浓香型白酒不同窖龄及位置窖泥微生物多样性与理化因子的比较分析

浓香型白酒作为中国白酒十二香型之一,其独特风味的形成与窖池中的窖泥微生态系统密切相关[1]。窖泥作为白酒发酵的“土壤”,蕴含着丰富的微生物群落,这些微生物在长期的酿造过程中通过代谢活动产生各类风味物质[2],直接影响着白酒的品质与风格[3]。作为窖泥微环境的关键影响因素,窖龄和不同空间位置会通过改变理化条件(如pH等)塑造独特的微生物群落结构,进而对酿酒过程产生深远影响[4]。四川作为浓香型白酒的发源地,全国近半数的高品质浓香型白酒均产自此区域[5],而泸州作为其中的主要产区,拥有悠久的酿酒历史和独特的窖池生态系统,其“千年老窖万年糟”的酿造理念也凸显了窖龄对白酒品质的重要性。

近年来,随着微生物组学相关技术的不断发展,高通量测序等方法[6-7]为解析窖泥微生物多样性提供了有力工具,研究者们逐渐认识到窖泥微生物群落结构与功能的复杂性。已有研究结果显示[8],不同窖龄和空间位置的窖泥在理化性质、微生物群落及代谢物组成上存在显著时空差异,乳酸、pH和铵态氮是驱动群落演替的关键因子。泸州老窖与江南大学的联合研究则指出,窖池底部和黄水线下位置的窖泥微生物群落以确定性组装为主,老窖泥的代谢表型更趋近于优质窖泥标准[3]。任海伟等[9]以甘肃某酒厂10年和50年窖龄窖泥为研究对象,得出不同窖龄和空间位置对真菌群落组成及其多样性具有一定的影响,有助于理解窖龄和空间位置对窖泥微生物群落的影响。因此,明确不同窖龄和位置下窖泥微生物群落的组成特征、优势菌群及差异物种,揭示理化因子对微生物群落的调控机制,具有重要意义。

迄今,对浓香型白酒的窖池窖泥的研究已有许多,但针对泸州地区浓香型白酒多维度变量耦合分析窖龄与窖池空间位置双变量,揭示交互作用对窖泥微生物群落的影响的研究还较为缺乏。此前研究关注的或仅关注某一方面或窖龄较少或窖龄不同。基于此,本研究以泸州某浓香型白酒酒业窖池不同窖龄(20、30、40、50年)和位置(上、中、底层)的窖泥为研究对象,通过测定其理化指标(铵态氮、有效磷等),结合高通量测序技术分析微生物多样性,系统分析不同窖龄及位置窖泥的微生物群落结构与理化因子的相似性与差异性,并探讨二者的关联性,旨在深化对泸州地区浓香型白酒窖泥微生态系统的认知,为窖池养护、窖泥质量评价及白酒品质提升提供科学依据,助力传统酿酒工艺的科学化升级。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

窖泥(PM)样品取自泸州某酒厂不同窖龄(20、30、40、50年)的发酵窖池,每个窖龄随机取3口窖池作平行。每口窖池分上层、中层、底层进行无菌采样,如图1所示,上层窖泥取自距窖口20 cm处的四面池壁中心点,混合后按窖龄标依次记为LS20_1～3、LS30_1～3、LS40_1～3、LS50_1～3,中层样取自4个池壁面的中心点,混合后按窖龄标记为LZ20_1～3、LZ30_1～3、LZ40_1～3、LZ50_1～3,底层样取自窖池底的4个角和中心点,分别标记为LD20_1～、LD30_1～3、LD40_1～3、LD50_1～3。样品均分为2份(分别用于理化指标与微生物多样性测定),经无菌密封后放置于-80 ℃贮存备用。

氯化铵、碘化钾、碘化汞(分析纯),西陇科学股份有限公司;酒石酸钠钾、氢氧化钠、钼酸铵(均为分析纯),天津市大陆化学试剂厂;氟化铵、磷酸二氢钾、氯化亚锡(均为分析纯),上海麦克林生化科技公司;盐酸(分析纯),成都市科隆化学品有限公司;土壤DNA提取试剂盒(DNeasy® PowerSoil® Pro Kit),美国QIAGEN公司。

