绞股蓝多酚提取工艺的响应面法与人工神经网络-粒子群优化算法优化及在纳米银绿色合成中的应用

武艺,刘鑫伟,彭媛媛,靳晨冰,顾慧越,王婉茹,董俊豪,费博闻,刘晓会, 赵琳静*

(上海工程技术大学 化学化工学院,上海,201620)

摘 要 该研究采用Box-Behnken响应面法(response surface methodology, RSM),结合人工神经网络(artificial neural network, ANN)模型与粒子群优化算法(particle swarm optimization, PSO),构建绞股蓝多酚提取工艺的智能优化体系;采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(ultra-high performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UPLC-QTOF-MS)对其多酚组成进行定性分析,并考察最优工艺提取的绞股蓝多酚作为天然来源还原剂在纳米银(silver nanoparticles, AgNPs)绿色合成中的应用潜力。结果显示,ANN-PSO模型为绞股蓝多酚提取工艺优化提供了可解释的智能建模方法:优化条件下总多酚含量达28.229 mg/g,相较于传统RSM,模型准确性与预测能力更优,与实际值的相对误差仅0.2%。鉴定出桑色素、鼠李素、栎草亭、鼠李秦素、芦丁等 10种多酚类化合物,均属于黄酮(苷)类结构。绞股蓝多酚可高效还原硝酸银,制备得到的AgNPs有显著抑菌作用,且在最小杀菌浓度下无细胞毒性。该研究为植物多酚提取工艺的智能化优化及绞股蓝资源的高值化综合开发利用提供了新思路和实验依据。

关键词 绞股蓝多酚;Box-Behnken响应面;人工神经网络;粒子群优化算法;纳米银绿色合成

绞股蓝[Gynostemma pentaphyllum (Thumb.) Makino]是葫芦科、绞股蓝属草质攀缘植物,富含多种生物活性成分。绞股蓝中含有的多酚类化合物因其显著的抗氧化、抗炎及抗菌等特性,近年来受到了研究者们的广泛关注[1]。大量研究表明,绞股蓝多酚不仅能够清除体内自由基,预防氧化应激相关疾病,还在调节肠道微生态方面具有潜在功效[2-3]。然而,提取工艺的差异导致绞股蓝多酚的提取率和成分组成存在显著波动,极大地限制了其在各领域的开发应用。

响应面法(response surface methodology, RSM)是一种融合实验设计、数学建模与统计分析的多变量优化方法,能够以较少的实验次数,揭示各影响因素及其交互作用对响应值的影响规律,并确定多因素体系下的最优工艺条件。相较于单因素试验法,RSM可有效减少实验工作量,同时精准捕捉因素间的非线性交互效应,尤其适用于植物活性成分提取等复杂多变量体系的工艺优化。但是,在处理高度非线性或存在强交互作用的复杂体系时,RSM的模型拟合精度与预测能力极易受影响。人工神经网络(artificial neural network, ANN)模型具有强大的非线性映射能力和自学习能力,能够模拟复杂的生物体系;粒子群优化算法(particle swarm optimization, PSO)则可在解空间内高效搜索全局最优解。因此,将ANN与PSO相结合有助于构建更为精准、智能的绞股蓝多酚提取工艺优化体系。同时,利用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(ultra-high performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UPLC-QTOF-MS)技术,能够对多酚的组成成分进行全面、准确的定性分析,为深入了解绞股蓝功效成分及机制提供关键数据。

近年来,纳米银(silver nanoparticles, AgNPs)由于其独特的物理化学性质和抗菌性能,在生物医学、食品保鲜等领域展现出广阔的应用前景。传统的AgNPs合成方法多采用化学试剂,存在环境污染和生物毒性等问题。以植物提取物作为还原剂绿色合成AgNPs,不仅能够降低成本、减少污染,还能赋予AgNPs更好的生物活性[4-6]。探究绞股蓝多酚作为天然来源还原剂在AgNPs绿色生物合成中的应用潜力,对于拓展绞股蓝资源的综合利用途径、开发新型抗菌材料具有重要意义。

本研究旨在对比RSM与ANN-PSO方法在绞股蓝多酚提取工艺优化中的应用,并通过UPLC-QTOF-MS分析其组成成分;在此基础上,利用最优条件下提取的绞股蓝多酚绿色合成AgNPs,系统评价其结构、抗菌活性及细胞毒性,以期为绞股蓝资源的高值化开发和复杂工艺的智能化优化提供理论依据与实践参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

