植物精油作为次生代谢产物往往表现出抑菌、抗氧化、抗病毒等生物学活性[1]。芸香科柑橘属植物的果皮富含精油,因具独特香气和止咳、平喘等药效而受到人们关注[2-4]。佛手柑、丑橘作为我国广泛种植的2种柑橘属水果,对其果皮精油的开发利用有助于农业经济效益提升及传统产业链延伸。
植物精油一般成分复杂且不同组分含量差异显著,了解某种精油的组分及含量是评估其利用价值和应用领域的前提[5-7]。目前,鲜有佛手柑和丑橘果皮精油成分分析的相关报道,不利于两者活性测试、单体分离、结构修饰以及产品研制等工作。因此,本研究拟利用GC-MS分析佛手柑和丑橘果皮精油的组分及其相对含量,并跟踪测试其在不同保存时长下的动态变化。
采摘后新鲜度是决定水果受消费者欢迎程度及经济与营养价值的重要因素。芒果(Mangifera indica L.)是夏季常见漆树科杧果属水果,除口感香甜、营养丰富外,还可生津止渴、益胃止呕以及利尿止晕而倍受大众喜爱,但成熟芒果含糖量高且易挤压受损、腐烂变质,对其进行有效保鲜意义显著。植物精油作为天然产物具有环境友好、安全健康等特点,从而在果蔬保鲜领域表现出独特优势[8-10]。目前,佛手柑与丑橘果皮精油对芒果是否具有保鲜效果,两者对与水果腐烂进程密切相关的菌类是否有显著抑制效应均不明了。基于此,本研究跟踪检测了2种精油处理下芒果的系列外观与生理指标,测试了2种精油对金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌的抑制效果,以评估两者在水果保鲜领域的应用前景。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜佛手柑(芸香科柑橘属,产自广东云浮)、新鲜丑橘(芸香科柑橘属,产自四川省浦江县)、新鲜芒果(漆树科芒果属,产自海南三亚)。
LB琼脂,上海盛思生化科技有限公司;PDA培养基,上海瑞楚生物科技有限公司;石油醚、氯化钠、酚酞(均为分析纯),天津大茂化学试剂厂;正己烷(色谱纯),天津市康科德科技有限公司;甲醇(分析纯),天津市致远化学试剂有限公司;丙酮(分析纯),衡阳市凯信化工试剂股份有限公司;氢氧化钠、无水硫酸钠(分析纯),天津市福晨化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
SN-RE-2000A旋转蒸发仪,上海尚仪仪器设备有限公司;QP2010S气相色谱-质谱联用仪,日本岛津公司;SP-756P紫外-可见分光光度计,上海光谱仪器有限公司;PAL-1手持式糖度计,日本爱拓公司;DZKW-4电热恒温水浴锅,北京中兴伟业仪器有限公司;TG16G离心机,湖南凯达科学仪器有限公司;JA3003电子分析天平,上海舜宇恒平科学有限公司;SW-CJ2FD超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;YXQ-100SⅡ立式压力蒸汽灭菌器,上海博迅实业有限公司医疗设备厂;QYC-200全温培养摇床,上海新苗医疗器械制造有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 柑橘精油提取与保存
各称取100 g切成约1 cm2方块的新鲜佛手柑、丑橘表皮,加300 mL去离子水后置于挥发油提取装置,加热蒸馏3 h;冷却后收集蒸馏液,石油醚萃取3次,取上层有机相,旋转蒸发得二者精油[11]。2种精油各自用EP管闭盖20 ℃避光保存,并分别在保存的第0天、第3天、第8天、第15天及第22天用GC-MS技术分析2种精油的成分。
1.3.2 柑橘精油GC-MS成分分析
电子天平称量0.1 g NaOH固体,移液管量取5.0 mL甲醇溶液,将甲醇溶液加入装有NaOH的烧杯中,用玻璃棒搅拌;用移液枪移取1.0 mL柑橘精油置于蒸馏烧瓶,加入正己烷4.0 mL、NaOH甲醇溶液2.0 mL,70 ℃水浴回流20 min后,取出冷却并移至20 mL刻度试管中;加蒸馏水至10 mL,振荡后加入少量无水硫酸钠;吸取0.1 mL上清液和1.4 mL正己烷置于EP管待测。测试时选用DB-5MS气相毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),柱箱温度40 ℃、进样温度290 ℃、进样口温度290 ℃、起始温度40 ℃、保持5 min以10 ℃/min升温至160 ℃,保持2 min后再以5 ℃/min升温至240 ℃,再次保持2 min后以10 ℃/min升温至290 ℃并保持5 min;载气(He)流量1.00 mL/min,进样量1.00 μL,分流比80∶>1。质谱条件为离子源温度200 ℃,接口温度220 ℃,溶剂延迟时间2.3 min;质量扫描范围22～600 m/z。质谱图库进行扫描和对比,选择最佳匹配项进行成分鉴定,通过峰面积归一化法确定各组分的相对含量[12-13]。
