随着我国猪肉产业的快速发展,多元化的猪肉产品正不断涌现[1]。同时,消费者对健康饮食日益关注,使得高品质、绿色健康的特色猪肉产品备受青睐[2]。作为传统发酵肉制品,腊肉深受消费者喜爱。其中,渝东北地区腊肉以其独特风味和口感成为川渝腊肉的典型代表性之一[3-4]。目前,国内腊肉研究多聚焦于不同加工工艺、添加剂对产品理化性质及风味的影响[5-6],而针对不同加工方式下腊肉微生物多样性及其与风味形成相关的基因差异研究则相对较少[7],微生物在腊肉风味形成的作用和机制值得深入探究。
宏基因组学技术能够高效、准确地挖掘微生物菌群信息,并借助直系同源蛋白分组比对(evolutionary genealogy of genes:non-supervised orthologous groups,eggNOG)、KEGG以及碳水化合物活性酶数据库(carbohydrate-active enzymes,CAZy)等工具,有效注释微生物的代谢功能[8-9]。目前,该技术已广泛应用于各类发酵食品研究。如熊力等[10]揭示了湘西腊肉的微生物类群,提出鞘氨醇单胞菌可能与湘西腊肉独特风味有关;李昕诺等[11]发现了大肠杆菌(Escherichia coli)K-12 MG1655、大肠杆菌K-12 W3110等基因与酸笋的乳酸生成密切相关;牛茵等[12]则对不同发酵阶段羊肉香肠中参与挥发性风味物质合成的编码酶和微生物进行了注释与分析。此外,国外学者对意大利香肠的研究表明,代谢相关酶编码基因丰度与挥发性风味物质含量的变化趋势一致[13-14]。
目前,已有研究报道了腊肉中微生物多样性与挥发性风味物质的关联性[15],然而,针对不同加工方式下微生物多样性研究仍显不足,对相关功能基因差异探究也较为有限。为此,本研究以渝东北地区工厂生产和农家制作的成品腊肉为对象,采用宏基因组技术,并结合eggNOG、KEGG和CAZy数据库,解析腊肉微生物多样性并注释其基因功能,比较农家和工厂腊肉之间的多样性及功能基因差异。本研究旨在探究不同加工方式对渝东北地区腊肉微生物多样性及其与风味物质形成的相关功能基因的影响,为解析渝东北地区腊肉特征风味形成的微生物学机制提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 腊肉样品
15个腊肉样品采自奉节、城口和巫溪3个渝东北区县的农家和工厂,农家样品8个(GC组),工厂样品7个(NC组)。用无菌手术刀从每块腊肉上、中、下部位各取5 g表面组织,置于50 mL无菌离心管中混合均匀(每个样品设3个重复)。样品置于冰袋泡沫箱内低温运回,保存于-80 ℃冰箱,7 d内完成宏基因组测序。农家腊肉制作工艺:农户于冬季(冬腊月)屠宰自养粮食猪,将肉、肋骨及猪腿等分割成块,表面均匀涂抹盐、花椒、白酒等佐料,腌制约7 d。随后悬挂于室内,使用青冈木、柏木等低油脂木材进行文火慢烘,烟熏温度一般在22 ℃以下,每日熏制3～4 h,持续约25 d,成品悬挂于房梁贮存。工厂腊肉生产工艺:工艺流程与农家腊肉相似,主要差异在于盐含量略高,采用集中热熏,熏制温度通常控制在55～60 ℃,持续约2 d,成品存于4 ℃冷库冷藏,样品信息见表1。
表1 腊肉样品信息表
Table 1 Information of cured meat samples
组别来源样号盐含量烟熏方式烟熏时长/d保存条件保存时长/月NC农家FQB15%～7%低温冷熏25室内悬挂3农家FQB25%～7%低温冷熏25室内悬挂3农家WTS15%～7%低温冷熏25室内悬挂3农家WTS25%～7%低温冷熏25室内悬挂3农家FLJ25%～7%低温冷熏25室内悬挂3农家FLJ35%～7%低温冷熏25室内悬挂3农家FLJ15%～7%低温冷熏25室内悬挂3农家CFY15%～7%低温冷熏25室内悬挂3GC工厂CGG13%～5%集中热熏2冷库冷藏3工厂CJG13%～5%集中热熏2冷库冷藏3工厂CPG13%～5%集中热熏2冷库冷藏3工厂FBG13%～5%集中热熏2冷库冷藏3工厂FZG13%～5%集中热熏2冷库冷藏3工厂WTG13%～5%集中热熏2冷库冷藏3工厂WTG23%～5%集中热熏2冷库冷藏3
1.1.2 主要试剂
E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit,美国OMEGA公司;QubitTM dsDNA HS Assay Kit,美国Thermo公司;Hieff NGS MaxUp Ⅱ DNA Library Prep Kit for Illumina、Hieff NGS DNA Selection Beads,翌圣生物科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
台式高速低温离心机、Q33226 Thermo Qubit 4.0荧光定量仪,美国Thermo公司;FR-980A生物电泳图像分析系统,复日科技;DYY-11电泳仪,北京六一仪器厂;S220 Covaris超声破碎仪,美国Covaris公司;T100TM Thermal Cycler PCR仪,美国BIO-RAD公司。
1.3 实验方法
1.3.1 腊肉DNA提取和片段化
按E.Z.N.ATM DNA试剂盒说明提取腊肉样品的微生物基因组DNA,用QubitTM dsDNA HS Assay Kit定量检测DNA浓度,取约500 ng DNA,构建插入片段长度约为500 bp的测序文库。随后,将DNA用Elution Buffer稀释至130 μL,转移至0.5 mL Covaris DNA破碎管中进行超声片段化。片段化的DNA经1×Hieff NGS DNA Selection Beads 浓缩纯化,并测定其浓度。
