高温大曲作为酱香型白酒的糖化发酵剂,是其生产工艺的重要组成部分[1]。它以小麦为主要原料,经高温(>60 ℃)堆积发酵形成富含细菌和丝状真菌的群落[2]。这些微生物通过相互作用与协同代谢塑造了大曲的核心功能特性,进一步影响酱香型白酒的香气与风格[3-4]。在发酵过程中会自然形成黑、白、黄这3种不同颜色的大曲,其中黄曲作为高温大曲的主要产物(收率约80%),其理化性质和微生物群落更均衡,是酱香型白酒酿造的核心发酵剂[5]。
高温大曲发酵过程的管控与产品性能密切相关,其中水分是衡量大曲发酵进程与质量的关键指标之一[6],在润麦、拌曲配料等工序中,受人工经验差异和季节变化影响,水分添加量易出现波动,进而导致曲块水分含量不稳定(新鲜曲块的水分通常在35%～40%)[7-8]。大曲发酵期间,微生物代谢需依赖于适宜的水分条件,随着发酵进行与后续贮存,水分含量逐步下降(最终成品曲水分降至12%～15%),此过程常伴随酸度降低,同时引发其他性能指标的波动[9]。安曲后的补量水操作是高温大曲生产的传统工艺之一,其通过喷洒量水(投粮量的2.0%～5.0%)以调节曲房湿度,减少曲块表面干裂[10]。近年来,随着高通量测序技术的发展,高温大曲微生物群落的研究逐渐深入。多项研究表明,大曲微生物群落受温度、水分影响显著。例如,有研究发现,高温大曲固态发酵过程中水分下降伴随温度升高,导致细菌群落Chao1指数显著降低,而耐热性强的菌属(如芽孢杆菌属Bacillus)则成为优势菌群[11];另有研究显示[12],在理想水分温度条件下,黄曲的微生物群落结构与功能更为稳定。由此可见,在大曲生产中,曲块水分控制极为关键。然而当前研究多集中于润麦和拌料阶段的水分控制,对于补量水操作影响微生物群落的机制尚不明确。
因此,本研究以黄曲作为研究对象,通过设置实验组(安曲后补量水)与对照组(安曲后不补量水)同步监测温度、湿度等理化参数变化;结合宏基因组技术对比分析2组微生物群落的动态变化,深入探究补量水操作对高温大曲菌群结构及功能的影响。这一研究不仅有助于揭示大曲发酵过程的内在机制,更能为优化高温大曲生产工艺提供理论支撑,助力酱香型白酒产业向精细化方向发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
氢氧化钠、葡萄糖、酒石酸钾钠、五水硫酸酮、浓盐酸、可溶性淀粉、次甲基蓝(分析纯),天津市科密欧化学试剂有限公司;FastDNA®土壤DNA提取试剂盒,美国MP Biomedicals公司;琼脂糖,美国Thermo Scientific公司;GelRed核酸凝胶染料,中国兰杰柯科技有限公司。
1.2 仪器与设备
LCD-110加长探头不锈钢数显温度计,衡水创纪仪器仪表有限公司;SW-572数字式温湿度计,深达威仪器有限公司;5424R高速台式冷冻离心机,德国Eppendorf公司;NanoDrop2000超微量分光光度计,美国Thermo Scientific公司;JY600C双稳定时电泳仪,北京君意东方电泳设备有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 制曲工艺与分组
高温大曲生产工艺流程主要包括:
小麦→润麦→粉碎→加水、母曲拌合→曲坯制作→晾曲→安曲→喷洒量水(补量水)→保温培菌(含翻曲)→拆曲出仓→贮存
选用优质白皮软麦作为原粮,进行高温大曲制曲实验。首先,对小麦进行润湿处理,随后将其粉碎并加入适量水搅拌均匀,通过机械压制形成大曲块,并自然晾干。随后对曲块进行人工安曲,40 d的发酵期内进行2次翻曲。发酵完成后将曲块拆解并入库贮存。该批曲块的生产周期为2023年4月中旬～5月中下旬。
实验设实验组与对照组,2组均采用统一分层安曲方式(共堆叠曲块5层,铺覆稻草共6层),仅安曲后的补水量存在差异:实验组在每层稻草铺覆后,向其表面均匀喷洒量水(采用高压水枪雾化喷洒,每个刻度线喷洒每层固定区域),总用量相当于小麦质量的2.5%;对照组则仅按上述分层方式安曲,不进行喷洒量水操作。
1.3.2 样品采集与处理
为保障实验条件一致性,实验组与对照组分别置于相邻的2间曲房中,2间曲房建筑结构、朝向、通风条件完全一致。曲块摆放规则:每组曲块在各自曲房内的空间位置完全对称,确保2组曲块暴露于相同的微环境。同时在固定时间执行翻曲,确保通风时长、翻曲力度一致。