1.3.3 精油对芒果保鲜效果研究
1.3.3.1 芒果保鲜处理
颜色、大小、形状相近的新鲜芒果均分为3组放入18 cm×10 cm×5 cm透明保鲜盒中,每组3个重复(记为A1、A2、A3,B1、B2、B3,C1、C2、C3),其中A组保鲜盒中不放柑橘精油(对照组),B组放入0.5 mL柑橘精油(低剂量组),C组放入1.0 mL柑橘精油(高剂量组)。精油用相同矿泉水瓶盖盛装并置于保鲜盒相同位置;除开盖取样外,各组保鲜盒均保持闭盖状态下室温保存,并分别于保存第0天、第3天、第6天、第8天以及第10天进行保鲜效果监测[14]。
1.3.3.2 芒果外观观察及腐烂指数计算
芒果表面腐烂程度分为0～4级;0级为芒果表面无腐烂,1级为表面出现1～3个腐烂点,2级为表面腐烂面积介于1/4～1/2;3级为表面腐烂面积介于1/2～3/4;4级为表面腐烂面积超过3/4;基于统计得到的所有被贮存芒果的腐烂级别,腐烂指数[15]的计算如公式(1)所示:
腐烂指数
(1)
1.3.3.3 芒果果皮叶绿素含量测定
各组取1.0 g左右芒果果皮,切碎后置于7.0 mL丙酮中,室温避光静置60 min后,振荡器振荡提取30 min后,5 000 r/min条件下离心5 min。取上清液置于分光光度计中,测得样本在663、645 nm处吸光度值,分别记为A663、A645,根据Amon公式计算叶绿素含量,每组重复3次求平均值[14]。其计算分别如公式(2)、公式(3)和公式(4)所示:
(2)
(3)
(4)
式中:C1为叶绿素a含量,kg/mL;C2为叶绿素b含量,kg/mL;C3为总叶绿素含量,kg/mL;V为提取液总体积,mL;M为样品质量,g。
1.3.3.4 芒果果肉糖酸比测定
分别从各组芒果样本中取适量果肉置研钵磨成匀浆后,用手持式糖度计测定可溶性糖含量(记为A),各组均测量3次得平均值用于后续糖酸比计算。再分别称取各组芒果中央处果肉约2.0 g,研钵中加入5.0 mL蒸馏水磨成匀浆,定容至100 mL后8 000 r/min离心10 min,取上清液20.0 mL滴入1%酚酞2滴,用0.01 mol/L的NaOH溶液滴定至上清液变为淡红色且15 s内不变色,每组重复3次。可滴定酸含量的计算如公式(5)所示:
(5)
式中:C为氢氧化钠浓度(mol/L);V为氢氧化钠溶液体积(mL);k为酸系数0.064;m为样品质量(g);V0为样品定容后总体积(mL);V1为用于滴定的提取液体积(mL)。
测得可溶性糖含量和可滴定酸含量后直接计算两者比值(A/Y)得果肉糖酸比[15]。
1.3.4 两种柑橘果皮精油抑菌活性测试
1.3.4.1 菌种活化
4 ℃冰箱中取出金黄色葡萄球菌与黑曲霉菌株;借助超净工作台无菌条件下将金黄色葡萄球菌接种于LB琼脂培养基平板上,37 ℃培养24 h条件下连续活化2次;同样在无菌条件下将黑曲霉菌接入PDA培养基平板上,28 ℃培养5～7 d至菌丝长势良好且大量产孢;挑取少量活化后的金黄色葡萄球菌与黑曲霉菌落,用无菌生理盐水制成菌体浓度为10-6～10-7 CFU/mL的菌悬液待用。
1.3.4.2 抑菌活性测定
采用药敏纸片法测定2种精油抑菌活性[16]。打孔器将110 mm定性滤纸打成直径6 mm圆形纸片,置于洁净干燥离心管中,报纸包好置于高压灭菌锅121 ℃持续15 min后50 ℃烘箱中烘干备用。无菌条件下将纸片分别放入装有佛手柑和丑橘果皮精油的试管中,用保鲜膜密封试管口浸泡1.5 h后取出沥干。各取0.2 mL金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌供试菌悬液,均匀涂布于LB及PDA培养基平板上,用无菌镊子夹取沥干后的浸提液滤纸片置培养基表面,压紧贴实,毎皿3片,倒置于37 ℃恒温培养箱培养48 h,十字交叉法测抑菌圈直径,所有实验重复3次,记录数据计算平均值。
2 结果与分析
2.1 两种柑橘果皮精油成分及其随保存时长的动态变化