1.2 仪器与设备

AR224CN电子分析天平、MB120快速水分测定仪,奥豪斯公司;UV-5100B紫外可见分光光度计,上海元析仪器有限公司;800 TS酶标仪,Biotek公司;Illumina MiSeq高通量测序平台,美国Illumina公司;NanoDrop 2000 DNA浓度测定仪,美国Thermo Scientific公司;MG-1650台式高速离心机,美瑞克仪器(上海)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 窖泥理化指标的测定

水分含量的测定:使用快速水分测定仪;铵态氮、有效磷的测定:参照沈怡方[10]的方法;pH值的测定:参考辜杨等[11]的方法。

1.3.2 DNA提取和PCR扩增

根据DNeasy® PowerSoil® Pro Kit DNA提取试剂盒的操作步骤提取窖泥样品中的总DNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳对基因组DNA的质量进行检测,并使用NanoDrop2000测定提取DNA的浓度与纯度,符合测序要求后于-80 ℃保存。将合格DNA样本交由上海美吉生物,采用Illumina MiSeq平台进行高通量测序。

细菌和古菌采用通用引物515F_(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R_(5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′),扩增微生物16S rRNA基因的V4可变区。真菌采用通用引物ITS1F_(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R_(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′),扩增ITS1区。

扩增程序:预变性95 ℃ 3 min,变形95 ℃ 30 s,退火55 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,后延伸72 ℃ 10 min,35个循环(真核生物27个循环),10 ℃保存。

1.4 数据处理

窖泥理化指标等利用Excel 2019进行数据处理及分析;微生物数据分析基于上海美吉生信云平台(https://cloud.majorbio.com/)进行。

2 结果与分析

2.1 测序及稀释曲线分析

本研究基于Illumina高通量测序方法对窖泥中的微生物群落进行分析,质控优化后得到原核微生物有效序列1 974 341条和真核微生物有效序列1 857 046条。以各样本在不同测序深度下的Shannon指数为依据绘制稀释曲线(图2),随着测序深度逐步提升,曲线逐渐趋近于水平状态。表明当前的测序量已达到充分水平,测序数据具有合理性与可靠性,能够满足后续对微生物群落结构及其相关性进行分析的需求。

2.2 窖泥微生物群落结构α多样性分析

α多样性反映单个样品的群落多样性特征,根据100%相似性水平下的ASV信息,采用α多样性指标的Sobs、Chao1、Shannon、Simpson指数、覆盖率对样品微生物物种的丰富度、均匀度和多样性进行评估(表1、表2)。α多样性数据显示,不同窖龄和位置的窖泥样品覆盖率均超99.95%,说明测序数据可覆盖样品中原核和真核菌群种类,真实反映物种丰富度及多样性。

如表1所示,30与40年窖龄的窖泥,其上层、中层、底层不同位置的原核微生物ASV(advance super view)数不存在显著差异;而20年窖龄窖泥中层的原核微生物ASV数,与上层和底层的存在显著差异,50年窖龄窖泥各层位置的ASV数均有显著差异。30和40年窖龄各层窖泥原核微生物的Shannon指数与Simpson指数无显著差异,20和50年窖龄窖泥中层与底层的这2项指数则存在显著差异。整体而言,随着窖龄增长,原核微生物的ASV数与有效序列数呈上升态势;同一年份不同位置的原核微生物多样性(Chao1、Sobs、Shannon指数),随位置下移呈现先增后减的趋势,其中中层的Simpson指数较低,表明这一位置的窖泥中,原核微生物不仅数量最为庞大,其分布状态也更为均衡。在相同窖龄条件下,中层窖泥的微生物多样性要高于上层与底层;而对于同一位置的窖泥,其微生物多样性整体呈现出随窖龄增长而降低的趋势,这与邓杰等[12]的研究结果基本一致。这一现象可能是因为,随着时间的推移,窖泥在长期的驯化过程中,微生物会发生动态变化和群落更替:那些无法适应酿酒环境的微生物会慢慢被淘汰,还有一部分微生物则逐步适应了窖泥的微环境并发展成为优势群体,最终形成了较为稳定的窖泥微生物生态系统[13],也就是说,微环境中逐渐积累了更多对酿酒有益的原核微生物。

