血红素(heme)是一类含铁的卟啉化合物,作为血红蛋白、肌红蛋白和细胞色素等关键蛋白的辅基,参与氧气运输、电子传递和能量代谢等重要生物过程[1]。在工业应用中,血红素不仅是合成血卟啉类药物的重要原料[2],更因其能赋予植物基产品“肉”的色泽与风味[3],成为植物肉产业备受追捧的食品添加剂。传统的动物血液提取法面临原料来源有限、成本较高及安全风险等问题[4],因此,利用微生物发酵法生物合成血红素已成为学术界和产业界的研究焦点[5-8]。
目前,微生物合成血红素的研究已在多种底盘细胞中取得显著进展。例如,通过代谢工程改造大肠杆菌(Escherichia coli),其血红素产量已突破1 g/L[9-10],但其固有的内毒素问题限制了其产品在食品和医药领域的直接应用。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的血红素产量也达到了300 mg/L的水平,但其发酵过程往往需要添加具有潜在毒性的乙胺丁醇[11]。CHEN等[6]则报道了一种“细胞工厂联合体外酶催化”的策略,利用球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)高效合成前体物质粪卟啉Ⅲ,再经酶转化获得了高达10.8 g/L的血红素,展示了该策略巨大的生产潜力。
然而,尽管上述策略在产量上取得了突破,但其所依赖的非“公认安全”(Generally Recognized as Safe,GRAS)宿主以及“发酵+体外转化”的两步法工艺,对于追求生产工艺简化、降低下游纯化成本与难度、并确保最终产品合规性的食品工业而言,仍存在一定的挑战。因此,在GRAS级微生物底盘中,通过一步发酵直接生产食品级血红素,仍然是一条具有商业价值的技术路线。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为一种经典的GRAS级工业微生物,具有遗传背景清晰、培养条件简单、无内毒素等突出优点[12],被认为是生产食品级血红素的理想细胞工厂。本课题组前期已通过组成型表达内源C5途径、异源C4途径和内源尿卟啉原Ⅲ合成途径的关键酶以及异源的血红素外排蛋白,并敲除血红素降解酶基因等,成功构建了一株无需抗生素和诱导剂的B.subtilis血红素生产菌株[13]。该菌株的血红素总产量达到248.26 mg/L,且胞外分泌比例高达89%,在简化下游分离纯化流程方面显示出优势。然而,尽管取得了上述进展,但连接尿卟啉原Ⅲ与产物血红素的途径,被认为是限制产量进一步提升的关键瓶颈,其内部的限速步骤尚不明确。
B.subtilis主要通过粪卟啉依赖性(coproporphyrin-dependent, CPD)途径合成血红素(图1),该途径区别于E.coli所采用的原卟啉依赖性(protoporphyrin-dependent, PPD)途径[14-15]。在该途径中,尿卟啉原脱羧酶(UroD,hemE编码)和粪血红素脱羧酶(ChdC,hemQ编码)分别是催化起始和终止反应的关键酶。尽管有研究报道在C.glutamicum中过表达这2个基因能轻微提升产量[11],但它们在B.subtilis中的调控作用及对血红素合成的影响仍不明确。因此,本研究聚焦于B.subtilis这一安全底盘,旨在通过系统性地强化CPD途径关键基因hemE和hemQ的表达,识别其血红素合成途径中的主要代谢瓶颈,为后续通过理性代谢工程手段,开发高效、安全、低成本的一步发酵法生产食品级血红素奠定理论基础。
图1 枯草芽孢杆菌血红素合成的CPD途径示意图
Fig.1 Schematic diagram of the CPD pathway for heme biosynthesis in Bacillus subtilis
注:hemE,编码尿卟啉原脱羧酶;hemQ,编码粪血红素脱羧酶。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株、质粒和引物