1.3.2 文库构建、质控及混样
对DNA片段进行末端修复并连接测序接头,连接产物经磁珠分选纯化后进行文库扩增,扩增产物再次纯化。用2 g琼脂糖溶于100 mL电泳缓冲液中,制备2%琼脂糖凝胶电泳检测文库片段大小分布,并采用Qubit 4.0荧光定量仪测定文库浓度。随后,将所有样本文库基于浓度按1∶>1比例进行等量混合。
1.3.3 生物学信息学分析
使用华大基因DNBSEQ-T7测序平台对混合文库进行双末端测序(PE150)。原始测序数据经Fastp进行质量控制,去除低质量序列、接头及宿主基因组,获得过滤后序列片段。用MEGAHIT对过滤后序列片段进行多样本混合拼接。使用Bowtie 2将过滤后序列片段回贴至MEGAHIT拼接产生的contigs上,获取未比对上的片段。使用SPAdes对上述片段进行混合拼接。合并MEGAHIT和SPAdes两次拼接产生的contigs,过滤掉长度小于500 bp的序列。对筛选后的contigs进行统计,用于后续分析。使用Prodigal对筛选后的contigs进行开放阅读框(open reading frame,ORF)预测,识别潜在基因。仅保留预测基因长度≥100 bp的序列,并将其翻译为对应的氨基酸序列。使用CD-HIT(聚类阈值为95%相似度和90%覆盖度)对预测的基因序列(核苷酸或氨基酸)进行聚类,构建非冗余基因集。使用Bowtie 2将过滤后序列片段回贴至非冗余基因集,计算每个基因的表达丰度。将非冗余基因集分别比对至NR(NCBI non-redundant protein)、eggNOG、KEGG和CAZy数据库,获取基因的物种分类及功能注释信息。基于基因丰度信息,进一步计算获得物种丰度谱和功能丰度谱(如KEGG通路丰度、CAZy酶家族丰度等)。生物信息学分析由上海生工生物科技有限公司完成。
1.4 数据统计分析
用R语言4.0对NR、eggNOG、KEGG、CAZy数据库注释的物种和功能丰度进行统计分析和作图,用GraphPad Prism 8.0.2软件对差异基因簇进行分析和作图,用SPSS Statistics 22软件对酶基因丰度进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 渝东北地区腊肉微生物多样性
15个样品经质控过滤后,有效微生物基因序列占原始测序数据的95%～98%,符合微生物组分析要求(表2),通过计算ACE(Abundance-based Coverage Estimator)、Chao1、Simpson和Shannon指数评估了农家与工厂组腊肉的微生物Alpha多样性。结果显示,农家腊肉微生物Chao1和ACE指数均显著高于工厂腊肉(P<0.05,图1-A和图1-B),表明农家腊肉微生物群落丰度更高;而两类腊肉微生物的Simpson和Shannon指数无显著差异(P>0.05,图1-C和图1-D),表明农家和工厂腊肉微生物群落多样性相似。
A-ACE指数;B- Chao1指数;C-Shannon指数;D-Simpson指数
图1 腊肉微生物Alpha多样性分析结果
Fig.1 Alpha diversity of microbiota in cured meat
注:*代表P<0.05;ns表无显著性差异(下同)。
表2 腊肉微生物基因组测序数据质量评估指标
Table 2 The quality assessment metrics for microbial genome sequencing data of cured meat
组别样号原始序列片段原始碱基总数过滤后序列片段过滤后碱基数占原始总碱基数的百分比/%NCFQB168 374 57210 256 185 80066 596 0260.973 988 195FQB272 201 72610 830 258 90069 971 5400.969 111 736WTS152 089 8547 813 478 10050 932 7440.977 786 269WTS244 632 6546 694 898 10043 842 9260.982 306 049FLJ263 258 7869 488 817 90061 700 1600.975 361 114FLJ371 549 58210 732 437 30069 825 1540.975 898 839FLJ162 475 7929 371 368 80061 193 9440.979 482 485CFY172 336 16010 850 424 00070 923 6720.980 473 279GCCGG153 105 7987 965 869 70050 751 9240.955 675 763CJG155 965 6868 394 852 90054 769 4080.978 624 795CPG162 160 0409 324 006 00060 654 2380.975 775 402FBG153 579 1728 036 875 80051 808 8820.966 959 362FZG161 848 7149 277 307 10060 354 2060.975 836 07WTG169 593 87210 439 080 80068 002 8100.977 137 901WTG253 682 0668 052 309 90052 423 2240.976 550 046