采样时间点为曲块入房安曲0 d、首次翻曲7 d、第2次翻曲14 d以及拆曲40 d,由同一技术人员从2个曲房曲堆的相同空间位置,各随机抽取3块符合正常发酵标准的黄曲样本,2组共取24个样品。取出部分样品于4 ℃保存,用于理化指标分析;其余样品经粉碎分装后,将同组同时间点的3个生物学重复样品等量混合,制备成一份复合样本,于-80 ℃保存,用于后续高通量测序分析。
1.3.3 理化指标检测
1.3.3.1 曲块温度
曲块发酵过程中,在曲房靠窗、中间、靠门位置向曲堆中心插入一支长2 m的探头温度计,每天定时记录。
1.3.3.2 环境及曲房温、湿度
环境温湿度通过悬挂在2间曲房外相邻墙面的温湿度计记录,曲房内温湿度则在靠门、中间2个位置悬挂温湿度计监测,两类温湿度数据每天同步定时记录。
1.3.3.3 曲块水分、总酸、还原糖、淀粉含量
参照QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》对样品水分、总酸、还原糖、淀粉含量进行测定。
1.3.4 样品DNA提取
根据FastDNA®土壤DNA提取试剂盒说明书进行微生物群落总基因组DNA抽提。完成DNA抽提后,检测DNA浓度和纯度,利用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。
1.3.5 宏基因组测序及分析
DNA质检合格后,由上海美吉生物医药科技有限公司构建PE文库并用Illumina NovaSeq 6000平台完成宏基因组测序。采用Fastp(Fast Preprocessor)(https://github.com/OpenGene/fastp,version0.20.)和BWA(Burrows-Wheeler Aligner)(http://bio-bwa.sourceforge.net,version 0.7.9a)进行数据质控并去除宿主DNA;再用MEGAHIT(https://github.com/voutcn/megahit,version 1.1.2)对优化序列进行拼接组装;然后Prodigal/MetaGene(http://metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/)对拼接结果中的contigs进行ORFs预测;接下来CD-HIT(http://www.bioinformatics.org/cd-hit/,version 4.6.1)对所有样品预测出来的基因序列进行聚类并构建非冗余基因集;以及SOAPaligner软件(http://soap.genomics.org.cn/,version 2.21)开展基因丰度计算;最后用Diamond(http://www.diamondsearch.org/index.php,version 0.8.35)进行物种分类学注释。
1.4 数据处理
采用GraphPad Prism 10.1.2进行曲线图、柱状图的绘制,采用Adobe Illustrator 2020对图片进行优化排版,利用美吉云平台(https://www.majorbio.com/)在线工具进行多样性分析、物种与功能组成分析、NR物种注释、关联与模型预测分析;采用联川生物云平台(https://www.omicstudio.cn/tool/)计算Spearman相关性系数并绘制相关性热图和物种与功能贡献度图。原始数据已上传国家基因组科学数据中心GSA数据库(https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa/),数据检索号为CRA027829。
2 结果与讨论
2.1 补量水对高温大曲发酵过程温度、理化指标的影响
大曲发酵过程中,曲块、曲房温度监测显示曲块经历3次升温。如图1-A所示,首次升温(安曲0 d～第1次翻曲7 d)期间,观察到实验组幅度更大,曲块温度56.8 ℃高于对照组52.3 ℃;短暂回落后2次升温,对照组顶温62.8 ℃超过实验组58.5 ℃,提示翻曲通风等操作也可能对温度变化产生重要影响;第2次翻曲14 d后温度骤降至30 ℃左右,因此时曲皮较干而曲心水分充足,微生物代谢再次激活产热,温度缓升至拆曲时约55 ℃。如图1-B所示,曲房温度自第2天起受曲块温度驱动上升,但实验组因打量水蒸发吸热,升温速率及峰值均低于对照组;2次翻曲均致曲房温度短暂下降,第2次翻曲14 d后维持约20 ℃ 数日,最终与环境温度趋同。图1-C表明,曲房湿度初期高,翻曲后先降后升;2次翻曲时再降,20 d后随外界波动下降。