由表2可知,在20、40和50年窖龄窖泥的上、中、底层不同位置,其真核微生物ASV数均无显著差异;而30年窖龄底层窖泥的真核微生物ASV与上层和中层存在显著性差异。4个不同窖龄各层位置窖泥真核微生物的Sobs、Chao1、Shannon、Simpson指数,均无显著差异。从整体情况来看,对于相同窖龄的窖泥,上层与中层的真菌在多样性和丰富度上,都要高于底层窖泥,这说明窖壁处窖泥中真菌的种类更为丰富,与王春艳等[14]的研究结果一致。浓香型白酒窖池中,窖底因长期被黄水浸泡且处于密封状态,氧气含量显著低于窖壁,形成典型的厌氧环境,这种差异直接影响微生物群落的分布,窖底更利于厌氧微生物(如己酸菌、丁酸菌)的代谢活动[15]。对比不同窖龄的窖泥,低年份窖泥的真菌多样性更高,说明老窖池的理化环境不利于真菌生存,这与孟雅静等[16]的研究结果相吻合。

2.3 泸州产区窖泥样品中窖泥微生物的物种组成分析

依据获得的ASV物种分类信息,对样品的群落结构展开分析。经测序发现,泸州产区某酒厂的所有窖泥样品中,共检测出29个门、63个纲、132个目、229个科、409个属的原核微生物;10个门、36个纲、81个目、198个科、407个属的真核微生物。

高通量测序结果如图3显示,所有窖泥样本中的原核微生物,包含古菌和细菌,共涉及29个门,其中古菌有4个门、细菌有25个门。如图3所示,优势菌门有4个(相对丰度≥1%),在所有样品中的占比从高到低依次为:厚壁菌门(Firmicutes)(75.94%)、广古菌门(Euryarchaeota)(10.40%)、拟杆菌门(Bacteroidota)(6.79%)、盐杆菌门(Halobacterota)(5.02%)。其中,Firmicutes在各样品中均占据绝对优势,这与CHEN等[17]的研究结果基本相符,其在所有样本中的相对丰度为60%～89%。从图3能够看出,同一位置窖泥中Firmicutes的相对丰度随着窖龄增长总体呈上升态势;就同一年份不同位置的窖泥样品而言,位置下移时,20年和50年窖龄的Firmicutes含量变化趋势一致,均为先升后降,而30年和40年窖龄的含量则呈缓慢下降趋势。Firmicutes菌群在窖泥产香生酸过程中发挥着关键作用,其丰度水平也常被作为评估窖泥质量的重要指标[18]。而Euryarchaeota的变化趋势与Firmicutes相反:同一年份不同位置的窖泥样品中,位置下移时,20年和50年窖龄的Euryarchaeota含量变化趋势一致,均为先降后升,而30年和40年窖龄的含量则逐渐增加。Euryarchaeota是窖泥中古菌的绝对优势门,其核心功能是通过产甲烷菌将乙酸、氢气和二氧化碳转化为甲烷[19]。Bacteroidota和Halobacterota的含量无明显变化规律,其中Bacteroidota的相对含量在LS20样品中最高,达16.4%;Halobacterota的相对含量在LD40样品中最高,达12.7%。

如图4所示,所有窖泥样品的真核微生物共检测到10个门,其中优势菌门有3个(相对丰度≥1%),其相对丰度依次为:子囊菌门(Ascomycota)(78%)、担子菌门(Basidiomycota)(19%)、未分类真菌(unclassified_k_Fungi)(1.2%)。由图4可知,Ascomycota在每个样品中均占绝对优势,这与王春艳等[14]关于新老窖泥中真菌绝对优势菌门的研究结果一致,Ascomycota与细菌形成复杂的互作网络,共同塑造窖泥微生态环境[20]。同一位置的窖泥中,随着窖龄增加,Ascomycota的含量呈先升后降趋势;同一年份不同位置的该菌门含量则无明显变化规律。随着窖龄增加,Basidiomycota在窖泥上层和中层的含量先降后升,而在底层则先升后降;unclassified_k_Fungi在样品中的含量无明显变化规律。其中,被孢霉门(Mortierellomycota)在不同窖龄窖泥中的含量差异较大,在20年、30年窖龄的窖泥中含量较高,其中在LS20样品中最高,达4.5%;而在40年、50年窖龄的窖泥中含量较低,在LS40和LZ40样品中均未检测到。王春艳等[14]的研究也发现,该菌门存在于新窖泥中,而在老窖龄窖泥中消失未检出,推测其可能可作为判断窖泥窖龄的一个指标,这有待进一步研究。此外,仅在LZ40和LD40样品中检测到球囊菌门(Glomeromycota),其含量分别为0.02%和1.17%。Glomeromycota在窖泥中较少被检测到,但在大曲微生物中已有相关报道[21],此次在样品中检测到该菌门,表明在窖池环境中,可能存在窖泥与曲药等的微生物相互交错现象。

