带灰度值,以β-actin为内参计算目的蛋白相对表达量。
1.3.9 肠道菌群16S rRNA基因测序
取粪便样本约200 mg,采用粪便基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。以细菌16S rRNA基因V3-V4高变区为靶标,进行Illumina MiSeq高通量测序。测序数据经质控、拼接、过滤后,采用UPARSE软件(version 7.1)以97%相似度聚类为操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU),基于Silva数据库进行物种注释。采用QIIME软件(version 1.9.1)分析α多样性指数(Chao1、Shannon、Simpson指数)和β多样性,采用线性判别分析效应大小(linear discriminant analysis effect size, LEfSe)分析(LDA score>2,P<0.05)筛选差异显著物种
1.3.10 SCFAs检测
取粪便样本约100 mg,加入1 mL超纯水,涡旋混匀5 min,12 000 r/min、4 ℃离心10 min,取上清液500 μL。加入100 μL 50%(体积分数)H2SO4酸化,加入1 mL乙醚萃取,涡旋5 min,12 000 r/min、4 ℃离心5 min,吸取上层乙醚相,重复萃取2次。合并乙醚相,氮吹仪吹干,300 μL甲醇复溶,过0.22 μm滤膜。采用GC-MS联用技术检测乙酸、丙酸、丁酸含量。色谱条件:DB-WAX毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),载气为高纯氦气,流速1.0 mL/min,进样口温度250 ℃,程序升温(80 ℃ 2 min→120 ℃→150 ℃→230 ℃)。质谱条件:EI源,离子源温度230 ℃,SIM模式,扫描范围m/z 40～300。采用外标法定量,计算各SCFAs含量(μmol/g粪便)。
1.4 数据统计与分析
所有实验数据采用SPSS 26.0统计软件分析,GraphPad Prism 9.0软件作图。计量资料以“平均值±标准差”表示。数据首先进行正态性检验(Shapiro-Wilk检验)和方差齐性检验(Levene检验)。符合正态分布且方差齐性的数据,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间两两比较采用LSD-t检验;不符合正态分布或方差不齐的数据,采用非参数检验(Kruskal-Wallis H检验)。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 LRP-Lp对DACD小鼠行为学的影响
2.1.1 旷场实验结果
旷场实验用于评估小鼠的自主活动能力和焦虑样行为[14]。如图1-A～图1-E所示,与NC组相比,DM组小鼠总路程、中心区停留时间及占比、进入中心区次数均显著降低(P<0.05),提示糖尿病小鼠自主活动能力下降,焦虑样行为增加。与DM组比较,LRP-Lp和LRP+Lp组上述指标均显著改善(P<0.05),MRS-Lp组小鼠各指标无明显改善。各组小鼠平均速度无显著差异(P>0.05),表明差异主要源于活动意愿而非运动能力。结果表明,LRP-Lp和LRP+Lp能够改善糖尿病小鼠的自主活动能力,减轻焦虑样行为,LRP-Lp的效果优于LRP+Lp。
A-总路程;B-中心区停留时间;C-中心区停留占比;D-平均速度;E-中心区进入次数;F-总进臂次数;G-正确交替次数;H-自发交替率
图1 各组小鼠旷场实验和Y迷宫实验行为学指标测定结果
Fig.1 Measurement results of behavioral indices in the open field test and Y-maze test of mice in each group
注:与NC组相比,#表示P<0.05;与DM组相比,*表示P<0.05(下同)。
2.1.2 Y迷宫自发交替实验结果
Y迷宫自发交替实验用于评估小鼠短期空间工作记忆能力[15]。如图1-F～图1-H所示,与NC组相比,DM组小鼠正确交替次数和自发交替率显著降低(P<0.01),表明糖尿病导致短期空间工作记忆受损。LRP-Lp和LRP+Lp干预后,小鼠正确交替次数和自发交替率均显著高于DM组(P<0.05),且MRS-Lp组效果与DM组无明显差异。各组小鼠总进臂次数无显著差异(P>0.05),排除了活动能力对结果的干扰。结果表明,LRP-Lp和LRP+Lp能够改善糖尿病小鼠的短期空间工作记忆能力,LRP-Lp的效果优于LRP+Lp。