发酵过程中(图1-D)曲块水分从安曲时(对照组39.95%实验组41.19%)呈下降趋势,拆曲40 d时实验组(15.20%)显著高于对照组(11.01%);第2次翻曲至拆曲时,水分含量下降幅度较大,这可能是后期开窗通风及大排潮的作用[13]。如图1-E所示,总酸含量呈先升后降趋势,2次翻曲时实验组酸度均高于对照,可能是由于补量水造成环境温度高,而有利于大曲中产酸菌的活性[14];但拆曲时实验组1.41 mmol/10 g干重反低于对照组2.35 mmol/10 g干重,这可能是因为发酵后期通风通氧,产酸微生物代谢减弱,其他微生物占据优势。图1-F表明,淀粉自安曲持续消耗干重,拆曲时对照组残留67.67 g/100 g干重高于实验组64.11 g/100 g干重,这可能是由于对照组水分少导致微生物活性降低,导致淀粉消耗减少。图1-G还原糖先升后降,对照组峰值在第一次翻曲7 d,实验组延迟至第2次翻曲14 d,表明在补量水条件下,还原糖的生成优势持续得更久。
A-曲块温度;B-曲房温度;C-曲房湿度;D-水分含量;E-总酸含量;F-淀粉含量;G-还原糖含量
图1 不同高温大曲样品发酵过程中理化指标变化
Fig.1 Variations in physicochemical indices of different high-temperature Daqu samples during fermentation
注:*P<0.05;**P<0.01(下同)。
2.2 补量水对高温大曲的微生物群落多样性的影响
2.2.1 微生物群落α多样性分析
本研究选用微生物群落丰富度指数(Chao1指数)和多样性指数(Shannon指数)对高温大曲生产过程中微生物群落α多样性进行分析,结果如表1所示。
表1 不同高温大曲样品微生物群落α多样性指数
Table 1 Alpha diversity indices of microbial communities in different high-temperature Daqu samples
样品编号Chao1指数Shannon指数总群落细菌群落真菌群落总群落细菌群落真菌群落对照组_0 d4 0642 5481 1863.593.332.01实验组_0 d4 3352 6801 3253.663.362.37对照组_7 d4 5353 5507664.244.213.71实验组_7 d5 7984 0471 3453.493.403.84对照组_14 d6 4675 1221 0274.214.123.56实验组_14 d4 5213 4238653.363.303.37对照组_40 d4 3092 7151 3353.832.783.43实验组_40 d4 9992 8801 6434.032.693.69
注：数据为3次生物学重复混合样本的测序结果,未计算标准差。
总微生物群落丰富度指数Chao1指数呈现先升后降的趋势,但实验组峰值明显早于对照组,更快完成了微生物群落的定植与竞争平衡。实验组经补量水处理后,Chao1指数于第1次翻曲7 d达峰值(4 047),较对照组第2次翻曲14 d达峰(5 122)提前7 d,提示补水操作可能通过优化环境湿度,从而为细菌增殖代谢创造了条件,并与加速的群落演替进程相关。任婷婷等[15]的研究显示,控温控湿条件下细菌多样性更高,本研究补水调控与之效果相似。实验组真菌群落的Chao1指数随发酵进程呈现出“升-降-升”三阶段波动:初始值为1 325,随后上升至1 345,中期下降至865,最终上升至1 643。对照组则呈现“降-升”双阶段变化:初始值为1 186,随后下降至766回升至1 335,未出现初始增殖期,表明对照组对微生物群落存在初始抑制,而实验组补量水调节环境湿度可能缓解了这一抑制作用。陈俊芳等[16]指出,水分含量是决定真菌α多样性对温度胁迫响应能否维持稳定的关键因素。补量水通过维持环境湿度,可能缓冲了大曲后期发酵升温对热敏感真菌的抑制,从而延缓群落衰退。此外,实验组40 d真菌群落(1 643)丰富度较对照组(1 335)提升了23.1%,印证了HESTRIN等[17]关于湿度促进真菌生长及多样性提升的推论。值得注意的是:7 d实验组真菌丰度(1 345)已明显高于对照组(766),表明补量水可能加速了孢子萌发与菌丝定植进程;至40 d时的高丰富度(1 643),暗示早期水分干预缓解了对真菌群落的初始抑制,还可能促进后期群落的分化。