本研究中所使用的菌株、质粒及引物的详细信息分别见表1和表2。
表1 本实验所用菌株和质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
菌株和质粒遗传背景来源菌株BSH11B.subtilis 168, ΔaraR::Para-neo, ΔhemX, ΔywfM::P43-hemA, ΔrocG::P43-alaSBj, ΔgcvTP::PlapS-hemC-hemD-hemB, ΔywjI::PlapS-ccmABCEc, ΔnasF, ΔhmoA, ΔhmoB[13]BS-ΔydaPmBS168 N, ΔydaP::cat-araR[16]BS-ΔyvkCmBS168 N, ΔyvkC::cat-araR[16]BSΔ6-pfkAmBSΔ6, ΔyvkC::P43-pfkA-DN-cat-araR[16]BSH12BSH11, ΔydaP本研究BSH13BSH11, ΔyvkC本研究BSH14BSH11, ΔydaP::TP2-hemE本研究BSH15BSH11, ΔyvkC::P43-hemQ本研究BSH15 mBSH11, ΔyvkC::P43-hemQ-DN-cat-araR本研究BSH16BSH11, ΔydaP::TP2-hemE, ΔyvkC::P43-hemQ本研究质粒pUC57-simple-VHbAmpR, containing the constitutive promoter TP2[17]
表2 本实验所用引物
Table 2 Primers used in this study
引物序列(5′-3′)ydaP-U1CTATGTCATCCAAGGTGTCAydaP-G2GAGAGCCGAATCACAGACydaP-D2TGGCTGATTGCTGTATTGAydaP-U2TCAATACCACAGGAGAAAGGTP2-1qGCCTTTCTCCTGTGGTATTGAGTTTATGGTTGCGTTGATGGTP2-2TCTTTACCCTCTCCTTTTAAhemE-1qTTAAAAGGAGAGGGTAAAGAATGAGTAAACGAGAAACGhemE-2ATACGCCATCACGAGAAGydaP-hemE-D1qGCTTCTCGTGATGGCGTATCGGTCGTAGTGGATGTCAyvkC-U1CAATGGCTTTCGGCTGATyvkC-G2TCTCCTTGAATGTCCTGATACyvkC-D2AGTGGAGACGGTGAATGAP43-2TTGTAAATTCCTCTCTTACCTAThemQ-1qTATAGGTAAGAGAGGAATTTACAAATGAGTGAACAGCAA-ATGAChemQ-2CTTTCCCGATCCCTTGACyvkC-hemQ-D1qAGTCAAGGGATCGGGAAAGTGCTGTGATAGAGGATGAART-ccpA-1ACGAGCATGTGGCGGAATTRT-ccpA-2CGATAGCGACTGACGGTGTTRT-hemE-1GAATCTGCTGATGTCCAAGRT-hemE-2TGTTCTGTAATCTGCCTGATRT-hemQ-1TTGCTGAGTTCACCATTCCRT-hemQ-2CAGTTGTCGTTGCCAGAT
1.1.2 主要试剂
2×Phanta Flash Master Mix (Dye Plus)、2×Taq Master Mix (Dye Plus),南京诺唯赞(Vazyme)生物科技股份有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒,天根生化科技(北京)有限公司;高纯总RNA快速提取试剂盒,北京百泰克生物技术有限公司;NGScript Ⅲ All-in-one RT Mix with(gDNA)、2× Realtime SYBR qPCR Mixture(NO-ROX),上海惠凌(HLingene)生物技术有限公司;硫酸新霉素(Neo)和氯霉素(Cap),生工生物工程(上海)股份有限公司;氯化高铁血红素,Sigma-Aldrich公司。