2.2 LRP-Lp对DACD小鼠糖脂代谢的影响
2.2.1 血清糖代谢指标
如图2A-D所示,与NC组相比,DM组小鼠FBG、FINS、HOMA-IR和HbA1c水平均显著升高(P<0.05)。LRP-Lp和LRP+Lp干预后,FBG、FINS、HOMA-IR和HbA1c均显著低于DM组(P<0.05),而MRS-Lp组与DM组无显著差异,提示LRP的添加对改善糖代谢紊乱具有重要作用。LRP-Lp组的改善效果优于LRP+Lp组,表明发酵过程增强了LRP对糖代谢的调节作用。结果表明,LRP-Lp能够显著降低空腹血糖水平,改善胰岛素抵抗状态,提高胰岛素敏感性,并长期稳定控制血糖。
A-FBG;B-FINS;C-HOMA-IR;D-HbA1c;E-TC;F-TG;G-LDL-C;H-HDL-C
图2 各组小鼠糖脂代谢相关指标测定结果
Fig.2 Measurement results of glycolipid metabolism related indices of mice in each group
A-SOD活性;B-GSH-Px活性;C-CAT活性;D-MDA含量;E-IL-6含量;F-IL-1β含量;G-TNF-α含量
图3 各组小鼠氧化应激及炎症相关指标测定结果
Fig.3 Measurement results of oxidative stress and inflammation related indices of mice in each group
2.2.2 血清脂代谢指标
如图2E-H所示,与NC组相比,DM组小鼠TC、TG和LDL-C水平显著升高,HDL-C水平显著降低,提示糖尿病导致脂代谢紊乱。LRP-Lp和LRP+Lp干预后,TC、TG、LDL-C和LDL-C/HDL-C比值显著降低,HDL-C显著升高(P<0.05),而MRS-Lp组与DM组无显著差异。LRP-Lp和LRP+Lp能够显著改善糖尿病小鼠的脂代谢紊乱,其中LRP-Lp组的改善效果优于LRP+Lp组,表明发酵过程增强了LRP对脂代谢的调节作用。
2.3 LRP-Lp对DACD小鼠海马组织生化指标的影响
氧化应激与炎症反应相互促进,共同参与糖尿病脑病的发生发展。活性氧可激活核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)和NLRP3炎症小体,促进IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎因子释放;而促炎因子又可激活NADPH氧化酶,进一步加剧氧化应激,形成恶性循环[16]。如图3所示,与NC组相比,DM组小鼠海马组织SOD、GSH-Px和CAT活性显著降低,MDA含量显著升高(P<0.05),IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著升高(P<0.05),提示糖尿病导致海马组织氧化应激失衡和炎症反应激活。LRP-Lp和LRP+Lp干预后,抗氧化酶活性显著升高,MDA含量和炎症因子水平显著降低(P<0.05),而MRS-Lp组与DM组无显著差异。LRP-Lp组的改善效果优于LRP+Lp组,表明发酵过程增强了LRP对海马组织的抗氧化和抗炎保护作用。
2.4 LRP-Lp对DACD小鼠海马组织病理学的影响
分别用HE染色和Nissl染色观察海马组织整体形态结构和神经元功能状态。如图4所示,NC组小鼠海马DG区神经元排列整齐致密,细胞形态饱满,核仁清晰,细胞间隙均匀,尼氏体丰富,染色深蓝,分布均匀,提示神经元结构完整。与NC组相比,DM组小鼠海马各区神经元排列紊乱疏松,细胞数量明显减少,大量神经元出现核固缩、核溶解、胞质空泡化等退行性改变,细胞间隙增大,尼氏体阳性神经元数量显著减少(P<0.05)。LRP-Lp和LRP+Lp干预后,海马神经元排列趋于整齐,细胞形态逐渐恢复,核固缩和空泡化现象明显减轻,细胞间隙趋于正常,尼氏体阳性神经元数量均显著高于DM组(P<0.05),而MRS-Lp组与DM组无显著差异,LRP-Lp组的保护效果优于LRP+Lp组,表明发酵过程增强了LRP对海马神经元的保护作用。
A-海马组织HE染色图;B-海马组织尼氏染色图;C-尼氏体阳性神经元数量
图4 各组小鼠海马组织HE染色及尼氏染色结果
Fig.4 HE staining and Nissl staining results of hippocampal tissue in mice of each group
2.5 LRP-Lp对DACD小鼠海马组织胶质细胞的影响