2.2 渝东北地区腊肉微生物群落结构
从渝东北地区腊肉微生物基因组中共鉴定到微生物25门、57纲、125目、242科、436属和1 458种,其中细菌占90.42%,真核生物占9.18%,病毒占0.33%,古细菌占0.07%。农家和工厂腊肉样品微生物在门、属和种水平上物种丰度排前10的优势菌群组成相同,但丰度占比例不同,详见图2。
A-门;B-属;C-种;D-属样本间PCoA
图2 腊肉微生物菌群相对丰度
Fig.2 Relative abundance of microbial communities in cured meat
门水平上,渝东北地区腊肉排前十的优势菌门分别是假单胞菌门(Pseudomonadota)、芽孢杆菌门(Bacillota)、子囊菌门 (Ascomycota)、拟杆菌门(Bacteroidota)、酶录转逆病毒门(Artverviricota)、放线菌门(Actinomyoetota)、尾噬菌体门(Uroviricota)、担子菌门(Basidiomyoota)、广古菌门(Euryarchaeota)、梭杆菌门(Fusobacteriota),其中前4个门的占比超过98%(图2-A)。子囊菌门在农家腊肉中平均相对丰度显著更高(工厂0.43%,农家16.7%,P<0.01)。结果表明,工厂与农家腊肉在门水平上的优势微生物种类相同,但丰度存在差异。
属水平上,渝东北地区腊肉排前10的优势菌属分别是梭菌属(Clostridioides)、埃希氏菌属(Escherichia)、不动杆菌(Acinetobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、曲霉属(Aspergillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、乳杆菌属(Latilactobacillus)、交替杆菌属(Alteribacter)和普罗威登斯菌属(Providencia),优势菌属在工厂和农家腊肉中群落丰度存在差异(图2-B)。6个工厂和4个农家样品的第一优势菌属为梭菌属,平均相对丰度分别为21.02%和17.21%;工厂样品FBG1的第一优势菌属为乳杆菌属,占42.93%;农家样品FQB1和FLJ2的第一优势菌属为葡萄球菌属,分别占17.02%和47.51%;农家样品FQB2和WTS1第一优势菌属为曲霉属,分别占33.73%和26.05%。葡萄球菌属在两类腊肉中的丰度较高,分别为5.06%和12.2%(P>0.05);曲霉属在两类腊肉中的平均相对丰度差异极显著(工厂0.15%,农家15.58%;P<0.01)。属水平聚类分析显示,8个农家样品聚为一类,6个工厂样品聚为另一类,而工厂样品FBG1则单独成类(图2-D和图3),后续分析中排除FBG1样品。
图3 属水平上样本间距离热图
Fig.3 Heatmap of inter-sample distances at the genus level
种水平上,渝东北地区腊肉排前10的优势细菌分别是艰难梭状芽胞杆菌(Clostridioides difficile)、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)、克雷白氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、嗜钠交替杆菌(Alteribacter natronophilus)、未分类葡萄球菌种(unclassified Staphylococcus species)、科普里普雷沃菌(Prevotella copri)、金黄色葡萄球菌(Saphylococcus aureus),详见图2-C。优势菌丰度最高的3种细菌依次为艰难梭状芽胞杆菌(18.99%)、大肠杆菌(14.20%)和鲍曼不动杆菌(9.14%),其他优势菌在农家与工厂腊肉中的丰度有较大差异:灰绿曲霉在农家腊肉占8.28%(第4),但在工厂腊肉仅占0.08%(P<0.01);未分类葡萄球菌种在农家和工厂腊肉中的占比分别为4.82%和1.21%;弯曲乳杆菌在两类腊肉中的丰度差异显著(农家0.001%、工厂4.4%;P<0.01)。结果表明,农家腊肉样品间优势菌种的相对丰度波动较大,而在工厂腊肉样品中则相对稳定。
2.3 渝东北地区腊肉微生物基因的功能注释
2.3.1 eggNOG功能注释及组间差异
基于eggNOG数据库,从渝东北腊肉微生物基因组中共注释到23个主要功能大类,14 926个eggNOG功能单元(图4-A)。分析显示,腊肉微生物除在维持自身生长繁殖的基础功能(如复制、能量产生、翻译和离子运输)上具有较高基因数外,氨基酸转运与代谢功能类的基因数在农家和工厂腊肉间无显著差异(图4-B),而基因数最多且与代谢密切相关的2个功能类别为碳水化合物转运与代谢(图4-C)和脂质转运与代谢(图4-D),且农家腊肉显著高于工厂腊肉(P<0.05或0.01)。
A-eggNOG功能分类;B-氨基酸转运与代谢基因;C-碳水化合物转运与代谢基因;D-脂质转运与代谢基因
图4 腊肉微生物基因eggNOG功能注释及组间差异
Fig.4 Functional annotation of microbial genes using eggNOG and intergroup differences in cured meat.