绞股蓝(叶),上海某中药公司,产地四川;Folin-Ciocalteau试剂为自制,磷钼钨酸-碳酸钠显色体系;硝酸银、无水乙醇(均为分析纯),国药集团化学试剂有限公司;没食子酸标准品,中国药品生物制品检定所;营养肉汤培养基、LB肉汤培养基,杭州百思生物技术有限公司;琼脂,北京索莱宝科技有限公司;CCK-8检测试剂盒,上海康朗生物科技有限公司;蒸馏水为自制。

大肠杆菌(ATCC 8739)和金黄色葡萄球菌(ATCC 43300),广东微生物菌种保藏中心;人成骨细胞,上海司鼎生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Acquity UPLC / Xevo G2-XS QTOF超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱,美国Waters公司;V5000紫外可见分光光度计,上海元析仪器有限公司;Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱仪,美国Thermo Fisher公司;SU8010扫描电子显微镜,日本Hitachi公司;DSX-18L手提式高压蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂;GNP-9050恒温培养箱,上海精宏实验设备有限公司;SPH-200B恒温培养摇床,上海世平实验设备有限公司;VD-850型超净台,苏州净化设备有限公司;Microfuge 20R高速冷冻离心机,德国Backman公司;RE-2000旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器公司;多功能酶标仪,美国Bio-Tek公司。

1.3 实验方法

1.3.1 绞股蓝多酚的提取

取精确称量的绞股蓝粉末,置于圆底烧瓶,加入一定体积乙醇溶液,涡旋,加热提取,离心,过滤,收集上清液,用于总多酚含量测定。

1.3.2 总多酚含量的测定

参考文献[7]方法,采用Folin-Ciocalteu试剂测定不同条件下绞股蓝提取液中的总多酚含量。取1 mL绞股蓝提取液,与5 mL自制Folin-Ciocalteu试剂(0.2 mol/L)和 4 mL Na2CO3溶液(75 g/L)混合,室温避光反应30 min,于765 nm测定吸光度。取没食子酸(gallic acid, GA)配制系列浓度溶液,采用相同方法处理,获得标准曲线。结果以每克干植物样品中的没食子酸当量数(gallic acid equivalent, GAE)表示,单位mg GAE/g。

1.3.3 Box-Behnken RSM试验设计[8]

选取对总多酚含量影响较大的因素(提取温度、乙醇体积分数、液料比、提取时间),采用Design-Expert 13软件进行4因素3水平Box-Behnken RSM优化设计。分别用X1X2X3X4表示4个因素,并以+1、0、-1分别代表变量的水平,总多酚含量(total polyphenol content, TPC)为响应值。试验因素与水平设计见表1。

表1 RSM试验因素与水平

Table 1 Factors and levels of the response surface test

水平因素X1(提取温度)/℃X2(乙醇体积分数)/%X3(液料比)(mL∶g)X4(提取时间)/min-12535106005565201201859530180

1.3.4 基于ANN-PSO模型的工艺优化

ANN是一种模拟生物神经系统结构与功能的人工智能模型,由大量相互连接的“神经元”(计算单元)构成多层网络结构(通常含输入层、隐藏层、输出层)[9]。其核心原理是通过“正向传播”计算输出值,再通过“反向传播”基于误差反馈调整神经元间的连接权重与阈值,逐步优化模型对输入与输出间非线性关系的拟合能力,最终实现对复杂体系的预测、分类或优化。

1.3.4.1 数据预处理

采用污染系数为0.03的孤立森林(isolation forest)算法检测并剔除异常样本,在保证异常值去除精度的同时,最大化保留有效数据。利用Min-Max缩放将输入特征(提取温度、乙醇体积分数、液料比、提取时间)及目标响应值均归一化至[0,1]区间,消除特征尺度差异对建模的干扰。按8∶>1∶>1比例将预处理后的数据划分为训练集、验证集与测试集,分别用于模型参数更新、超参数调优及泛化性能评估。