GFAP是星形胶质细胞标志蛋白,Iba-1是小胶质细胞标志蛋白,用于评估胶质细胞激活状态和神经炎症程度[17]。如图5所示,NC组小鼠海马组织GFAP和Iba-1阳性细胞数量少,荧光信号弱,星形胶质细胞和小胶质细胞均处于静息状态,胞体小,突起形态正常。与NC组相比,DM组小鼠海马GFAP和Iba-1阳性细胞数量及荧光强度均显著升高(P<0.05)。LRP-Lp和LRP+Lp干预后,GFAP和Iba-1阳性细胞数量及荧光强度均显著低于DM组(P<0.05),星形胶质细胞和小胶质细胞形态趋于静息状态,而MRS-Lp组与DM组无显著差异。LRP-Lp组的抑制效果优于LRP+Lp组,表明发酵过程增强了LRP对海马神经炎症的保护作用。结果表明,LRP-Lp能够抑制海马星形胶质细胞和小胶质细胞过度激活,减轻神经炎症损伤。
A-海马组织免疫荧光染色图(蓝色为DAPI,红色为Iba-1,绿色为GFAP);B-Iba-1阳性细胞数量;C-Iba-1相对荧光强度;D-GFAP阳性细胞数量;E-GFAP相对荧光强度
图5 各组小鼠海马组织Iba-1和GFAP免疫荧光染色结果
Fig.5 Immunofluorescence staining results of Iba-1 and GFAP in hippocampal tissue of mice in each group
2.6 LRP-Lp对DACD小鼠海马组织炎症信号通路蛋白表达的影响
如图6所示,与NC组相比,DM组小鼠海马组织TLR4、MyD88蛋白表达水平显著升高,NF-κB p65总蛋白表达无显著变化,但p-NF-κB p65蛋白表达及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均显著升高(P<0.05),NLRP3、ASC蛋白表达显著升高(P<0.05),Caspase-1前体蛋白表达无显著变化,但Cleaved Caspase-1(活化形式)蛋白表达及Cleaved Caspase-1/Caspase-1比值均显著升高(P<0.05),提示糖尿病激活TLR4/MyD88/NLRP3炎症小体信号通路,促进NF-κB磷酸化和Caspase-1活化,启动炎症反应,介导IL-1β等促炎因子成熟和释放。LRP-Lp和LRP+Lp干预后,上述蛋白表达水平均显著低于DM组(P<0.05),而MRS-Lp组与DM组无显著差异。进一步比较发现,LRP-Lp组的抑制效果优于LRP+Lp组,表明发酵过程增强了LRP对炎症信号通路的抑制作用。结果表明,LRP-Lp能够抑制TLR4/MyD88/NLRP3炎症小体信号通路激活,减轻海马组织炎症反应。
A-相关蛋白Western Blot条带图;B-TLR4蛋白相对表达量;C-MyD88蛋白相对表达量;D-P-NF-κB/NF-κB比值;E-NLRP3蛋白相对表达量;F-ASC蛋白相对表达量;G-Cleaved-Caspase-1/Caspase-1比值
图6 各组小鼠海马组织TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路相关蛋白表达水平
Fig.6 Expression levels of proteins related to TLR4/NF-κB/NLRP3 signaling pathway in hippocampal tissue of mice in each group
2.7 LRP-Lp对DACD小鼠肠道菌群的影响
2.7.1 肠道菌群α多样性分析结果
α多样性反映单个样本内菌群的丰富度和均匀度。如表1所示,与NC组相比,DM组小鼠肠道菌群Chao1指数、ACE(abundance-based coverage estimator)指数、Shannon指数和Simpson指数均显著降低(P<0.05),提示糖尿病导致肠道菌群丰富度和多样性下降,菌群结构失衡。LRP-Lp干预后,上述α多样性指数均显著高于DM组(P<0.01),且接近NC组水平(P>0.05)。结果表明,LRP-Lp能够增加肠道菌群丰富度和多样性,改善菌群结构失衡。
表1 各组小鼠肠道菌群α多样性指数
Table 1 Alpha diversity indices of gut microbiota in mice of each group
组别Chao1指数ACE指数Shannon指数Simpson指数NC组468.5±52.6472.8±54.35.82±0.680.952±0.035DM组285.3±38.4#289.6±40.2#3.65±0.52#0.768±0.048#LRP-Lp组432.6±48.2∗438.9±50.6∗5.46±0.64∗0.928±0.040∗
注：与NC组相比,#表示P<0.05;与DM组相比,*表示P<0.05。
2.7.2 肠道菌群β多样性分析结果