总微生物群落多样性指数Shannon指数实验组先降后升(14 d谷值→40 d峰值),对照组先升后降(峰值7 d),可能补量水重构了演替路径,微生物多样性下降的是为了筛选富集将群落导向高多样性。值得注意的是,细菌群落的Shannon指数整体下降,真菌群落则相反,这与前人关于细菌多样性减少伴随真菌多样性增加的报道一致[18-19]。这种差异可能源于不同类群对环境变化的适应性分化:例如真菌的丝状结构使其能够重新分配利用水分[20];而补量水可能促进部分优势细菌的增殖,通过资源竞争降低细菌群落的整体多样性(Shannon指数下降)[21]。
2.2.2 微生物群落β多样性分析
在微生物群落主坐标分析结果中如图2所示,0 d的对照组和实验组样品在坐标系中几乎重合,这表明在发酵初期两者微生物群落结构无明显差异,具有相似的初始状态,为后续分析提供了可靠的起点。对照组的微生物群落在7 d和14 d时物种组成相似,表明在没有补量水的操作下,群落演替速度较慢,其结构变化主要受初始群落组成限制,表现出较高的稳定性。然而,实验组在7 d和14 d的物种组成存在较大的差异,这种差异可能与补量水影响微生物群落的生长繁殖有关,实验组7 d与14 d分布在2个象限而对照组在同一象限,可能是由于补量水改变了湿度,进而影响了物种结构,最终导致群落结构发生变化,该现象印证了REN等[22]的研究,即环境条件改变能够促使微生物群落在短期内快速响应并调整其结构和功能,以适应新的环境条件。这一观察结果同样与α多样性分析结果相互印证,这些结果提示,补量水不仅与微生物群落多样性的变化有关,还可能影响了群落的结构和组成,导致微生物群落的演替方向发生改变。
图2 不同高温大曲样品微生物群落主坐标分析
Fig.2 Principal co-ordinates analysis of microbial communities in different high-temperature Daqu samples
最终,在40 d时实验组和对照组虽分布在同一象限内,但横纵坐标却有所不同。这表明在经过一段时间的发酵后,2个实验组的微生物群落虽然仍具有一定的相似性,但已经产生了分化。这可能与补量水改变了大曲的水分条件,进而影响了微生物的生长、代谢和竞争关系有关。这与α多样性分析一致,补量水与真菌生长活跃、发酵前期逐渐表现出优势地位呈现关联;对照组微生物群落演替较慢、结构相对稳定,这与未补量水的处理对应,推测水分条件差异可能对群落特征产生影响。
2.2.3 微生物群落Venn图分析
如图3所示,在0 d时,对比实验组和对照组的样品,重叠部分为共有物种,占比高达75.08%。随着发酵进行,实验组与对照组的共有物种占比从初期的75.08%迅速下降,在随后发酵到40 d内波动幅度趋于平缓。该波动与安曲后补量水操作相关,提示其可能对发酵初期微生物群落产生较强影响。这可能意味着在发酵初期,对照组中的某些微生物开始大量增殖,但随着发酵的进行,这些微生物物种又逐渐减少[23]。相比之下,实验组微生物群落演替方向与对照组存在差异,这与其补量水处理后发酵环境温湿度的变化相伴随。
A-0 d;B-7 d;C-14 d;D-40 d
图3 不同高温大曲样品微生物群落Venn图
Fig.3 Venn diagram of microbial communities in different high-temperature Daqu samples
实验组的特有物种比例从15.28%增加到31.30%降低到8.71%再增加到27.21%,呈现出先增加后减少再增加的波动。这种波动可能反映了实验组中微生物群落的多样性和复杂性,以及它们对发酵条件的敏感性和适应性。这一波动也与补量水操作存在关联,提示补量水可能对微生物群落结构产生影响。研究显示[24],水分增加会促进乳酸菌等优势菌群的形成,并提高生态网络的稳定性,印证了水分或为调控群落演替的关键因子之一。
2.3 补量水对高温大曲微生物群落组成的影响
图4-A展示了不同时间点的微生物群落中真菌和细菌结构组成。结果显示,在制曲过程的0、7、14、40 d,实验组和对照组的细菌群落相对丰度均呈现出先上升后下降的趋势,而真菌群落相对丰度则表现为先下降后上升,这一变化趋势与α多样性分析的结果相符。在40 d时,对照组真菌相对丰度为54.92%,而实验组的真菌相对丰度达到79.59%,比对照组高出24.68%,这种差异表明补量水与真菌群落的生长和积累密切相关。