以ASV在属分类水平的物种分类信息为基础,分析样本属水平的群落结构,共确定原核微生物409个属,其中相对丰度≥1%的优势菌属有19个。其相对丰度如图5所示,在所有样品中,相对丰度排名前10的原核微生物菌属依次为:乳酸杆菌属(Lactobacillus)(14.69%)、氢孢菌属(Hydrogenispora)(14.25%)、己酸菌属(Caproiciproducens)(12.32%)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)(9.48%)、梭菌属-12(Clostridium_sensu_stricto_12)(7.29%)、热嗜益生菌属(Caldicoprobacter)(3.36%)、甲烷囊菌属(Methanoculleus)(3.23%)、沉积物杆菌属(Sedimentibacter)(2.80%)、互营单胞菌属(Syntrophomonas)(2.29%)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)(2.20%)

如图5所示,各年份中层窖泥中未知菌的相对丰度均较高,这说明不同位置里中层窖泥的原核微生物包含更多未知菌。从整体来看,所有样品中上层和中层位置的Lactobacillus相对丰度较高,在LZ50样品中高达40.76%,而在LD20样品中低至0.64%。已有研究指出,窖泥质量提升时,其中Lactobacillus的含量会随之下降[22],在本研究样品中,窖龄较长的中、上层窖泥中该菌属含量反而偏高,即20年窖龄窖泥中的含量低于50年窖龄中,推测这或许与窖泥长期使用过程中的变化有关,窖壁窖泥养护不到位,致使窖龄长的窖壁窖泥质量出现退化[23]。Hydrogenispora在同一年份的不同位置中,随着窖泥位置下移,其含量先降低后增加;对于同一位置,随着窖龄增加,其含量逐渐降低。样品中的Caproiciproducens含量随窖龄增加含量呈上升趋势,且在同一年份的中、底层窖泥中含量相对更高。Caproiciproducens产生的己酸等物质对Lactobacillus具有抑制效应,因此在该菌相对含量高的样品中,Lactobacillus相对含量通常较低[24]。Methanobacterium在底层含量较高,在LD20中含量最高,为18.27%。甲烷菌与己酸菌存在共生关系,这种关系有助于生成浓香型白酒主体香气成分己酸乙酯的前体物质——己酸[25]。Clostridium_sensu_stricto_12在中、上层位置的窖泥中含量较高,总体而言,随窖龄增加其含量上升,相关研究[26]也表明,在浓香型白酒窖泥的微生态系统中主要通过代谢活动参与风味物质前体生成及有机物转化,会随窖龄增长及窖泥品质提升而呈现增加趋势。Caldicoprobacter在窖龄较短的20年和30年窖泥中含量较高,在所有样品中,随窖泥位置下移,其含量先增加后降低,在LZ30样品中最高为6.84%。Sedimentibacter在所有样品中均有发现,且在20和30年窖龄中占比相对较高。相关研究显示,Sedimentibacter在窖泥中起到降解氨基酸、参与产酸和促进窖泥老熟等重要作用能与甲烷菌共生,在窖泥中常以优势菌存在[27]。此外,氨杆菌属(Aminobacterium)仅在40年、50年窖泥样品中存在,有研究显示,此类菌在窖龄长、质量高的窖泥中含量较多[28],在窖泥中呈现明显的垂直分布差异:在池底泥中丰度最高,而在池壁泥中丰度较低[29]。