1.3.4.2 ANN模型构建与优化

ANN模型架构经网格搜索与交叉验证优化确定:输入层设4个输入节点,对应4个工艺参数;构建3层隐藏层,节点数依次为384、192、96,(基于经验和多次试验调整,以平衡模型复杂度与泛化能力);输出层含1个节点,对应通过试验所得到总多酚含量值Y(图1)。隐藏层采用ReLU激活函数引入非线性、缓解梯度消失问题,搭配批归一化(BatchNorm1 d)加速训练收敛,前两层隐藏层后插入丢弃率为0.1的Dropout层抑制过拟合;输出层通过Hardtanh函数将预测值限制在[0,1.2]区间,确保结果物理合理性。

图1 人工神经网络拓扑结构图

Fig.1 Topology of artificial neural network

模型训练采用AdamW优化器(初始学习率3×10-4,权重衰减5×10-5),结合ReduceLROnPlateau学习率调度策略(验证损失停滞150轮时学习率减半,最低1×10-6)及早停机制(验证损失300轮未下降则终止训练,避免模型过拟合),以自定义损失函数平衡拟合效果,通过均方误差(mean squared error, MSE)和决定系数(R2)量化评估模型性能,验证拟合准确性与泛化能力。其计算如公式(1)、公式(2)和公式(3)所示:

损失函数

(1)

均方误差

(2)

决定系数

(3)

1.3.4.3 PSO算法优化及可视化

以训练完成的ANN作为PSO适应度函数评估器,PSO配置为:400个粒子、900次迭代(认知系数c1=0.9),社会系数c2=0.4,惯性权重w=0.85)。设计适应度函数,以最大化Y为目标,同时惩罚超过历史最大值1.5倍的不切实际预测。通过损失曲线、拟合散点图、特征重要性热力图等可视化手段,全面分析模型性能与参数影响规律,实现工艺参数优化。其计算如公式(4)所示:

适应度函数

(4)

1.3.5 UPLC-QTOF-MS分析

1.3.5.1 色谱和质谱条件

对最优条件下提取的绞股蓝多酚的化学组成进行分析。色谱条件:ACQUITY BEH C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)。以0.1%(体积分数)甲酸水溶液(A)和0.1%(体积分数)甲酸乙腈溶液(B)为流动相。梯度洗脱条件:0~0.5 min,1%~2% B;0.5~1.5 min,2%~10% B,1.5~4.0 min,10%~20% B;4~7 min,20%~50% B;7~9 min,50%~85% B;9~11 min,85%~100% B;11~13 min,100% B;13~13.5 min,100%~1% B;13.5~15 min,1% B。流速0.4 mL/ min,柱温50 ℃,进样量1 μL。质谱条件:采用电喷雾离子源(electrospray ionization, ESI),分别使用正离子模式和负离子模式进行质谱检测。Lockmass以亮氨酸-脑啡肽标准溶液进行质量锁定。以高纯N2为辅助喷雾电离与脱溶剂气体。去溶剂化温度500 ℃,去溶剂化气体流速为1 000 L/h。扫描范围m/z 50~1 200。

1.3.5.2 物质鉴定方法

采用UNIFI软件提取色谱峰和碎片信息,通过检索外部数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)鉴定化学成分。结合裂解规律、生物合成途径、文献报道的同分异构体、保留时间差异等确定化合物结构。

1.3.6 绞股蓝多酚AgNPs的制备及性能评价

1.3.6.1 绞股蓝多酚AgNPs的制备及结构表征

取最优提取条件制备的绞股蓝多酚溶液(5 mg/mL)50 mL,加入新鲜配制的AgNO3溶液(0.005 mol/L)200 mL,60 ℃避光反应90 min,期间观察溶液颜色的变化。将溶液于4 ℃放置24 h后于10 000 r/min离心10 min。过滤,将沉淀水洗3次,过滤,冷冻干燥后备用。

采用紫外-可见分光光度计(ultraviolet-visible spectrophotometer, UV-Vis)、傅里叶变换红外吸收光谱仪(Fourier transform infrared spectrometer, FT-IR)、扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)和Zeta电位分析仪等对制备的绞股蓝多酚AgNPs进行结构表征。

1.3.6.2 绞股蓝多酚AgNPs的抗菌活性和细胞毒性

采用Kirby-Bauer药敏纸片法,分别测定绞股蓝多酚AgNPs对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性[10],并与绞股蓝多酚提取液和硝酸银溶液作对比。使用游标卡尺测量抑菌圈直径(inhibitory zone diameter, IZD),实验重复3次,取平均值。采用常量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC),无肉眼可见细菌生长的最低浓度即为MIC。采用菌落计数法测定最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC),菌落数≤5 CFU的最低待测物浓度即为MBC。