A-真菌和细菌群落;B-细菌群落(属水平);C-真菌群落(属水平)
图4 不同高温大曲相对丰度百分比堆积图
Fig.4 Stacked chart of relative abundance percentages of different high-temperature Daqu
此外,翻曲后细菌呈“7 d增长、14 d波动、40 d降至最低”的趋势,结合NICOLA等[25]的研究,翻曲通风减少水分,解释了细菌多样性下降。补量水与翻曲对菌群影响显著:实验组真菌丰度更高,细菌随翻曲后水分流失下降,为优化制曲工艺(如调整补水量与通风时长)提供了依据。
在高温大曲样品细菌类群中,共鉴定出107个门、164个纲、296个目、611个科和2 028个属;图4-B所示为细菌属水平群落结构(前20属)。其中,安曲0 d的优势细菌属为变形杆菌属(Proteus),首次翻曲后7 d细菌群落结构发生明显分化,对照组和实验组的优势细菌分别为Caldibacillus(42.2%)和Weissella(34.4%);随着发酵时间的延长,14 d细菌群落进一步分化,对照组的优势细菌逐渐衰退而细菌多样性增加,实验组的优势细菌属转变为克罗彭施泰特氏菌属(Kroppenstedtia)(29.9%);最终在40 d时,对照组的优势细菌属为Kroppenstedtia(48.9%),而实验组则进一步转变为Saccharopolyspora(44.5%)和Caldibacillus(26.5%)占据核心位置。高通量测序显示Saccharopolyspora与Caldibacillus均为发酵特征微生物,其中,Caldibacillus作为典型耐热菌属,能在高温下高效产酶并参与底物降解,对发酵中风味物质合成至关重要;其在40 d成为优势菌属,可能体现了长期高温赋予耐热菌的竞争优势,这与LIN等[26]、张清玫等[27]的研究结论一致。本研究进一步发现,补量水可能与Saccharopolyspora成为优势菌有关,这提示补量水不仅与群落结构变化相关,更可能影响优势菌属的演替方向。丁泽等[28]关于高温改变群落结构的研究,也支持了耐热菌随高温发酵成为优势的现象,共同为高温大曲细菌群落的调控提供了科学依据。
在高温大曲样品真菌类群中,共鉴定出10个门、54个纲、147个目、322个科和807个属;图4-C显示真菌属水平群落结构(前20属),且补量水(实验组)与不补量水(对照组)所表现的群落动态差异存在关联:安曲0 d的优势真菌属是柄锈菌属(Puccinia)占比82.2%,到安曲7 d时,对照组的Puccinia骤减为6.4%,而物种多样性却呈增加趋势。实验组Puccinia虽然数量有所减少(降至29.22%),但依然保持着优势真菌属的地位。当时间推进到安曲14 d,2组实验真菌群落种类逐渐趋于一致但数量有细微的差别。而40 d的实验组中Aspergillus(28.5%)、罗萨氏菌属(Rasamsonia)(20.4%)和篮状菌属(Talaromyces)(19.1%)这3者成为主要的优势菌属。这一最终发酵结果,进一步支持了张清玫等[27]的观点,即Aspergillus或为高温大曲的标志性微生物类群,且是重要优势真菌属。综上所述,高温大曲发酵过程中真菌群落的演替是复杂且有序的,各优势菌属在特定阶段发挥着重要作用,可能共同驱动了发酵进程,例如,Puccinia在发酵初期占据优势,但随着发酵的进行,其比例逐渐下降,而Aspergillus、Rasamsonia和Talaromyces等耐高温菌属逐渐成为主导。这些菌属不仅在发酵过程中表现出高度的适应性,也被认为可能为酿造酱香型白酒提供了关键的微生物基础。
为了深入剖析不同时间点的高温大曲样本中主要物种间的组成差异,对微生物群落在种水平(前50种)上的丰度分布趋势进行了可视化处理。在此基础上运用层次聚类分析方法,按照Average链接准则,对行及列分别基于Euclidean距离进行了聚类[29],结果如图5所示。50个优势物种(细菌42个、真菌8个)可基于一定相似度聚为四大簇,在安曲0 d时,微生物群落均分布在簇Ⅱ,说明补量水对群落扰动极小,尚未启动演替,其中奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)为优势细菌种,仅有条形柄锈菌(Puccinia striiformis)一个优势真菌种;首次翻曲7 d时,实验组微生物群落主要分布在簇Ⅰ,其中融合魏斯氏菌(Weissella confusa)是主要优势菌种;而对照组分布在簇Ⅲ、Ⅳ,主要优势菌属为Caldibacillus,包含Caldibacillus sp.