注:**代表P<0.01。
2.3.2 KEGG功能注释及组间差异
对渝东北地区腊肉微生物基因进行KEGG一级功能注释,共注释到6个一级主要功能类别(代谢、人类疾病、生物体系统、遗传信息处理、环境信息处理和细胞过程),46条二级代谢途径通路(图5)。在一级功能类别中,代谢功能在工厂和农家腊肉中均占据绝对优势,表明腊肉微生物的代谢活动普遍活跃,有利微生物参与腊肉风味的形成。对腊肉微生物12种代谢途径基因进一步分析发现,与风味形成相关且注释丰度最高的前2个通路为:碳水化合物代谢7.57%、氨基酸代谢5.11%,且农家腊肉的基因数均显著高于工厂腊肉(P<0.05)。
图5 腊肉微生物基因KEGG功能注释
Fig.5 Functional annotation of microbial genes using KEGG in cured meat
此外,农家腊肉的微生物在以下代谢通路相关基因数也显著高于工厂腊肉,包括其他次生代谢产物的生物合成、脂质代谢、外源性物质的生物降解和代谢(图5)。
2.3.3 CAZy库注释到的碳水化合物活性酶
eggNOG与KEGG注释结果共同表明,渝东北腊肉微生物的碳水化合物代谢水平较高。经CAZy数据库进一步注释,在腊肉微生物基因组中共注释到102种碳水化合物活性酶(CAZymes):包括12种糖苷水解酶(glycoside hydrolase,GHs)、20种糖基转移酶(glycosyl transferase,GTs)、13种碳水化合物酯酶(carbohydrate esterase,CEs)、55种辅助氧化还原酶(auxiliary oxidoreductase,AAs)、2种多糖裂解酶(polysaceharide lyase,PLs),详见图6。结果显示,微生物的碳水化合物代谢活跃,氧化还原酶占据主导(53.9%),表明微生物参与腊肉的碳水化合物转化和富集,从而影响渝东北地区腊肉特征性风味。
图6 腊肉微生物基因注释到的碳水化合物活性酶
Fig.6 Carbohydrate-active enzymes annotated from microbial genes in cured meat
2.4 渝东北地区腊肉微生物的氨基酸和碳水化合物代谢基因差异
多肽、游离氨基酸及碳水化合物是腌腊肉制品风味的重要前体物,参与腊肉风味物质的形成[16],因此本文进一步分析了腊肉微生物的氨基酸和碳水化合物代谢基因差异。
2.4.1 氨基酸代谢基因差异
从农家和工厂腊肉样品的微生物基因组中均注释到14条氨基酸代谢途径。其中,较为活跃的代谢途径包括甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸等甜味氨基酸代谢(ko00260),丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等鲜味氨基酸代谢(ko00250),半胱氨酸和蛋氨酸代谢(ko00270)。基于共有氨基酸代谢基因簇相对丰度进行的正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)显示,两类样品间存在差异(图7-A)。根据变量权重值(VIP值>1)共筛选出46个氨基酸代谢基因。在VIP值排前20的基因簇中,有18个在农家腊肉中的VIP值高于工厂腊肉(图7-B)。
A-氨基酸代谢基因簇得分图;B-氨基酸代谢基因簇VIP图;C-氨基酸代谢差异基因簇柱状图
图7 腊肉微生物氨基酸代谢基因差异
Fig.7 Differences in amino acid metabolic Genes of microbes in cured meat