采用CCK8细胞计数试剂盒,检测绞股蓝多酚AgNPs和绞股蓝多酚提取液对细胞增殖活性的影响。在96孔板中加入细胞悬液100 μL/孔(1×104细胞),37 ℃、5% CO2条件下培养24 h,弃去原培养液,分别加入含有不同浓度绞股蓝多酚提取液和多酚AgNPs的培养基悬液共培养。加入CCK8溶液10 μL,37 ℃、5% CO2条件下共培养4 h,使用酶标仪测定450 nm下的光密度值(optical density, OD),结果为3次平行实验平均值。

1.4 数据统计与分析

实验数据采用SPSS 26.0进行处理,两组间差异性通过两独立样本t检验进行分析,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。使用Origin 8.0等软件作图。

2 结果与分析

2.1 RSM优化绞股蓝多酚提取工艺

2.1.1 RSM试验设计及结果

通过4因素3水平Box-Behnken RSM试验设计,确定绞股蓝多酚的最佳提取工艺,共29个试验点,包括5个中心点。通过Folin-Ciocalteu比色法,得到没食子酸标准曲线为Y=0.120 5-0.031X(R2=0.997 7)。各提取条件下制备的绞股蓝提取液中的总多酚含量如表2所示。

表2 Box-Behnken RSM实验结果

Table 2 Box-Behnken response surface experiment results

运行序号标准序号X1X2X3X4响应值TPC a)171-10-103.424201016.9214301-109.5564001-111.64265000011.082360-10111.287001111.46198-10109.36289000011.3613100-1-1012.491111-10016.1651200-1-111.16913-100-17.742141-10021.122915000011.121016100-121.9421170-10-110.742218010-16.80161901106.6915200-11012.362521000011.4182210-1024.882023101028.11324-11004.30425110011.161226100123.622727000011.0872800-1113.04129-1-1009.46

注:TPCa),总多酚含量(mg GAE/g)。

2.1.2 回归模型的建立及显著性检验

对表2试验数据进行多元回归拟合,得到总多酚含量(Y)与提取温度(X1)、乙醇体积分数(X2)、液料比(X3)和提取时间(X4)4个因子的回归模型为:

Y=11.21+7.53X1-2.66X2+0.425 0X3+0.198 3X4-1.20X1X2-0.682 5X1X3+0.815 0X1X4-0.682 5X2X3-0.085 0X2X4-0.515

该模型的方差分析结果见表3。模型P<0.000 1,表明回归模型极显著。模型的一次项X1X2极显著,X3X4不显著,说明在本实验条件范围内,提取温度和乙醇体积分数对绞股蓝多酚的提取影响大。极显著,显著,其余二次项不显著,进一步表明在实验所设定的条件范围内,提取温度和乙醇体积分数对绞股蓝多酚的提取具有显著影响。4个因素之间的交互作用影响不明显。如图2所示,随着乙醇体积分数升高,TPC先略有增加,当乙醇体积分数达到65%时,趋势发生逆转。温度从25 ℃升至85 ℃时,测得的TPC呈上升趋势。TPC 随温度和液料比的升高而增加。时间对TPC无显著影响。模型相关系数R2=0.909 2,失拟项P<0.05,说明此模型真实值与预测值之间拟合程度较弱,预测能力欠佳[11]

图2 各因素交互作用对总多酚含量的响应面图

Fig.2 Response surface plots of the effect of interaction of factors on total polyphenol content

表3 回归模型的方差分析结果

Table 3 Regression model and variance analysis results

来源平方和自由度均方F值P值显著性模型942.631467.3310.01<0.000 1∗∗∗X1681.161681.16101.31<0.000 1∗∗∗X285.07185.0712.650.003 2∗∗X32.1712.170.322 40.579 2X40.47210.4720.070 20.794 9X1X25.7615.760.856 70.370 3X1X31.8611.860.277 10.606 8X1X42.6612.660.395 20.539 7X2X31.8611.860.277 10.606 8X2X40.028 910.028 90.004 30.948 7X3X41.0611.060.157 80.697 2X1279.37179.3711.810.004∗∗X2242.49142.496.320.024 8∗X3211.99111.991.780.203 1X420.072 410.072 40.010 80.918 8