1.1.3 培养基
LB培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,121 ℃灭菌20 min。LB固体培养基在液体培养基基础上额外添加15 g/L琼脂。根据需要,在灭菌后的LB培养基中添加终质量浓度为16 μg/mL的Neo或7 μg/mL的Cap。
发酵培养基(g/L):蔗糖40,胰蛋白胨4,(NH4)2SO4 15,KH2PO4 5,Na2HPO4·12H2O 15,MgSO4·7H2O 0.5,FeSO4·7H2O 0.007 5。
1.2 仪器与设备
T100TM Thermal Cycler PCR仪,美国伯乐生命医学产品公司(Bio-Rad Laboratories, Inc.);Epoch 2 Microplate Spectrophotometer酶标仪,美国伯腾仪器有限公司(BioTek Instruments, Inc.);JY96-IIN超声波细胞粉碎机,宁波新芝生物科技股份有限公司;Nano-400A微量核酸仪,杭州奥盛仪器有限公司;LightCycler 480荧光定量PCR仪,瑞士罗氏诊断有限公司(Roche Diagnostics Ltd.);LC-2030高效液相色谱仪,日本岛津公司(Shimadzu Corporation)。
1.3 实验方法
1.3.1 基因敲除菌株的构建
采用无标记基因修饰方法[18]对B.subtilis的ydaP和yvkC进行敲除。
ydaP敲除菌株的构建:以BS-ΔydaPm基因组为模板,以引物对ydaP-U1/ydaP-G2扩增片段UDCRG。利用Spizizen方法制备BSH11的感受态细胞,加入片段UDCRG进行转化,涂布含有7 μg/mL Cap抗性的LB(LBC7)固体平板,置于37 ℃培养箱培养14～16 h。挑取转化子,利用引物对ydaP-U1/ydaP-D2进行菌落PCR验证。将筛选到的正确转化子接入无抗LB液体培养基中振荡培养4 h,去除选择盒CR(cat-araR),取1 μL培养液涂布含有16 μg/mL Neo抗性的LB(LBN16)固体平板,置于37 ℃培养箱过夜培养。挑取转化子,再次利用引物对ydaP-U1/ydaP-D2进行菌落PCR验证,最终得到ydaP敲除菌株BSH12。
yvkC敲除菌株的构建:以BS-ΔyvkCm基因组为模板,以引物对yvkC-U1/yvkC-G2扩增片段UDCRG,转化BSH11的感受态细胞,涂布LBC7固体平板,37 ℃过夜培养。经过2次筛选后,利用引物对yvkC-U1/yvkC-D2进行PCR验证,得到yvkC敲除菌株BSH13。
1.3.2 基因过表达菌株的构建
采用无标记基因修饰方法对B.subtilis的hemQ和hemE进行过表达。
hemE过表达菌株的构建:以BSH11基因组为模板,分别以引物对ydaP-U1/ydaP-U2和hemE-1q/hemE-2扩增上游同源臂U和含有hemE基因序列的片段E;以质粒pUC57-simple-VHb为模板,以引物对TP2-1q/TP2-2扩增含有强组成型启动子TP2[19]序列的片段P;以BS-ΔydaPm基因组为模板,以引物对ydaP-hemE-D1q/ydaP-G2扩增含有同源重组片段D、氯霉素抗性基因cat和阿拉伯糖阻遏蛋白基因araR的选择盒CR、及下游同源臂G的片段DCRG。通过重叠PCR,将上述4个片段拼接成U-P-E-DCRG。转化BSH11的感受态细胞,涂布LBC7固体平板。经过2次筛选后,提取正确转化子的基因组,利用引物对ydaP-U1/hemE-2进行PCR扩增并送测,得到hemE在ydaP位点整合表达的重组菌株BSH14。
