我国传统审美中素有“一白遮百丑”的认知,随着居民消费水平提升,消费者对天然来源、可持续性美白化妆品成分的需求显著增长。当前美白化妆品的研发多以抑制酪氨酸酶活性为核心策略,这源于酪氨酸酶在黑色素合成中的关键作用。
酪氨酸酶(tyrosinase)是黑色素合成通路中的关键限速酶,作为一种含铜金属氧化还原酶,其广泛存在于微生物、植物及动物体内[1]。该酶可通过两步催化反应调控黑色素生成:首先催化酪氨酸羟化生成左旋多巴L-3,4-二羟基苯丙氨酸(2,3-dihydroxy-L-phenylalanine, L-DOPA),进而将左旋多巴氧化为左旋多巴醌,最终经一系列非酶促聚合反应形成黑色素。当黑色素代谢失衡、过度沉积时,可引发雀斑、黄褐斑等色素沉着性皮肤病,严重时甚至可能诱发黑色素瘤[2],因此酪氨酸酶成为美白活性成分研发的核心靶点。尽管目前相关文献已报道多种酪氨酸酶抑制剂,如曲酸、熊果苷、维生素C(抗坏血酸)及对苯二酚等[3],但这些抑制剂普遍存在局限性:如对苯二酚具有明显细胞毒性,维生素C体外稳定性差、皮肤渗透性低,另有成分存在皮肤致敏性、长期使用潜在致癌风险及临床疗效不足等问题[4]。因此,从天然产物中发掘高效、安全的新型酪氨酸酶抑制剂具有重要意义。
植物甾醇(phytosterol)是一类广泛存在于植物体内的四环三萜类天然化合物,其生物结构与功能同胆固醇类似,均具有环戊烷全氢菲骨架及位于C-17位的侧链[5]。植物甾醇作为稳定植物细胞膜的必要成分,广泛存在于植物油、坚果、谷物以及豆类中,目前已鉴定出超200种的植物甾醇,其中谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇(stigmasterol,SMR,C29H48O)含量最为丰富[6],与胆固醇相比,这3种化合物的结构差异均体现在侧链上:C-24位存在一个甲基或乙基取代;其中,豆甾醇在C-22位还额外具有一个双键[7],其结构见图1。
图1 豆甾醇的结构
Fig.1 Structure of stigmasterol
SMR又名豆固醇,其存在于许多植物中,如卷心菜、长蕊丝石竹、拟南芥、水白芷、蓝桉树、小立碗藓[8]等。现代药理学研究已揭示SMR具有广泛的生物活性,包括抗炎、抗氧化、降低胆固醇及潜在的抗肿瘤作用等[9-10]。由于SMR含碳碳双键结构使其容易被氧化,这一特性支持了其可作为一种抗氧化剂有效地缓解氧化应激,因此推测SMR可能是一种潜在的酪氨酸酶抑制剂。
本研究旨在通过体外实验,系统地评估SMR对酪氨酸酶的抑制作用,阐明SMR对酪氨酸酶活性的抑制类型,结合分子对接技术从分子水平分析其机理,为开发以SMR为原料的天然美白化妆品提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
SMR(CAS:83-48-7,HPLC≥98%),四川省维克奇生物科技有限公司;酪氨酸酶(菌菇,活性≥500 U/mg),合肥巴斯夫生物科技有限公司;左旋多巴(CAS:59-92-7),上海源叶生物科技有限公司;曲酸(CAS:501-30-1,Purity≥99.5%),合肥千盛生物科技有限公司;磷酸盐缓冲溶液,北京兰杰科技有限公司;无水乙醇(分析纯),成都金山化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
HHS-21-4数显恒温水浴锅,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;K6300B酶标仪,北京凯奥科技发展有限公司;FA2104 N分析天平,上海菁海仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 酪氨酸酶活性抑制实验
参照张春子等[11]的方法,反应在96孔板中进行,按表1所示的反应体系,每孔平行3次,37 ℃条件下反应20 min后,用酶标仪测定475 nm处的OD值。以SMR质量浓度对数为横坐标,抑制率的分布概率为纵坐标,绘制标准曲线,计算IC50值。以PBS作为空白对照,计算化合物的抑制活性。以曲酸为阳性对照。豆甾醇对酪氨酸酶活性的抑制率(Y,%)的计算如公式(1)所示:
(1)
表1 酪氨酸酶抑制实验反应体系
Table 1 Reaction system for tyrosinase inhibition assay
反应体系SMR/μL酪氨酸酶/μLL-DOPA/μL磷酸盐缓冲溶液/μLA1505010050A250—100100C1—50100100C2——100150
注：“—”表示未添加。
式中:C1,空白组(酶+缓冲液+L-DOPA)OD值;C2,空白对照组(缓冲液+L-DOPA)OD值;A1,样品组(抑制剂+酶+L-DOPA)OD值;A2,样品对照组(抑制剂+缓冲液+L-DOPA)OD值。
1.3.2 酪氨酸酶抑制动力学分析
1.3.2.1 SMR对酪氨酸酶抑制可逆性分析
参照倪丹等[12]的方法按照上述步骤,固定底物L-DOPA质量浓度为1.5 mmol/L,改变SMR质量浓度(2、1.5、1.0、0.5、0 mg/mL)分别与0、60、80、100、120 U/mL的酪氨酸酶溶液37 ℃下孵育20 min,测定475 nm处吸光度。以酪氨酸酶质量浓度(U/mL)作横坐标,并以反应的初速率v(ΔOD475nm/min)作为纵坐标绘图,对抑制作用的可逆性进行评估。其判断依据为:若所得的一组直线均通过坐标原点,则表明为可逆抑制;若为一组斜率相同的直线,则归属为不可逆抑制[13],以此来评估SMR对酪氨酸酶的抑制效果的可逆性。
1.3.2.2 SMR对酪氨酸酶抑制类型判断
固定酪氨酸酶浓度为100 U/mL,改变SMR质量浓度(0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL),分别与系列浓度的L-DOPA(0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L)在37 ℃下反应。利用酶标仪于475 nm下监测吸光度,间隔1 min记录一次,持续20 min,以测定反应初速率。基于Lineweaver-Burk双倒数作图法,求算SMR抑制酪氨酸酶的动力学参数并判断其抑制类型。该分析通过构建底物L-DOPA质量浓度的倒数(1/[S])对反应初速率的倒数(1/[V]),根据直线特征对抑制类型进行归属[14]。用于参数计算的Lineweaver-Burk形式如公式(2)所示:
(2)
式中:v,不同底物浓度下的初速率值,ΔOD475nm/min;Vmax,最大反应速率,ΔOD475nm/min;Km,米氏常数,mmol/L;[S],底物L-DOPA浓度,mmol/L。
1.3.3 分子对接
分子对接,参照林海生等[15]和NBILI等[16]的方法并作出调整。分别通过PDB数据库(https://www.rcsb.org)下载酪氨酸酶(PDB:2Y9X)三维结构文件,对其进行去水、加氢,对其中的氨基酸进行修饰、加氢后为受体;通过TCMSP(https://www.tcmsp-e.com)数据库下载SMR(CAS:83-48-7)三维结构文件,对其去水、加氢后为配体;运用Auto Dock Toolkit软件(Ver 1.5.6)分别对酪氨酸酶受体及配体SMR进行去水处理、加氢及氨基酸残基修饰后,再进行对接模拟来探讨SMR与酪氨酸酶之间存在的关系。设BOX盖住所有可能作用区域,输入相应参数后对接50次,选择具有最佳结合能的构象。运用AutoDockTools软件获得最终最优的分子对接能量值,Pymol绘制出其对接示意图。
1.3.4 分子动力学模拟
为进一步探究配体-蛋白质相互作用的稳定性,使用YASARA软件对大蛋白与小分子的结合情况进行分子动力学模拟。将配体与受体结构导入处理,设置pH环境为7.4,设置模拟盒子的大小“Extend=5.0”(即盒子向外扩张的距离),将模拟盒子设置为周期性,最后对体系能量进行优化,按照既定力场和模型进行模拟。完成上述操作后,进行一次时长为50 ns的分子动力学模拟,从而更深入研究配体与受体之间的结合情况。
1.4 数据处理
所有实验重复测定3次,使用Excel 2021、Origin 2024 软件进行数据分析和作图。
2 结果与分析
2.1 SMR对酪氨酸酶抑制作用