2.2 基于ANN-PSO的提取工艺优化

采用isolation forest(contamination=0.03)对原始29条数据进行异常值检测[12],识别并剔除1条异常数据,剩余28条构成有效样本集。通过MinMaxScaler完成输入特征X与目标指标Y的归一化,按8∶>1∶>1比例划分训练集(22条)、验证集(3条)、测试集(3条),为模型训练与评估提供数据支撑。

构建的ANN模型,配置采用AdamW优化器、ReduceLROnPlateau学习率调度策略,结合patience=300早停机制,经377轮迭代收敛,最佳验证损失低至0.000 109。神经网络训练/验证损失曲线见图3-A。初始阶段损失快速下降,说明模型快速学习数据规律;后续曲线趋于平稳且接近重合,表明模型拟合充分,训练损失与验证损失稳定在低值,体现模型泛化能力良好,未出现过拟合或欠拟合问题[13-14]

A-ANN训练/验证损失曲线;B-ANN模型拟合性能;C-输入特征重要性排序

图3 基于ANN-PSO模型的提取工艺优化

Fig.3 Extraction process optimization using artificial neural network and particle swarm optimization algorithm

模型全数据评估结果如图3-B所示。训练集(training set)R2=0.988,MSE=0.359,散点紧密贴合拟合线,几乎无明显偏差,表明模型能深度学习数据规律。验证集(validation set)因样本量少,散点有一定离散,R2=0.778,MSE=1.273,表现弱于训练集,属于小样本常见问题。测试集(test set)R2=0.522,MSE=10.952,散点离散度最大,主要是由于样本量少,且测试全新未知数据,模型泛化挑战更大,故导致误差上升。全数据集训练稳定且收敛优秀,R2=0.942,MSE=1.592,说明模型具备全局良好拟合能力。

引入平衡PSO算法,以训练后的ANN作为适应度函数,经400粒子迭代900次,搜索得最优工艺参数为:提取温度81.99 ℃、乙醇体积分数42.43%、液料比15.41∶>1(mL∶>g)、时间174.64 min,对应预测Y达28.276 mg/g,突破历史最大值。输入特征重要性分析(图3-C)表明,提取温度(42.8%)、乙醇体积分数(33.7%)对Y影响显著,液料比(13.1%)和提取时间(10.4%)影响相对较弱,明确了参数优化的方向。这一结果与响应面试验中提取温度和乙醇体积分数对绞股蓝多酚含量有显著影响结论一致。

经3次实验验证,总多酚含量均值为28.229,证实ANN-PSO模型可实现工艺参数的精准优化。该模型为绞股蓝多酚提取工艺研究提供了可解释的智能建模方法,比传统RSM准确性更高、预测能力更强,与实际值的相对误差仅为0.2%。

2.3 绞股蓝多酚化学组成的UPLC-QTOF-MS分析

通过二级质谱,对最优工艺条件下提取的绞股蓝多酚的化学成分进行分析,共鉴定出10种多酚类化合物,均属于黄酮(苷)类结构。如图4所示,所鉴定的化合物除了5(圣草酚-7-O-β-D-乙酯基葡萄糖醛酸苷)为二氢黄酮苷,其余化合物均属于黄酮醇(苷)。

图4 绞股蓝提取液中鉴定的多酚类化合物

Fig.4 The polyphenol compounds identified in extractive from G.pentaphyllum

注:1:桑色素;2:鼠李素;3:栎草亭;4:鼠李秦素;5:圣草酚-7-O-β-D-乙酯基葡萄糖醛酸苷;6:鼠李秦素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷;7:芦丁;8:山柰酚-3,7-双葡萄糖苷;9:柽柳黄素3-O-β-D葡萄糖7-O-α-L-鼠李糖苷;10:2′-O-乙酰基芦丁。