提取后不同时长条件下,佛手柑与丑橘精油的GC-MS总离子流图及其对应成分及其相对含量如图1、图2和表1、表2所示。新鲜佛手柑精油含有10种成分且以烯类物质占优势,尤以柠檬烯居多(占总含量46.87%),紧随其后是香芹烯(32.34%)和月桂烯(10.99%),而α-蒎烯、桧烯等其他成分均低于5%甚至1%。新鲜丑橘精油成分种类少于佛手柑精油,含有的7种成分中也以烯类为主,含量最高的也是柠檬烯(69.77%),紧随其后的是月桂烯(10.5%)和芳樟醇(7.91%),其余各成分的相对含量均不足5%。
a-0 d;b-3 d;c-8 d;d-15 d;e-22 d
图1 佛手柑精油在不同保存时长下的总离子流图
Fig.1 Total ion chromatogram of bergamot peel essential oil under different storage periods
a-0 d;b-3 d;c-8 d;d-15 d;e-22 d
图2 佛手柑精油在不同保存时长下的总离子流图
Fig.2 Total ion chromatogram of ugly mandarin peel essential oil under different storage periods
表1 佛手柑精油成分及其相对含量随保存时长的动态变化
Table 1 Components and relative contents of bergamot essential oil and their dynamic changes with storage time
序号名称分子式相对含量/%0 d3 d8 d15 d22 d1α-蒎烯C10H164.842.491.830.240.152桧烯C10H162.512.720.880.210.053月桂烯C10H1610.996.053.011.620.6843-蒈烯C10H160.481.050.770.3905柠檬烯C10H1646.8747.8652.2656.1956.616芳樟醇C10H18O1.561.280.640.0907香芹烯C10H1632.3438.5540.6141.2642.518柠檬醛C10H16O0.2000009薄荷醇C10H20O0.19000010α-松油醇C10H18O0.020000
表2 丑橘精油成分及其相对含量随保存时长的动态变化
Table 2 Components and relative contents of ugly mandarin essential oil and their dynamic changes with storage time
序号名称分子式相对含量/%0 d3 d8 d15 d22 d1α-蒎烯C10H163.742.963.092.490.572桧烯C10H164.173.863.972.550.673β-蒎烯C10H161.291.631.751.120.084月桂烯C10H1610.5011.3810.768.644.7153-蒈烯C10H162.622.561.210.520.236柠檬烯C10H1669.7770.8677.4483.2393.727芳樟醇C10H18O7.916.751.781.450.02
2种精油因所含不同物质挥发速度不同,导致其随保存时间延长呈现出不同的相对含量动态变化特征。佛手柑精油中的α-蒎烯、桧烯、月桂烯、3-蒈烯、芳樟醇、柠檬醛、薄荷醇、α-松油醇等烯、酮以及醇类物质的相对含量呈逐渐减少趋势。其中,α-蒎烯、月桂烯等挥发速度较快;柠檬烯、香芹烯的相对含量呈持续增加趋势;第22天时,佛手柑精油10种物质仅余5种(图3-A)。
A-佛手柑;B-丑橘
图3 佛手柑与丑橘果皮精油各组分的相对含量较前一时间节点的变化率
Fig.3 Change rate of relative content of each component in peel essential oil from bergamot and ugly orange compared to the previous time point
与之类似,丑橘精油中α-蒎烯、桧烯、3-蒈烯以及香芹烯相对含量呈持续减少趋势;其中α-蒎烯、芳樟醇挥发速度较快;β-蒎烯、月桂烯的相对含量呈先增加后减少变化趋势;柠檬烯相对含量呈持续增加趋势;至第22天时,丑橘精油7种物质均有残余(图3-B)。
2.2 两种柑橘精油对芒果保鲜效果