由图2可知,SMR对酪氨酸酶存在抑制作用,且随着SMR质量浓度上升,对酪氨酸酶的抑制率逐渐增强,这表明SMR对酪氨酸酶的抑制效果与其剂量有较强的相关性。以SMR质量浓度为横轴,抑制率作为纵轴绘制曲线,得到回归方程是y=0.192 5lnx+0.507 4,R2=0.960 7。通过计算,SMR对酪氨酸酶的半抑制浓度(IC50)为1.19 mg/mL,阳性对照曲酸对酪氨酸酶抑制作用的IC50=0.145 mg/mL。SMR对酪氨酸酶的抑制作用与质量浓度呈正相关,即使抑制效果低于曲酸,但其对酪氨酸酶具有较好的抑制作用,可能作为潜在的天然来源的酪氨酸酶抑制剂。
a-豆甾醇;b-曲酸
图2 豆甾醇、曲酸对酪氨酸酶的抑制活性
Fig.2 Inhibitory activities of stigmasterol and kojic acid on tyrosinase
2.2 酶促反应动力学特性分析
2.2.1 SMR对酪氨酸酶抑制可逆性分析
抑制剂与酶的结合分为可逆与不可逆,为分析SMR对酪氨酸酶的抑制作用是否可逆,不同SMR质量浓度下,构建了以酶浓度(U/mL)和反应速率v[mg/(mL·min)]为横纵坐标的曲线图,具有不同表现形式。在可逆抑制中,随着抑制剂浓度的增加,直线斜率逐渐减小且交于原点;而不可逆抑制,直线斜率保持不变,直线中不存在交点。如图3所示,拟合曲线均交于原点,呈较好的线性关系。添加了SMR曲线斜率均小于空白组的曲线斜率,随着SMR质量浓度的增加,曲线斜率逐渐减小,这表明SMR的添加在没有改变酶数量的前提下降低了酶活性,使酶分解底物的能力降低,因此SMR对酪氨酸酶的抑制类型为可逆抑制[17],SMR与酪氨酸酶的反应过程中是以非共价键的形式与酶进行结合,并且只是影响了酪氨酸酶的反应速率,并未阻碍反应的发生[18]。
图3 不同质量浓度SMR对酪氨酸酶抑制的可逆性分析
Fig.3 Analysis of the reversibility of tyrosinase inhibition by stigmasterol at different concentrations
2.2.2 SMR对酪氨酸酶的抑制类型判断
酶抑制动力学研究结果显示,不同的酶抑制机制类型会导致其动力学参数呈现出不同变化,这种差异主要体现在米氏常数Km值和最大反应速率Vmax值上。抑制剂可表现为2种酶抑制类型:可逆抑制与不可逆抑制。可逆抑制可进一步分为四类:竞争性抑制、非竞争性抑制、非竞争性抑制及混合抑制,其中混合抑制是竞争性与非竞争性抑制的组合[17]。酶抑制动力学Lineweaver-Burk直线都交于一点:竞争型抑制类型表现为Km值增大,Vmax值不变,Lineweaver-Burk双倒数直线交于纵轴;非竞争型抑制类型表现为Km值不变,Vmax值变小,Lineweaver-Burk双倒数直线交于横轴;混合型抑制类型表现为Km值增大,Vmax值减小,双倒数直线交于第二象限[19]。
通过Lineweaver-Burk双倒数曲线方程作图,见图4,SMR抑制酪氨酸酶的动力学参数见表2。
表2 SMR对酪氨酸酶的抑制动力学参数
Table 2 Inhibitory kinetic parameters of stigmasterol on tyrosinase
SMR质量浓度/(mg/mL)米氏方程Km/(mmol/L)Vmax/(ΔOD475nm/min)KI/(mg/mL)KIS/(mg/mL)0y=49.469x+49.3461.00.0201.172.680.5y=60.344x+49.021.230.0201.0y=72.811x+56.8271.280.0181.5y=102.8x+68.1051.510.0152.0y=122.34x+811751.510.012
a-不同质量浓度SMR对酪氨酸酶抑制的Lineweaver-Burk双倒数图;b-斜率;c-截距随SMR质量浓度变化的二次图
图4 Lineweaver-Burk双倒数曲线
Fig.4 Lineweaver-Burk plot