根据VIP值>1且P<0.05进行筛选,共筛选出24个显著差异基因簇。其中,19个基因簇在农家腊肉微生物中的相对丰度显著高于工厂腊肉(图7-C)。工厂腊肉微生物中相对丰度显著高于农家腊肉的基因簇编码以下酶:胞嘧啶/肌酐脱氨酶(K01485)、吡咯啉-5-羧酸还原酶(K00286)、L-天冬酰胺酶(K01424)、天冬酰胺合成酶(谷氨酰胺水解)(K01953),这些酶主要参与脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等氨基酸的代谢过程。农家腊肉微生物中相对丰度显著高于工厂腊肉的主要差异基因簇编码以下酶:1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶(K00294)、精氨酸酶(K01476)、鸟氨酸-氧酸转氨酶(K00819)、鸟氨酸脱羧酶(K01581)、谷氨酸N-乙酰转移酶/氨基酸N-乙酰转移酶(K00620)、鸟氨酸氨基甲酰转移酶(K00611)、色氨酸合成酶(K01694)和延胡索酰乙酰乙酸水解酶(K01555)等。结果表明,渝东北地区农家和工厂腊肉中微生物群落的氨基酸代谢基因簇相对丰度存在显著差异,微生物的氨基酸代谢活性在农家腊肉中更高。
2.4.2 碳水化合物代谢基因差异
在农家和工厂腊肉样品的微生物基因组中均注释到15条碳水化合物代谢途径。其中,较为活跃的碳水化合物代谢途径包括:丙酮酸代谢(ko00620)、糖酵解/葡萄糖生成(ko00010)、氨基糖和核苷酸糖代谢(ko00520)。基于共有的碳水化合物代谢基因簇相对丰度进行的OPLS-DA显示,2组样品间存在差异(图8-A)。根据VIP值>1筛选出53个基因簇,在VIP值排名前20的基因簇中,2组各有10个基因簇具有较高的相对丰度(图8-B)。进一步根据VIP值>1且P<0.05共筛选出34个差异基因簇,其中23个基因簇在农家腊肉微生物中的相对丰度显著高于工厂腊肉(图8-C)。
A-碳水化合物代谢基因簇得分图;B-碳水化合物代谢基因簇VIP图;C-碳水化合物代谢差异基因簇柱状图
图8 腊肉微生物碳水化合物代谢基因差异
Fig.8 Differences in carbohydrate metabolism genes of microbes in cured meat
工厂腊肉微生物中相对丰度较高的差异基因簇编码的酶分别是葡萄糖-6-磷酸异构酶(K01810)、甲酸C-乙酰转移酶(K00656)、内消旋-丁二醇脱氢酶/(S,S)-丁二醇脱氢酶/双乙酰还原酶(K03366)、乙酰乳酸脱羧酶(K01575),这些酶主要参与氨基糖和核苷酸、丙酮酸、丁酸和C5支链二元酸的代谢。在农家腊肉微生物中相对丰度较高的差异基因簇编码的酶分别是2-羟基戊二酸-丙酮酸转氢酶(K21618)、乳酸2-单加氧酶(K00467)、乙酰辅酶A水解酶(K01067)、甲基异柠檬酸裂解酶(K03417)等,这些酶主要参与氨基糖和核苷酸、丙酮酸和丙酸等物质的代谢。
结果表明,渝东北地区农家和工厂腊肉微生物群落的碳水化合代谢基因簇丰度存在显著差异。整体而言,功能基因丰度分析显示农家腊肉微生物中涉及的碳水化合物代谢基因簇相对丰度更高。
3 讨论
传统腌腊肉制品在我国历史悠久、分布广、种类多、风味各异,由于原料和辅料的差异以及生产工艺不同造成腊肉风味各具特色[16]。即使在同一地区,由于加工方式等不同也形成了不同品质和风味的腊肉产品。其原因是影响腌腊肉品质的因素多,其中微生物菌群组成是其重要因素之一。微生物会影响腊肉的理化特性、风味、货架期,以及食用安全[17]。因此,对渝东北农家制作和工厂生产的腊肉进行微生物多样性和功能基因差异分析,对揭示渝东北地区腊肉风味差异的微生物学形成机制具有重要意义。
本研究结果显示,渝东北地区农家和工厂腊肉微生物群落多样性相同,但农家腊肉微生物群落丰度更高。在门、属和种水平上,两类腊肉样品微生物物种丰度排前10的优势菌群组成相同,但丰度存在差异。渝东北地区腊肉以芽孢杆菌门、假单胞菌门和拟杆菌门为主要优势菌门,农家腊肉中的子囊菌门丰度显著更高(工厂0.43%,农家16.7%,P<0.01);渝东北地区腊肉中的梭菌属、埃希氏菌属、不动杆菌属和葡萄球菌属为主要优势菌属,且丰度都较高,曲霉属在农家腊肉中的丰度显著高于工厂腊肉;艰难梭状芽胞杆菌、大肠杆菌和鲍曼不动杆菌是渝东北地区腊肉丰度最高的3种细菌,前10的其他优势菌种在农家腊肉样品间相对丰度波动较大,而在工厂腊肉样品中则相对稳定。其中,灰绿曲霉在农家腊肉中的丰度显著高于工厂腊肉(P<0.01),而弯曲乳杆菌在工厂腊肉中显著高于农家腊肉(P<0.01)。