主成分分析(principal component analysis,PCA)和
物种组成分析显示,NC组与DM组沿PC1轴(50.83%)呈显著分离,表明糖尿病造模导致大鼠肠道菌群结构发生显著紊乱;而LRP-Lp组样本聚类倾向于NC组,提示干预后菌群结构得到有效改善(图7-A～图7-C)。在属水平上,热图分析(图7-D)显示,DM组小鼠肠道中韦氏非渗透杆菌(Dysosmobacter)、拟杆菌属(Bacteroides)、鼠杆菌属(Muribaculum)、螺旋杆菌属C支(Helicobacter_C)及异普雷沃菌属(Alloprevotella)等菌属的相对丰度异常升高;而联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)、另枝菌属(Alistipes)、臭杆菌属(Odoribacter)等潜在有益菌属丰度显著降低。LRP-Lp干预显著逆转了上述趋势,有效抑制了潜在致病菌的扩张,并促进了有益菌的增殖。进一步在种水平分析(图7E),LRP-Lp显著回调了糖尿病引起的物种失调,显著提高了鼠源联合乳杆菌(Ligilactobacillus murinus)、狄氏副拟杆菌(Parabacteroides_distasonis A)、Alistipes_sp002428825等具有代谢调节功能的益生菌水平,同时显著降低了DM组中高表达的肝螺旋杆菌(Helicobacter_C hepaticus)和产酸拟杆菌(Bacteroides_acidifaciens)等病理相关菌的相对丰度。基于KEGG数据库的PICRUSt功能预测分析(图7-F)显示,各组间菌群功能通路存在显著差异。LRP-Lp干预后,菌群在代谢相关通路、生物合成明显富集,对疾病相关通路阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus)丰度呈下降趋势,表明LRP-Lp可能通过调节特定菌群的代谢活性,降低糖尿病及认知障碍相关的病理通路表达。
A-肠道菌群PCA分析图;B-门水平物种相对丰度;C-属水平物种相对丰度;D-属水平差异菌群热图;E-种水平差异菌群热图;F-菌群功能预测分析(基于KEGG通路);G-SCFAs含量热图;H-SCFAs(乙酸、丙酸、丁酸)含量;I-关键差异菌和SCFAs与生化指标及通路蛋白的Spearman相关性分析热图
图7 各组小鼠肠道菌群结构及SCFAs测定结果
Fig.7 Measurement results of gut microbiota structure and short-chain fatty acids of mice in each group
注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
2.8 LRP-Lp对DACD小鼠粪便SCFAs水平的影响
SCFAs是肠道菌群代谢产物,主要包括乙酸、丙酸和丁酸,具有调节肠道屏障、抗炎、改善糖脂代谢等多种生理功能。如图7-G、图7-H所示,与NC组相比,DM组小鼠粪便和盲肠内容物中乙酸、丙酸和丁酸水平均显著降低(P<0.05),提示糖尿病导致肠道菌群代谢功能紊乱,SCFAs产生能力下降。LRP-Lp干预后,粪便和盲肠内容物中乙酸、丙酸、丁酸水平均显著高于DM组(P<0.05)。结果表明,LRP-Lp能够促进肠道菌群SCFAs产生,恢复肠道代谢功能。为了探究LRP-Lp改善认知功能的潜在途径,采用Spearman相关性分析考察了差异菌、SCFAs与行为学指标及海马炎症因子之间的关系。Spearman相关性热图分析(图7-I)系统地揭示了肠道菌群演替与宿主生理病理指标间的内在关联。结果显示,受LRP-Lp干预显著上调的有益菌群,包括Ligilactobacillus murinus、UBA3263_sp001689615、Alistipes_sp002428825、Parabacteroides distasonis A、Muribaculum_sp910578835、Prevotella_rodentium、Alistipes_sp002362235及Odoribacter_sp910588375,与乙酸、丙酸、丁酸等SCFAs含量,抗氧化酶活性及反映认知功能的行为学指标均呈显著或极显著正相关(P<0.05或P<0.001),且与促炎因子及TLR4/NLRP3信号通路相关蛋白表现出负相关特性。相反,在DM组中异常富集的病理相关菌,如Helicobacter_C hepaticus、Duncaniella_dubosii、Alloprevotella_sp009775705、Bacteroides_acidifaciens、Alloprevotella_sp002933955、Paramuribaculum_intestinale和条件致病菌Klebsiella pneumoniae,与MDA含量、促炎细胞因子及TLR4/NLRP3信号通路等指标或蛋白表达水平呈现显著正相关,而与SCFAs水平、认知表现及机体抗氧化能力呈显著负相关。上述结果表明,LRP-Lp后生元可调控关键菌种的相对丰度,在分子水平上抑制由TLR4/NLRP3信号通路介导的炎症级联反应,增强肠道代谢产物的保护作用及抗氧化水平,从而实现对DACD小鼠认知损伤的改善。