Lineweaver-Burk双倒数直线作图结果显示,得到一组在第二象限相交的直线(图4-a)。随着抑制剂浓度的增加,动力学参数Km逐渐升高,而Vmax逐渐降低,因此可确定SMR对酪氨酸酶表现出混合型抑制作用。直线的斜率和垂直截距对SMR质量浓度进行二次作图,各组的拟合直线均呈现出良好的线性关系,表明其与酪氨酸酶有1个或一类抑制位点[20]。抑制常数KI和KIS分别为1.17 mg/mL和2.68 mg/mL,KI<KIS,可表明SMR与游离酶的亲和力高于其与酶-底物复合物的亲和力。据此推断SMR一方面通过竞争性抑制作用与游离酶结合,另一方面又通过非竞争性抑制作用与酶-底物复合物结合,表明SMR对酪氨酸酶抑制作用属于典型的竞争性-非竞争性混合抑制[21]。
2.3 SMR与酪氨酸酶相互作用的分子对接模拟分析
分子对接是结构分子生物学研究的重要工具,常用于探究蛋白质与小分子配体的结合模式,进而明确二者相互作用的结合位点及分子作用力类型,如氢键、疏水作用、范德华力等[22]。一般来说,配体小分子与受体蛋白的结合亲和力可通过能量值划分活性等级:结合能小于-4.25 kcal/mol时,二者存在一定结合活性;小于-5 kcal/mol时,具有较好结合活性;小于-7.0 kcal/mol时,则表现出较强结合活性[23]。设置分子对接次数为50后,结果如图5所示。SMR与酪氨酸酶活性口袋能够自发结合,其结合自由能为-5.65 kcal/mol,表明两者之间可以形成稳定的复合物。其结合微环境由ASN-22、GLY-78、LYS-25、GLN-23、TRP-2和ASP-1等关键氨基酸残基构成。其中,SMR与氨基酸残基ASN-22之间形成2个氢键,键长分别为2.2、2.6。SMR与酪氨酸酶之间产生良好的结合性能,氢键可以使得复合物稳定,SMR与酪氨酸酶形成的复合物能有效阻止底物进入酶的活性中心,进而影响酶的活力。
图5 SMR与酪氨酸酶的分子对接
Fig.5 Molecular docking of stigmasterol with tyrosinase
2.4 分子动力学模拟
使用分子动力学模拟SMR与酪氨酸酶的灵活性和稳定性,获得SMR与酪氨酸酶的均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)和均方根波动(root mean square fluctuation, RMSF)结果。RMSD测量随时间的结构变化,值越低表明结合越稳定[24]。
RMSD分析显示(图6-a),在模拟初期(0～70 ns)波动明显,随后进入一个相对平稳的状态,表明SMR-酪氨酸酶复合物已达到了构象平衡状态。复合物结构没有发生剧烈的、颠覆性的变化,SMR稳定地结合在口袋中,整个体系处于一个稳定的状态。RMSF分析(图6-b),SMR-酪氨酸酶复合物在模拟时间内结构稳定。图谱显示了蛋白质固有的环区、末端和刚性分布模式[24-25]。峰值最高的环区很可能是与功能相关的关键区域,推测SMR结合在活性中心,可能限制了这些柔性环的运动,从而抑制了酶的活性。
a-SMR-酪氨酸酶复合物的RMSD随模拟时间的变化曲线;b-SMR-酪氨酸酶复合物中残基的RMSF分布曲线
图6 SMR与酪氨酸酶的分子动力学模拟图
Fig.6 Molecular dynamics simulation of stigmasterol with tyrosinase
3 结论
本研究综合运用酶动力学分析、分子对接及分子动力学模拟等技术,系统深入地探究了SMR对酪氨酸酶的抑制作用及其分子机理。酶促动力学实验表明SMR对酪氨酸酶的抑制作用为可逆抑制,竞争性-非竞争性混合型抑制,同时SMR与游离酶的亲和力更强。分子对接结果显示SMR和酪氨酸酶有多个结合位点,能够通过氢键自发嵌入酶活性中心,此举既能竞争性阻隔底物结合,又可非竞争性地与酶-底物复合物结合、干扰催化功能。综上所述,SMR可以抑制酪氨酸酶的活性,能减少黑色素生成,发挥美白作用。本研究为SMR在美白护肤品和色素沉着性疾病治疗中的应用提供了理论基础,为开发基于SMR的新型天然酪氨酸酶抑制剂提供了理论依据,具有潜在的临床应用价值。
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