与其他地区腊肉多样性有相似性,芽孢杆菌门和假单胞菌门亦是四川传统腊肉[18]、闽北风吹肉[19]、湖北恩施腊肉[20]的优势菌门,而子囊菌门是镇巴腊肉的优势菌门[21];在属水平上川渝烟熏腊肉和湖南产烟熏腊优势菌属为葡萄球菌属,甘肃陇西产非烟熏腊肉优势菌属为嗜冷杆菌属、葡萄球菌属、不动杆菌属,浙江咸肉主要为不动杆菌属[17]。地域环境、原材料、加工方式不同,腌腊肉制品中微生物群落结构会存在多样化[17]。农家和工厂腊肉样品在门、属和种水平上微生物物种丰度排前10的优势菌群组成相同,但丰度存在差异。这种变化可与农家和工厂腊肉制作工艺与贮存环境等因素有关,工厂腊肉加工工艺集中、统一和规范,而农家腊肉制作和更具有随意性和个性化,这些因素会影响腊肉微生物生长,从而影响腊肉风味形成[4]。
传统腌腊肉制品中微生物组成复杂多样,已被证实其独特风味与微生物的形成密不可分[22]。在加工和贮藏过程中,微生物大量存在并表现出多样性特征,微生物可以加速蛋白质和脂肪降解产生风味化合物[23]。研究显示,接种了城口腊肉优势菌种的腊肉制品能够较好地重现城口老腊肉的风味[3]。本文基于eggNOG、KEGG和CAZy数据库,从渝东北地区腊肉微生物基因组中共释到23个主要功能大类、14 926个eggNOG功能单元、6个一级主要功能类别、46条二级代谢途径通路(包括14条氨基酸代谢途径和15条碳水化合物代谢途径)、102种碳水化合物活性酶。除在维持自身生长繁殖的基础功能上具有较高基因数外,代谢功能类基因数在工厂和农家腊肉中均占据绝对优势,其中氨基酸、碳水化合物和脂质转运与代谢功能类的基因数较高,且多数VIP值>1且P<0.05的氨基酸(19/24)和碳水化合物(23/36)代谢基因簇丰度在农家腊肉中显著高于工厂腊肉,这与前面的微生物群落丰度高低一致。结果表明渝东北地区腊肉微生物的氨基酸、碳水化合物和脂质代谢活动普遍活跃,有利微生物参与腊肉风味的形成。微生物参与肉类碳水化合物、蛋白质和脂质的分解可能导致挥发性有机化合物(volatile organic compounds,VOCs)的形成,极大地影响最终产品的感官特性[13,24]。已有研究表明,葡萄球菌、乳杆菌等细菌在镇巴腊肉的挥发性化合物的形成中起着重要的作用[15]。葡萄球菌等是渝东北腊肉的优势菌,灰绿曲霉在农家腊肉丰度很高,弯曲乳杆菌在工厂腊肉中丰度很高[25],灰绿曲霉能够促进蛋白质、碳水化合物转化为易于人体吸收的小分子物质[13,24],葡萄球菌属是腊肉风味形成的重要微生物来源,可通过调控谷氨酸、赖氨酸和丙氨酸的含量影响腊肉的风味[26]。
4 结论
基于宏基因组学技术从渝东北地区腊肉样品中共鉴定出微生物25门、57纲、125目、242科、436属和1 458种。农家和工厂腊肉的微生物群落多样性指数相似,但农家腊肉的微生物群落丰度显著更高。在门、属、种水平上,物种丰度排前10的优势菌群组成在两类腊肉中相同,但其相对丰度存在差异,在农家腊肉中优势菌种的丰度波动较大,而在工厂腊肉中则相对稳定。具体而言,子囊菌门、曲霉属及假灰绿曲霉在农家腊肉中的丰度显著高于工厂腊肉;相反,弯曲乳杆菌在工厂腊肉中的丰度显著更高。基于eggNOG、KEGG和CAZy数据库的功能注释及代谢基因丰度差异分析表明,氨基酸、碳水化合物和脂质转运与代谢功能类的基因数较高,且多数VIP值>1且P<0.05的氨基酸和碳水化合物代谢基因簇丰度在农家腊肉中显著高于工厂腊肉。本研究结果可为解析渝东北地区腊肉特征风味形成的微生物学机制提供重要依据,同时为该地区特色腊肉生产工艺的优化及功能发酵菌株的筛选提供了理论参考。
[1] 蔡心怡. 中国生猪产业、猪肉市场现状和发展问题分析——以江苏省为例[J].现代食品, 2024, 30(9):46-49.CAI X Y.Analysis of the current situation and development issues of hog industry and pork market in China:Taking Jiangsu province as an example[J].Modern Food, 2024, 30(9):46-49.