3 结论与讨论
本研究结果显示,LRP-Lp显著改善了糖尿病小鼠的学习记忆能力,其保护作用伴随着肠道微生态的重塑,提示其机制可能与肠-脑轴的调节有关,这为糖尿病脑病的营养防治提供了新的策略。在脑组织水平,LRP-Lp能够明显改善糖尿病小鼠海马区组织学结构,包括尼氏体恢复和胶质细胞激活状态的下调,提示其兼具神经元保护与神经炎症缓解作用。近期研究表明,糖尿病相关认知障碍与脑内慢性神经炎症高度相关,微胶质细胞过度激活和星形胶质细胞反应性改变是连接代谢应激与突触功能受损的重要枢纽[18]。本研究观察到抗氧化酶活性恢复及MDA水平降低,说明LRP-Lp在减轻脂质过氧化、改善氧化还原稳态方面具有显著优势,这与新近关于NLRP3炎症小体和NF-κB信号在神经炎症-氧化应激互馈环路中关键作用的报道高度一致[19]。通过同时抑制TLR4/MyD88/NF-κB轴及NLRP3炎症小体过度激活,LRP-Lp可下调“氧化应激-炎症-细胞死亡”的恶性循环,从而在结构和功能上实现对海马神经环路的综合保护。
本研究证实,LRP-Lp干预可显著重塑DACD小鼠的肠道菌群结构,有效逆转因高糖环境诱导的微生态失调。LRP-Lp显著降低了Muribaculum在内的潜在条件致病菌丰度,并选择性富集了以Ligilactobacillus和Alistipes为代表的有益菌群,恢复了菌群的多样性与群落稳定性。既往研究表明,Ligilactobacillus具有显著的抗炎与免疫调节活性,维护肠道屏障完整性,减少脂多糖等内毒素的易位入血,从而削弱外周炎症向中枢的传递,这与本研究观察到的海马TLR4表达下调高度一致。而Alloprevotella与Alistipes丰度的恢复往往与宿主糖脂代谢及认知功能的改善呈正相关[20]。Parabacteroides distasonis A等菌株还可产生γ-氨基丁酸、5-羟色胺等神经递质前体,通过迷走神经或血液循环调节中枢神经系统的兴奋-抑制平衡[21]。相关性分析显示,有益菌丰度与认知指标正相关,而DM组富集的H.hepaticus等条件致病菌产生的神经毒性代谢物则加剧血脑屏障损伤,与认知功能呈负相关[22]。这些证据表明,LRP-Lp通过多途径调控肠道菌群-代谢产物-脑神经炎症网络,实现了对DACD的综合干预。
菌群结构的优化与代谢产物的变化上呈现高度一致性。本研究结果显示,LRP-Lp组肠道内SCFAs含量较DM组显著回升,这与上述产酸菌群的丰度增加互为印证。作为连接“微生物-肠-脑轴”的关键信号介质,SCFAs不仅是结肠上皮细胞的重要能量底物,有助于增强肠道黏膜屏障功能,更可穿过血脑屏障作用于中枢神经系统,丁酸作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂,可穿越血脑屏障上调脑源性神经营养因子表达,促进突触可塑性,并通过激活小胶质细胞受体诱导其向抗炎M2表型极化[23]。最新研究指出,循环中的丁酸通过激活小胶质细胞表面的G蛋白偶联受体41/43,抑制NF-κB信号通路的核转位,进而阻断IL-1β、TNF-α等促炎因子的释放[24]。这与LRP-Lp能缓解海马区的神经炎症反应,最终改善糖尿病相关的认知功能障碍的结果相呼应。
与单纯补充益生菌或益生元相比,后生元具有成分稳定、便于质量控制且规避活菌安全性风险的优势,已在近年的共识与评述中被视为重要的新一代肠道干预策略[25]。LRP-Lp兼具多糖降解形成的低聚糖、发酵富集的SCFAs和有机酸以及灭活菌体及其结构成分所带来的免疫训练效应,体现了多组分、多靶点协同的特点。本研究虽证实了LRP-Lp对肠道菌群、SCFAs及认知功能的协同改善作用,但LRP-Lp是通过其活性组分直接作用于中枢系统,还是完全依赖肠道菌群介导的间接作用,仍需进一步研究。未来的研究可通过粪便菌群移植或抗生素清除实验,进一步验证肠道菌群在LRP-Lp改善DACD中的因果作用,并深入探究相关代谢物调节神经炎症的具体分子靶点。本研究为DACD的营养干预提供了新思路,为黑果枸杞资源高值化利用及新型功能食品开发提供了科学依据。
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