2.4 绞股蓝多酚在制备AgNPs中的应用

2.4.1 绞股蓝多酚AgNPs的绿色生物合成

将最优工艺下提取的绞股蓝多酚用于合成AgNPs。在制备绞股蓝多酚AgNPs过程中,反应液颜色有明显变化(图5-A)。分别对反应前(0 min)以及反应15、30、60、90 min的反应液进行紫外可见光谱分析,结果见图5-B。绞股蓝多酚AgNPs在400~500 nm显示出强吸收,未见绞股蓝多酚和AgNO3的吸收峰。反应15 min时,在450 nm处观察到AgNPs特有的吸收峰[15],表明绞股蓝多酚AgNPs的形成。反应30 min 和60 min时,该波长处宽峰的强度逐渐增大。反应90 min时,这一宽峰的波长红移至457 nm,峰强度相比反应60 min时增大不明显。反应过程中,反应瓶底部的不溶物随时间延长而增加,与紫外-可见光谱观察到的峰强度逐渐增强一致。反应90 min后,反应液颜色不再发生变化,停止反应。通过离心、过滤、水洗对合成的绞股蓝多酚AgNPs进行分离和纯化,并冷冻干燥。

A-溶液颜色的变化;B-反应过程中溶液的UV-Vis吸收光谱分析

图5 绞股蓝多酚AgNPs的绿色生物合成

Fig.5 Green biological synthesis of AgNPs of polyphenols extracted from G.pentaphyllum

2.4.2 绞股蓝多酚AgNPs的结构表征FT-IR光谱分析:如图6-A所示,在4 000~500 cm-1的波数范围内,可在1 077.531、1 256.396、1 443.458、1 630.037、3 346.855 cm-1处看到绞股蓝总皂苷AgNPs的特征吸收带。其中,3 346.855 cm-1处的强宽带主要为苯环上O—H伸缩振动,1 630.037 cm-1产生显著的峰来还原银离子,检测到的峰主要是存在于绞股蓝总多酚提取物中的黄酮类化合物。1 443.458、1 077.531 cm-1处的吸收峰可归属为C—O—C或C—O官能团的吸收峰。文献报道的其他植物提取物AgNPs研究中,3 200~3 500、1 600~1 650 cm-1处均出现特征吸收峰,说明酚羟基在AgNPs的合成中起到了重要作用[16-17]。在AgNPs合成中,还原过程主要为Ag+与多酚等生物活性物质中—OH和CO的结合,且多酚类物质的亲核芳香环也可通过其高螯合性能与Ag+结合。绞股蓝中含有的多酚类物质,特别是多种黄酮类物质,具有还原Ag+生成AgNPs的能力。

A-FT-IR光谱分析;B-粒径分布;C-对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性;D-细胞毒性作用

图6 绞股蓝多酚AgNPs结构及性能

Fig.6 The structure and properties of AgNPs of polyphenols extracted from G.pentaphyllum

粒径分布分析:制备的AgNPs的粒径从32.67~396.1 nm不等,主要集中于100~200 nm,平均粒径为139.09 nm,见图6-B。

Zeta电位分析:AgNPs表面的电荷性质决定了其与其他粒子或分子之间的相互作用[18]。Zeta电位绝对值越高,体系稳定性越好[19]。绞股蓝多酚合成的AgNPs的Zeta电位值为-23.7 mV,表明该AgNPs表面带负电荷,具有较好稳定性。

2.4.3 绞股蓝多酚AgNPs的抗菌活性及细胞毒性

由于AgNPs具有更小的粒径和更大的比表面积,更容易进入细菌细胞内,从而抑制细菌生长,甚至杀灭细菌。对绞股蓝多酚AgNPs的抗菌作用进行定性分析,并与绞股蓝多酚和AgNO3进行比较。结果表明,绞股蓝多酚AgNO3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抗菌作用,抑菌圈平均直径分别为11.93、10.30 mm(n=3),明显优于绞股蓝多酚和AgNO3,结果见图6-C。MIC和MBC分析结果表明,绞股蓝多酚AgNPs对大肠杆菌的抑菌活性更强,在0.062 5 mg/mL质量浓度下就能抑制大肠杆菌生长,在0.5 mg/mL质量浓度下可杀灭大肠杆菌。

实验浓度下绞股蓝多酚AgNPs不会造成细胞相对存活率降低,0.4 mg/mL和0.8 mg/mL质量浓度下反而增强了细胞的增殖能力,结果见图6-D。干预组细胞相对存活率与对照组无显著差异(P>0.05)。绞股蓝多酚AgNPs对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MBC均处于实验质量浓度(0.4~1.2 mg/mL)范围内,说明其在最小杀菌浓度未降低细胞存活率,无细胞毒性作用。研究表明,表面带负电荷的AgNPs,相较于表面带正电荷的AgNPs,与氨基、羧基等基团之间存在排斥力,因而限制了其与一些生物大分子的相互作用,细胞毒性更低[20]