对样本属水平的群落结构进行分析后,共鉴定出真核微生物407个属,其中相对丰度≥1%的优势菌属有16个,其相对丰度如图6所示。在所有样品中,相对丰度排名前10的真核微生物菌属依次为:嗜热真菌属(Thermomyces)(19.85%)、德巴利酵母属(Debaryomyces)(15.63%)、丝孢酵母属(Trichosporon)(8.53%)、沃尔氏酵母属(Wallemia)(8.40%)、未分类双足囊菌属(unclassified_f_Dipodascaceae)(7.00%)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)(6.51%)、未分类曲霉属(unclassified_f_Aspergillaceae)(5.88%)、曲霉属(Aspergillus)(5.34%)、青霉属(Penicillium)(3.87%)、枝孢属(Cladosporium)(2.27%)。上述含量较高的真菌主要由酵母菌和霉菌构成,研究表明,酵母类真菌是功能多样的关键微生物,通过糖代谢、风味物质合成、与其他微生物互作等方式,深刻影响发酵进程和白酒品质[21]。Thermomyces在30和40年窖龄的上层与中层窖泥中占据绝对优势;Trichosporon、Debaryomyces在50年长窖龄窖泥中含量较高;Wallemia在各年份样品的中层窖泥中含量均较高。不同年份样品的菌属构成存在显著差异,一些菌类仅在少数特定样品中出现。例如,卡扎克斯酵母属(Kazachstania)是20年、30年、40年窖龄窖泥中的共有优势菌属,而其他报道显示Kazachstania是糟醅中的优势菌属[30],并非窖泥的原生优势菌群,但其可通过窖泥与糟醅的物质交换进入窖泥;普赖斯酵母属(Priceomyces)是50年窖龄窖泥中特有的优势菌属,其在50年窖龄中的含量随窖泥位置下移先降低后增加;而被孢霉属(Mortierella)是LS20窖泥中的优势菌属,在50年窖龄的窖泥中未检测到。

2.4 泸州产区窖泥样品中的差异微生物

为进一步探究不同窖龄与位置的窖泥微生物存在的差异,研究采用线性判别分析效应大小(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)分析法对组间差异微生物进行分析,并绘制出线性判别式分析(linear discriminant analysis,LDA)柱状图。此图可直观呈现各组间具有显著差异的微生物,图中柱长代表差异物种的影响值大小。关于原核差异微生物的具体分析结果,详见图7。

从图7-a的物种层级树图及图7-b的LDA柱形图能够看出,所有样本中检测到的差异原核微生物共计38个种(LDA>4)。其中,纲、目、科水平分别检出4、11、10种差异微生物。属水平检出13种差异微生物,具体如下:LZ20的差异微生物为氧化杆菌属(Oxobacter)、Sedimentibacter;LD20的差异微生物为互营乙酸菌属(Syntrophaceticus);LS30的差异微生物为厌氧孢子杆菌属(Anaerosporobacter);LD30的差异微生物为甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter);LS40的差异微生物为Clostridium_sensu_stricto_12;LZ40的差异微生物为unclassified_f_Clostridiaceae、norank_f_norank_o_norank_c_Limnochordia;LD40的差异微生物为norank_f_norank_o_Limnochordales、norank_f_SRB2;LZ50的差异微生物为Lactobacillus;LD50的差异微生物为暗杆菌属(Pelotomaculum)、Caproiciproducens。

图8呈现了所有样本中真菌物种的LEfSe多级物种层级树(图8-a)与LDA判别柱形(图8-b)。从图8中可以看出,所有样本中检测到的差异真核微生物共11种(LDA>2),其中在纲、目、科水平上分别检出2、2、1种差异微生物。门水平检测出1差异生物,为Ascomycota。属水平共检测出5个差异微生物,具体如下:LS20的差异微生物为Trichosporon、Kazachstaniania;LZ30的差异微生物为阿彼奥霉属(Apiotrichum);LD50的差异微生物为未分类子囊菌属(unclassified_p_Ascomycota)、Priceomyces。不同窖龄的窖泥中,原核微生物与真核微生物存在差异,这会导致酿酒过程中产生的代谢物各有不同,而这种差异又会对窖泥的质量产生影响。进而导致所产白酒原酒的质量存在差异[31]。

2.5 理化指标

由表3可知,窖泥水分含量为35.90%～44.77%,各年份上、中、底层窖泥的含水量均无显著差异,同一年份不同位置的含水量也无明显变化规律;同一位置不同窖龄的窖泥,总体随窖龄增长含水量上升,50年窖龄中层位置水分含量达最大值44.77%。该产区窖泥pH值在3.92～5.24变动,仅LS20、LZ20、LD20之间存在显著差异,其他年份样品无显著差异;同一位置不同年份的pH值呈波动变化,无明显趋势,总体上同一位置窖泥随窖龄增加pH值降低。20年窖龄窖泥的pH值随位置下移先降后升。窖泥中铵态氮含量为14.81～29.89 mg/100 g,总体随窖龄增长逐渐降低,LD50时达最低值14.81 mg/100 g。20、30和40年窖龄的窖泥,同靠下位置窖泥的铵态氮含量总体高于上层,与张明珠等[32]的结果一致;50年窖龄窖泥的铵态氮含量则随位置下移逐渐降低。有效磷含量为26.87～362.44 mg/100 g,波动较大。总体规律为:同一年份不同位置的有效磷含量随位置下移而增加,且均有显著差异;同一位置不同年份的有效磷含量先降后升,LD50时达最高值362.44 mg/100 g。依据赵长青等[33]的窖泥理化评定标准,可知不同窖龄底层窖泥的有效磷含量达到高质量窖泥标准以上结果,从垂直维度观察,窖泥的深层与浅层存在显著差异。深层窖泥与铵态氮、有效磷含量及酸度的呈正相关[34]的结论基本一致。