、木芥子形热芽胞杆菌(Caldibacillus kokeshiiformis)、嗜热乳酸热芽胞杆菌(Caldibacillus thermolactis),这与主坐标分析一致,表明补量水可能通过改变了微环境水分,进而与微生物群落结构的重塑相关,最终导致组间群落组成产生分化。如陈可丹等[30]研究发现大曲发酵初期,Weissella代谢可产生大量乳酸和乙酸,使发酵体系pH值快速下降,从而抑制杂菌(如肠杆菌属Enterobacter)的生长。大曲发酵14～40 d,2组优势微生物逐渐趋于一致,实验组细菌以直杆糖多孢菌(Saccharopolyspora rectivirgula),Caldibacillus属(Caldibacillus sp.、Caldibacillus kokeshiiformis、Caldibacillus thermolactis)为主,优势真菌已从安曲0 d的1个增加到7个,以埃默森篮状菌(Rasamsonia emersonii)、谢瓦氏曲霉(Aspergillus chevalieri)、冠突曲霉(Aspergillus cristatusTalaromyces)、宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)等,这些兼具难降解底物降解、高温酶生产及风味合成潜能的微生物[15, 31],在发酵后期成为优势菌群,可能主导了大曲的成熟过程。这一动态变化揭示了微生物群落在发酵过程中的演替特性,且不同物种在不同阶段发挥着关键作用。
图5 不同高温大曲种水平优势微生物组成热图
Fig.5 Heatmap of dominant microbiota at species level in different high-temperature Daqu
2.4 高温大曲微生物群落主要菌属相关性分析
大曲微生物群落的动态演替变化是众多种群共同作用、相互影响的复杂结果。为了更深入地探索这一发酵规律,本节研究了相对丰度排名前20的优势属之间的内部相关性,并将显著性相关的判定标准设定为P<0.05(图6)。值得关注的是,Proteus与克雷伯氏菌属(Klebsiella)呈现显著正相关,相关性系数高达0.998,表明两者可能存在代谢共生或协同定植关系,推测其可能通过共享相似生态位或代谢途径促进彼此生长繁殖。此外,Weissella与粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)等乳酸菌表现出显著正相关性(相关系数0.974),作为发酵核心功能菌群,两者相互作用较单一菌种更复杂紧密,这种关联可能与它们共同参与乳酸代谢、降低pH值以及抑制杂菌生长等功能有关,进而在发酵体系中形成了一个协同作用的微生物网络。同时,Talaromyces与Rasamsonia、Aspergillus呈较高正相关(相关系数分别为0.917和0.899),张年磊等[32]研究显示:黄色篮状菌(Talaromyces flavus)在环境修复中可能与其他真菌发挥协同作用;而Aspergillus在具备降解木质素的能力;尽管这类真菌在土壤等环境中可能竞争相似碳源,但在发酵体系中,这种正相关提示它们可能通过协同作用更高效利用复杂碳源,可能有利于推动发酵进程。另外,Caldibacillus、高温放线菌属(Thermoactinomyces)等属之间也存在一定程度的相关性(0.892),这些菌属普遍具有耐高温、高盐或耐碱的生态适应性[33],表明它们在发酵过程中可能通过相似的生态适应机制,共同应对高温等极端环境条件,但其关联性弱于Weissella等群体的紧密互作。而Klebsiella、Rasamsonia与其他菌属均呈不同程度负相关(相关系数为-0.008～-0.58),可能是代谢产物互相作用或资源竞争所导致的。例如,某些微生物可能通过分泌抑制性代谢产物来限制其他微生物的生长。
图6 高温大曲属水平优势物种相关性系数图
Fig.6 Correlation coefficient heatmap of dominant species at the genus level in high-temperature Daqu