3 结论

本研究通过对比RSM与ANN-PSO模型对优化绞股蓝多酚提取工艺的作用,发现ANN-PSO模型展现出更高的准确性和更强的预测能力,相较于传统的RSM优化方法,具有明显优势,为天然产物功效成分的提取工艺研究提供了新的思路。经过对2种模型的深入分析,最终确定热回流法提取绞股蓝多酚的最佳工艺条件为:提取温度81.99 ℃,乙醇体积分数42.43%,液料比15.41∶>1,提取时间174.64 min;在此条件下,多酚含量预测值为28.276,验证试验平均值为28.229,相对误差为0.2%。采用UPLC-QTOF/MS从绞股蓝提取液中共鉴定了桑色素、鼠李素、栎草亭、鼠李秦素、芦丁等10种多酚类成分,均属于黄酮(苷)类化合物。本研究进一步评价了绞股蓝多酚作为天然来源还原剂在纳米银(AgNPs)绿色合成中的应用潜力,并分析了其抗菌活性和细胞毒性。研究结果为绞股蓝的高值化、资源化开发利用提供了参考,也为天然植物多酚AgNPs材料在抑菌领域的应用提供了科学依据。

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Optimization of extraction process of Gynostemma pentaphyllum polyphenols by response surface methodology and artificial neural network-particle swarm optimization, and its application in green synthesis of silver nanoparticles

WU Yi, LIU Xinwei, PENG Yuanyuan, JIN Chenbing, GU Huiyue, WANG Wanru,DONG Junhao, FEI Bowen, LIU Xiaohui, ZHAO Linjing*

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Shanghai University of Engineering Science, Shanghai 201620, China)

ABSTRACT In this study, the Box-Behnken response surface methodology (RSM) was integrated with the artificial neural network (ANN) model and particle swarm optimization (PSO) algorithm to establish an intelligent optimization system for the polyphenols extraction process from Gynostemma pentaphyllum.Additionally, ultra-high performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTOF-MS) was employed for the qualitative analysis of its polyphenolic composition.The potential application of G.pentaphllum polyphenols extracted under the optimal process as a natural source of reducing agent in the green synthesis of silver nanoparticles (AgNPs) was further investigated.The results demonstrated that the ANN-PSO model provided an interpretable intelligent modeling approach for optimizing the extraction process of G.pentaphyllum polyphenols.Under the optimized conditions, the total polyphenol content reached 28.229 mg/g.Compared with traditional RSM, the ANN-PSO model exhibited higher accuracy and stronger predictive ability, with a relative error of merely 0.2% relative to the actual values.Ten polyphenolic compounds, including morin, rhamnetin, quercetagetin, rhamnazin, and rutin, were identified, all belonging to the flavonoid (glycoside) structures.G.pentaphyllum polyphenols could efficiently reduce silver nitrate, and the prepared AgNPs showed significant antibacterial activity without cytotoxicity at the minimum bactericidal concentration.This study provides new insights and experimental basis for the intelligent optimization of complex process conditions and the high-value comprehensive development and utilization of G.pentaphyllum resources.

Key words polyphenols from Gynostemma pentaphyllum; Box-Behnken response surface methodology; artificial neural network; particle swarm optimization algorithm; green synthesis of silver nanoparticles

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044297

引用格式:武艺,刘鑫伟,彭媛媛,等.绞股蓝多酚提取工艺的响应面法与人工神经网络-粒子群优化算法优化及在纳米银绿色合成中的应用[J].食品与发酵工业,2026,52(12):345-352;362.WU Yi, LIU Xinwei, PENG Yuanyuan, et al.Optimization of extraction process of Gynostemma pentaphyllum polyphenols by response surface methodology and artificial neural network-particle swarm optimization, and its application in green synthesis of silver nanoparticles[J].Food and Fermentation Industries,2026,52(12):345-352;362.

第一作者:硕士研究生(赵琳静副教授为通信作者,E-mail:ljzhao@sues.edu.cn)

基金项目:上海市教委人工智能促进科研范式改革、赋能学科跃升计划重点项目(2024AI001);上海市大学生创新训练项目(cs2504003)

收稿日期:2025-08-22,改回日期:2025-11-06