[2] 尚永彪, 吴金凤, 夏杨毅, 等.农家腊肉冷熏加工过程中挥发性风味物质的变化[J].食品科学, 2009, 30(17):79-83.SHANG Y B, WU J F, XIA Y Y, et al.Changes of volatile flavor compounds in traditional Chinese bacon during cold smoking[J].Food Science, 2009, 30(17):79-83.
[3] 高雅晴, 郭雨馨, 李星, 等.城口老腊肉风味形成的关键微生物研究[J].食品与发酵工业, 2025, 51(16):190-196.GAO Y Q, GUO Y X, LI X, et al.Study on functional microorgnisms impacting unique flavour development of Chengkou bacon[J].Food and Fermentation Industries, 2025, 51(16):190-196.
[4] 张继开, 沈丽华, 胡小易, 等.渝东北地区农家和工厂腊肉挥发性风味物质及代谢物质差异分析[J].食品与发酵工业, 2025, 51(14):298-305.ZHANG J K, SHEN L H, HU X Y, et al.Difference analysis of volatile flavor substances and metabolites between farm and factory cured meat in northeast Chongqing[J].Food and Fermentation Industries, 2025, 51(14):298-305.
[5] 李军年, 贝爽, 娄爱华, 等.绿色液熏腊肉与传统腊肉风味品质的差异分析[J].食品工业, 2024, 45(4):139-146.LI J N, BEI S, LOU A H, et al.Difference analysis of the flavor and quality between green liquid-smoked pork and traditional cured pork[J].The Food Industry, 2024, 45(4):139-146.
[6] 付浩华, 周兵, 夏启禹, 等.食盐添加量对腊肉风味及贮藏过程中理化性质的影响[J].肉类研究, 2023, 37(9):39-45.FU H H, ZHOU B, XIA Q Y, et al.Effect of salt addition on flavor and physicochemical properties of Chinese bacon during storage[J].Meat Research, 2023, 37(9):39-45.
[7] 张鹏, 赵金山, 臧金红, 等.发酵肉制品中的特征风味与微生物之间的关系研究进展[J].食品工业科技, 2024, 45(2):380-391.ZHANG P, ZHAO J S, ZANG J H, et al.Progress of research on the relationship between characteristic flavor and microorganisms in fermented meat products[J].Science and Technology of Food Industry, 2024, 45(2):380-391.
[8] YI L B, SU G R, HU G, et al.Diversity study of microbial community in bacon using metagenomic analysis[J].Journal of Food Safety, 2017, 37(3):e12334.
[9] 麻颖垚, 胡萍, 孙利林, 等.宏基因组学分析酱香型白酒窖内发酵优势菌与代谢功能的相关性[J].现代食品科技, 2020, 36(6):128-136.MA Y Y, HU P, SUN L L, et al.Metagenomics analyze the relationship between the dominant bacteria and fungi and metabolism function in the pit fermentation of Maotai-flavor liquor[J].Modern Food Science and Technology, 2020, 36(6):128-136.
[10] 熊力, 易浪波, 粟桂蓉, 等.基于宏基因组学分析湘西腊肉的细菌多样性[J].中国微生态学杂志, 2022, 34(1):23-28.XIONG L, YI L B, SU G R, et al.Diversity of bacteria in western Hu’nan bacon based on metagenomic analysis[J].Chinese Journal of Microecology, 2022, 34(1):23-28.
[11] 李昕诺, 吴宇辉, 吴良如, 等.基于宏基因组学揭示自然发酵与植物乳杆菌接种发酵酸笋中微生物代谢及关键风味基因[J].食品与发酵工业, 2025, 51(7):167-176.LI X N, WU Y H, WU L R, et al.Revealing mierobial metaboli and key flavor genes in natural fermented and Lactbacillus plantarum inoculated fermented Suansun based on macrogenomics[J].Food and Fermentation Industries, 2025, 51(7):167 -176.