2.6 泸州产区样品中窖泥微生物与理化指标的相关性分析

不同窖龄与空间位置的窖泥,其理化性质存在差异,这既可能是影响窖泥功能微生物的因素,也可能是微生物生长代谢所导致的结果[35]。基于这一情况,研究对窖泥理化因子及相对丰度排名前15的微生物进行了Spearman相关性热图分析。图9-a呈现的是原核微生物与理化因子的相关性分析结果。由图可知,Lactobacillus、Clostridium_sensu_stricto_12、Caldicoprobacter、Proteiniphilum与水分含量、pH值、铵态氮含量、有效磷含量这4项理化指标均呈负相关;Hydrogenispora、Methanoculleus、Sedimentibacter、Petrimonas与水分含量、有效磷含量呈负相关;Methanobacterium与4项理化指标均呈正相关;Hydrogenispora、Methanoculleus、Sedimentibacter、Petrimonas与pH值、铵态氮含量呈正相关。从图9-a能直观看到,pH值、铵态氮含量、有效磷含量与属水平前15个物种中的部分菌属存在显著相关性,刘梅等[36]的研究同样表明,pH值和铵态氮含量对窖泥微生物群落结构有着较大的影响。图9-b为真核微生物与理化因子的相关性分析结果。由图可知,Kazachstania、Apiotrichum、Thermoascus与pH值、铵态氮含量呈显著正相关;Thermomyces、Thermoascus与有效磷含量呈显著负相关;水分含量与这些微生物无显著相关性。

3 结论

本研究对泸州地区浓香型白酒20、30、40、50年窖龄的上、中、底层空间位置的窖泥的理化性质和微生物群落结构进行差异分析。联合运用高通量测序多种方法并结合数理分析法,探究了不同窖龄及层级的窖泥原核微生物、真核微生物的相似性与差异性,并探讨了与理化指标间的关系。得出以下结论:a)微生物多样性特征:α多样性分析显示,在同一窖龄的窖泥中,中层的微生物多样性要高于上层与底层;而对于同一位置的窖泥,其微生物多样性整体呈现出随窖龄增长而下降的态势。这与长期窖泥驯化导致优势菌群稳定有关。原核微生物中,随着窖龄增加,同一位置窖泥中的Firmicutes相对丰度整体呈上升趋势,其是产香生酸的关键菌群,可作为窖泥质量评价的重要指标;Euryarchaeota变化趋势则相反。真核微生物中,Ascomycota占绝对优势地位,且低年份窖泥中的真菌多样性更高。在属分类水平上,原核微生物检出13种差异微生物(如Lactobacillus、Caproiciproducens等),真核微生物检出5种差异微生物(如Trichosporon、Priceomyces等),这些差异微生物多为白酒酿造中的关键功能菌群。b)理化因子特征:窖泥水分含量随窖龄增长总体上升,pH值随窖龄增加总体降低,氨态氮含量随窖龄增长逐渐降低,有效磷含量同一年份随位置下移增加,且同一位置呈先降后升趋势。c)相关性分析表明,原核微生物中的Methanobacterium与4项理化指标(水分含量、pH值、铵态氮含量、有效磷含量)均呈正相关,Lactobacillus等与4项理化指标均呈负相关;真核微生物中的Kazachstania等与pH值、铵态氮含量呈显著正相关,Thermomyces等与有效磷含量呈显著负相关。窖龄、位置通过影响窖泥理化因子和微生物群落结构,导致不同窖泥代谢物存在差异,进而影响白酒原酒质量。底层窖泥有效磷含量多符合高质量窖泥标准,而窖龄长的中上层窖泥可能因养护不当出现质量退化。通过上述研究,有望深化对窖泥微生态系统的认知,推动泸州地区浓香型白酒酿造的科学化、精准化发展。

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