对照组与2种柑橘精油处理组的芒果外观随保存时长动态变化如图4和图5所示。前3 d各组芒果的外观颜色等无明显差异,但随保存时间延长,各组均从第6天开始出现表皮腐斑;之后,随保存时间的延长,腐斑数量与面积不断增加。精油处理组的芒果表面腐斑数量、面积均少于对照组,且同种精油处理下1.0 mL组较0.5 mL组效果更佳。精油用量相同时,丑橘精油的作用效果优于佛手柑精油。
图4 佛手柑精油对不同保存时长芒果外观的影响
Fig.4 Effect of bergamot essential oil on the mango appearance with different storage time
图5 丑橘精油对不同保存时长芒果外观的影响
Fig.5 Effect of ugly orange essential oil on the mango appearance with different storage time
对比各组不同时间节点下芒果腐烂指数也可知,从第6天开始芒果腐烂进程加快,表现为对照组和精油处理组的腐烂指数均明显增加;但2种精油处理有效抑制了芒果腐烂进程,且丑橘精油效果更佳(图6),表现在精油处理组的腐烂指数在第6天后显著低于对照组,且丑橘处理组腐烂指数低于佛手柑处理组;同一精油则表现为高剂量组效果优于低剂量组。
A-佛手柑精油;B-丑橘精油
图6 佛手柑精油与丑橘精油对芒果腐烂指数的影响
Fig.6 Effect of peel essential oil of bergamot and ugly orange on decay index of mango
精油处理对芒果表皮中叶绿素含量的影响如图5所示。随着贮存时间延长,芒果表皮叶绿素含量逐渐减少;佛手柑精油(图7-A)与丑橘精油(图7-B)处理均有效抑制了果皮叶绿素含量减少进程,且精油前6 d的作用效果优于后续阶段;所有各观测时间节点下,丑橘处理组芒果皮中叶绿素含量均高于同浓度下佛手柑精油组,但同种精油不同用量处理组间的叶绿素含量差异不显著(P>0.05)。
A-佛手柑精油;B-丑橘精油
图7 佛手柑精油与丑橘精油对芒果表皮叶绿素含量的影响
Fig.7 Effect of peel essential oil of bergamot and ugly orange on chlorophyll content in mango peel
芒果果肉糖酸比与果皮叶绿素含量规律相似,随贮存时长呈减少趋势(图6)。对照组糖酸比从第0天的38.3减少到第10天的1.4;较对照组,佛手柑精油(图8-A)与丑橘精油(图8-B)均对果肉糖酸比的减少有显著抑制效应,且时间越短抑制效应越明显;除第6天外的大部分时间节点下,丑橘精油处理组的果肉糖酸比高于佛手柑精油处理组;与叶绿素含量不同的是,同一精油不同用量组间的糖酸比差异显著,表现为精油用量越高,糖酸比越大(P<0.05)。
A-佛手柑精油;B-丑橘精油
图8 佛手柑精油与丑橘精油对芒果果肉糖酸比的影响
Fig.8 Effect of peel essential oil of bergamot and ugly orange on the sugar acid ratio in mango flesh
2.3 两种精油对金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌的抑制效果
2种精油对芒果腐烂进程中常见微生物金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌的抑菌圈测试结果如图7所示。结果显示,2种精油均对金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌表现出良好的抑制效应;但两者对属于细菌的金黄色葡萄球菌抑制效果优于归属真菌的黑曲霉菌(图9-A);横向比较2种精油作用效果可知,丑橘精油抑菌效果优于佛手柑精油(图9-B)。
A-佛手柑精油与丑橘精油对金黄色葡萄球菌的抑制效果优于黑曲霉菌;B-丑橘精油对金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌的抑制效果优于佛手柑精油
图9 佛手柑精油与丑橘精油对金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌的抑制效果
Fig.9 Inhibitory effect of bergamot essential oil and ugly orange essential oil on Staphylococcus aureus and Aspergillus niger
3 结论