注:***P<0.001。
2.5 补量水对高温大曲微生物群落主要功能的影响
前述多样性分析表明,补量水与微生物群落结构与演替的改变有关。为进一步揭示这些结构变化所蕴含的功能意义,本研究基于样本的物种和功能相对丰度,进行物种丰度与功能丰度之间的关联分析,该分析旨在确定特定物种的功能贡献度以及特定功能的物种贡献度。功能分析主要划分为五类:代谢、遗传信息处理、环境信息处理、有机体系统和细胞过程。图7展示了不同功能的物种贡献度分布。
图7 物种与功能相对贡献度图(属水平)
Fig.7 Relative contribution plot of species and functions (genus level)
具体而言,在安曲0 d时,各组样本的物种组成基本一致,其中Proteus在代谢功能中的贡献度略高于其他菌属。发酵至7 d时,实验组的优势菌属为Weissella,而对照组则以Caldibacillus为主。这种差异可能与Weissella对湿润环境的偏好有关,补量水操作更有利其生长。
在代谢方面,Weissella在代谢中的贡献度变化可能是由于补量水激活了Weissella的碳水化合物代谢、风味前体合成等通路,强化了群落整体代谢效率[34];在遗传信息处理方面,预测结果显示实验组中Rasamsonia等微生物的DNA复制、转录、翻译相关基因表达水平先升后降,表明微生物在适应环境变化时调整了遗传信息处理的资源分配[35];环境信息处理方面,40 d时Kroppenstedtia贡献占比较低,该现象体现了补量水后环境选择下该菌对干燥环境的依赖使其在补水后逐渐退出“环境信息处理”的功能核心菌群;在有机体系统类别中,大曲微生物群落Talaromyces等可能会通过自我调节机制,限制有机体系统相关功能的过度活跃,使各物种的生长和发育保持在一个相对稳定的水平[36];最后细胞过程方面,Aspergillus、Talaromyces等丝状真菌可能参与细胞生长、分裂调控及稳态维持等过程,并在调控自身的“营养生长-产孢分化”发挥重要作用[37]。其中,发酵结束时实验组的Aspergillus、Rasamsonia、Talaromyces对5组功能均展现出了最大的贡献,其影响力尤为显著[38]。值得注意的是,这些在功能上占据主导地位的菌属(如Aspergillus、Rasamsonia),同样也是前期分析中在实验组显著富集的优势类群。这一结果将群落组成与功能特征相关联,表明物种结构的差异可能与功能潜力的分化有关;同时也在功能层面上支持了β多样性所提示的组间分化。上述菌属在发酵后期不仅表现出较高的物种相对丰度,也显示出重要的功能贡献,可能通过协同作用共同参与大曲成熟阶段的多种生物学过程,包括代谢、遗传信息处理、环境适应及细胞过程等。
3 结论
本研究通过宏基因组学技术分析了补量水对高温大曲发酵中微生物群落演替及功能的影响。结果显示,安曲后补量水与高温大曲初期升温更显著、酸度更高,还原糖生成优势相关,更利于曲块保水;可能通过提升微环境水分含量,进而与微生物群落的演替路径、结构及预测功能的改变相关:发酵后期(40 d)实验组真菌丰度(79.59%)明显高于对照组(54.92%),并富集了如Saccharopolyspora、Caldibacillus及Aspergillus等具有耐高温特性及潜在底物降解与风味合成功能的核心菌群,对照组则以Kroppenstedtia为主,主坐标分析和Venn图结果表明,微生物群落结构在初期高度重合,中期呈现分化波动,后期则出现明显分组趋势;补量水与真菌丰富度提升(Chao1指数升高)相关,但可能加剧细菌资源竞争;优势菌属间可形成协同与竞争的互作网络,这可能有助于维系群落稳定。功能预测分析表明,补量水与发酵初期Weissella代谢潜能的增强有关,末期Aspergillus等3个真菌属在五类预测功能中的贡献较为突出。
综上,本研究初步表明“补量水”工艺可能通过调控水分影响高温大曲微生物群落结构及功能潜力,为理解传统工艺的微生物学机制提供了初步见解与理论依据。需指出,本研究结果基于宏基因组学分析,受限于生物学重复不足,主要目的在于提出机制假设并为后续研究提供方向。未来将进一步结合多生物学重复、多组学方法及水分-温度梯度实验,深入解析菌群与风味物质形成的关系,为工艺优化与产业应用提供更全面的科学依据。
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