[12] 牛茵, 吴双慧, 何济坤, 等.基于宏基因组技术分析自然发酵羊肉香肠中微生物多样性及挥发性风味功能基因[J].食品科学, 2024, 45(2):139-148.NIU Y, WU S H, HE J K, et al.Metagenomic analysis of microbial diversity and functional genes responsible for volatile flavor of naturally fermented mutton sausage[J].Food Science, 2024, 45(2):139-148.
[13] FERROCINO I, BELLIO A, GIORDANO M, et al.Shotgun metagenomics and volatilome profile of the microbiota of fermented sausages[J].Applied and Environmental Microbiology, 2018, 84(3):e02120-e02117.
[14] FRANCIOSA I, FERROCINO I, GIORDANO M, et al.Specific metagenomic asset drives the spontaneous fermentation of Italian sausages[J].Food Research International, 2021, 144:110379.
[15] NING B, ZUO Y, WANG L, et al.The potential correlation between the succession of microflora and volatile flavor compounds during the production of Zhenba bacon[J].Food Chemistry:X, 2024, 22:101478.
[16] 唐静, 张迎阳, 吴海舟, 等.传统腌腊肉制品挥发性风味物质的研究进展[J].食品科学, 2014, 35(15):283-288.TANG J, ZHANG Y Y, WU H Z, et al.Recent progress on volatile flavor compounds of traditional Chinese cured meat products[J].Food Science, 2014, 35(15):283-288.
[17] 赵睿, 邵长春, 高世功, 等.高通量测序分析不同腌腊肉制品细菌多样性[J].食品科学, 2020, 41(20):90-96.ZHAO R, SHAO C C, GAO S G, et al.High-throughput sequencing analysis of bacterial diversity of different types of traditional Chinese bacon[J].Food Science, 2020, 41(20):90-96.
[18] 文开勇, 汪月, 文鹏程, 等.四川传统腊肉中微生物群落结构研究[J].食品与发酵工业, 2020, 46(3):36-42.WEN K Y, WANG Y, WEN P C, et al.Study on microbial community structure in Sichuan traditional bacon[J].Food and Fermentation Industries, 2020, 46(3):36-42
[19] 范俐, 秦鑫宇, 周聪麟, 等.闽北风吹肉制成中微生物组成及多样性变化[J].农产品加工, 2023(21):85-88.FAN L, QIN X Y, ZHOU C L, et al.Microbial composition and diversity in wind meat in northern Fujian[J].Farm Products Processing, 2023(21):85-88.
[20] 董蕴, 王玉荣, 王尧, 等.基于变性梯度凝胶电泳和MiSeq高通量测序技术分析恩施地区腊肉的细菌多样性[J].肉类研究, 2018, 32(10):37-42.DONG Y, WANG Y R, WANG Y,et al. Evaluation of bacterial diversity in Chinese bacon from Enshi by denatured gradient gel electrophoresis and MiSeq high-throughput sequencing[J].Meat Research, 2018, 32(10):37-42.
[21] 左瑶. 镇巴腊肉腌熏过程中微生物多样性变化及乳酸菌的分离鉴定[D].西安:陕西理工大学, 2023.ZUO Y.Changes in microbial diversity and isolation of lactic acid bacteria during salting and fumigating of Zhenba bacon[D].Xi’an:Shaanxi University of Technology, 2023.
[22] 李彦虎, 贠建民, 牛耀星, 等.传统腌腊肉制品中微生物多样性及其功能研究进展[J].包装与食品机械,2020, 38(2):52-58.LI Y H, YUN J M, NIU Y X, et al.Research progress of microbial diversity and functions in traditional cured meat product[J].Packaging and Food Machinery, 2020, 38(2):52-58.
[23] WANG Z L, WANG Z X, JI L L, et al.A review:Microbial diversity and function of fermented meat products in China[J].Frontiers in Microbiology, 2021, 12:645435.
[24] TAKENAKA S, NAKABAYASHI R, OGAWA C, et al.Characterization of surface Aspergillus community involved in traditional fermentation and ripening of katsuobushi[J].International Journal of Food Microbiology, 2020, 327:108654.
[25] 邹颖玲, 刘姝韵, 王桂瑛, 等.基于PCR-DGGE技术分析宣威火腿中真菌群落结构[J].食品与发酵工业, 2020, 46(6):269-274.ZOU Y L, LIU S Y, WANG G Y, et al.Analysis of fungal community structure in Xuanwei ham by PCR-DGGE[J].Food and Fermentation Industries, 2020, 46(6):269-274.
[26] YANG L, LI H J, WU H, et al.Quality relationship between smoked and air-dried bacon of Sichuan-Chongqing in China:Free amino acids, volatile compounds, and microbial diversity[J].Food Research International, 2023, 164:112274.