3.1 佛手柑和丑橘精油果皮精油成分及其随保存时间变化规律存在异同
柑橘类果皮的特殊结构油胞中富集伴随果实成熟产生的挥发性精油。本研究结果显示,佛手柑和丑橘果皮精油与其他柑橘果皮精油类似,含多种不同组分且主要成分均为萜烯类化合物及其含氧衍生物[2]。2种精油均以柠檬烯含量最高,但两者所含成分种类数目及各成分的含量占比均不尽相同,这可能与两者遗传背景及产地环境因子的差异密切相关。
监测2种精油的成分与含对含量随保存时间的变化规律可知,虽然2种精油所含各组分均具挥发性,但不同物质挥发速度不同,导致所含组分的相对含量呈现出持续减少、先增后减、持续升高等不同的变化趋势。2种精油活性成分的成分构成、含量多寡及其随保存时长变化特征的确定,为两者后续活性测试、单体分离、结构修饰、产品研制等工作奠定了基础。值得注意的是,两者共有的主成分柠檬烯虽然也随保存时间持续挥发减少,但由于其在精油中含量高且挥发速度相对较慢,因此即使保存22 d后其在2种精油中依然有大量剩余,从而为2种精油实际应用赋予了实效的持久性;在此基础上,若令其与壳聚糖、海藻酸纳等进行复合涂膜处理,可能会进一步增强其缓释性,从而提高效果和降低成本[17-18]。
3.2 佛手柑和丑橘精油果皮精油对芒果表现出良好保鲜效果
不同植物精油虽然来源部位、理化性质可能差异显著,但它们中的多数均被证明能延缓果蔬腐烂进程、延长保鲜期。外观变化是反映水果腐烂程度和保鲜效果好坏最直观的指标。不管是可直接观察的表观色泽与黑斑数,还是经计算可得的腐烂指数,本研究所得结果均显示2种精油对芒果产生了明显保鲜效果。除表观指标外,果皮中叶绿素和果肉中可溶性糖含量会随贮存时间延长而下降,而果肉中的可滴定酸含量则会不断上升,因此它们也是衡量保鲜效果的重要指标,人们可以跟踪测定果皮叶绿素含量及果肉中的糖酸比可来反映保鲜效果的优劣,即叶绿素含量和糖酸比减少程度越小则效果越佳,反之效果越差[14]。本研究结果显示,佛手柑精油与丑橘精油均有效减缓了芒果果皮叶绿素含量、果肉糖酸比的降低程度,且贮存时间越短精油的作用效果更佳,且2种柑橘果皮精油均对相同保存时间相同剂量条件下,丑橘精油效果优于佛手柑精油。基于目前研究结果及已有文献报道,推测佛手柑与丑橘果皮精油的持续挥发使其在保鲜盒这一相对密闭空间内维持着一定浓度,并通过抗氧化降低了果皮表面黑斑数量和面积的增加,通过减缓细胞凋亡延缓了叶绿素含量的衰减,并抑制果肉细胞呼吸降低果肉细胞糖代谢速率。除果皮叶绿素含量外,表征精油保鲜效果的其他指标,高剂量组效果均优于低剂量组,提示两者的水果保鲜效果存在剂量依赖性[19]。
3.3 佛手柑和丑橘精油可有效抑制金黄色葡萄球菌及黑曲霉菌
细菌、真菌等处于不同进化等级的各类微生物与人类生产生活息息相关,其给人类带来了许多便利、益处的同时,也带来了各种烦恼、不便甚至疾病。毋容置疑,微生物的感染与繁殖是导致采摘后果蔬腐烂变质的关键原因。微生物大量繁殖除严重影响水果外观及其贮存时长、经济价值、营养价值外,有些微生物分泌的有毒有害物质还会威胁人类健康。挥发后弥散于保鲜盒空气中或附于芒果表面的佛手柑与丑橘果皮精油,除发挥了前述抗氧化、抑制细胞凋亡、降低细胞呼吸速率等作用外,还可能抑制了诱发水果腐烂变质各类微生物的生长繁殖,甚至直接杀死部分微生物种类。本研究以典型细菌代表金黄色葡萄球菌,典型真菌代表黑曲霉作为2种精油的作用对象,结果发现佛手柑精油和丑橘精油均对2种水果表面常见的微生物具有良好的抑制效果,这与其他学者发现植物精油对尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、黄色镰孢菌和立枯丝核菌等多种病原微生物有显著抑制效果一致,进一步证明了精油普遍具有抑菌的生物学活性[20]。植物精油大多可以通过抑制细胞壁合成、改变质膜通透性、影响细胞代谢而表现出良好抑菌活性,从而在天然抑菌剂开发应用中表现出显著潜力[21-22]。此外,本研究发现,2种精油对金黄色葡萄球菌抑制效果优于黑曲霉菌,提示两者对细菌的作用效果优于真菌;另一方面,丑橘精油对2种微生物的作用效果优于佛手柑精油,这与两者保鲜效果优劣表现一致,提示抑菌是2种精油具有水果保鲜功效的重要原因,丑橘精油效果更佳可能与其含有更高含量的柠檬烯有关。当然,2种精油发挥抑菌功能的同时,还可能通过诱导果实内源激素合成以及糖代谢基因表达等多种途径的协同达到延缓芒果腐烂变质进程的效应[23]。
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