hemQ过表达菌株的构建:以BSΔ6-pfkAm基因组为模板,以引物对yvkC-U1/P43-2扩增含有上游同源臂U和强组成型启动子P43序列的片段UP[20];以BSH11基因组为模板,以引物对hemQ-1q/hemQ-2扩增含有hemQ基因序列的片段Q;以BS-ΔyvkCm基因组为模板,以引物对yvkC-hemQ-D1q/yvkC-G2扩增含有同源重组片段D、选择盒CR和下游同源臂G的片段DCRG。通过重叠PCR,利用引物对yvkC-U1/yvkC-G2,将上述3个片段拼接成UP-Q-DCRG。转化BSH11的感受态细胞,涂布LBC7固体平板。挑取转化子,利用引物对yvkC-U1/yvkC-D2进行菌落PCR验证,筛选到的正确转化子即为BSH15 m。将其接入无抗LB液体培养基中振荡培养,去除CR选择盒,涂布LBN16固体平板,过夜培养。挑取转化子,利用引物对yvkC-U1/yvkC-D2进行PCR扩增并送测,得到hemQ在yvkC位点整合表达的重组菌株BSH15。
hemE和hemQ共表达菌株的构建:以BSH15 m基因组为模板,以引物对yvkC-U1/yvkC-G2扩增片段UPQDCRG,转化BSH14的感受态细胞,涂布LBC7固体平板。经过2次筛选后,提取正确转化子的基因组,利用引物对yvkC-U1/yvkC-D2进行PCR扩增并送测,得到hemE和hemQ共表达菌株BSH16。
1.3.3 摇瓶发酵及生长曲线测定
从-80 ℃保存的甘油管中取适量菌种,涂布于LBN16固体平板,37 ℃培养过夜。挑取单菌落接种于含5 mL LB液体培养基的试管中,37 ℃、200 r/min振荡培养12 h作为种子液。按2%(体积分数)接种量将种子液转种至装有30 mL发酵培养基的250 mL摇瓶中,37 ℃、220 r/min振荡培养48 h。培养过程中每隔6 h或12 h取样1次,将菌液适当稀释后于600 nm波长下测定吸光度值(OD600),绘制生长曲线。每株菌设置3个生物学重复。
1.3.4 实时荧光定量PCR
分别收集BSH12、BSH13、BSH14和BSH15菌株发酵12 h和24 h后的菌液各1 mL,12 000 r/min离心5 min收集菌体。使用高纯总RNA快速提取试剂盒提取总RNA,使用微量核酸仪测定RNA浓度和纯度。取1 μg总RNA,使用NGScript Ⅲ All-in-one RT Mix with(gDNA)试剂盒将RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板,使用2 × Realtime SYBR qPCR Mixture(NO-ROX)在LightCycler 480实时荧光定量PCR仪上进行扩增,收集荧光信号Ct值。以ccpA为内参基因,采用2-ΔΔCt法[21]分别计算目的基因hemE和hemQ的相对表达量。
1.3.5 血红素含量测定
取发酵48 h的菌液10 mL,12 000 r/min、4 ℃离心10 min,分别收集上清液和菌体沉淀。向上清液中加入1 mol/L HCl调节pH值至2.0,12 000 r/min离心10 min收集沉淀;用2 mL 0.1 mol/L NaOH溶解沉淀,调节pH至7.0;离心收集上清液,经0.22 μm水系滤膜过滤后用于胞外血红素含量的测定。菌体沉淀用无菌去离子水洗涤1次,加入5 mL 0.1 mol/L NaOH重悬;冰浴条件下超声破碎(功率40%,工作3 s,间歇5 s,总时间8 min),12 000 r/min、4 ℃离心10 min;取上清液调节pH值至7.0,离心后经水系滤膜过滤,用于胞内血红素含量的测定。
采用高效液相色谱法测定血红素含量。色谱条件:Shimadzu LC-2030高效液相色谱仪;色谱柱为Inertsil ODS-3(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A为0.1%(体积分数)三氟乙酸水溶液,流动相B为甲醇,进行梯度洗脱[13];流速0.4 mL/min;柱温40 ℃;进样量20 μL;检测波长400 nm。以血红素标准品制作标准曲线,计算样品中血红素含量。
1.4 统计学分析
实验数据以“平均值±标准差”表示,每组实验重复3次。使用IBM SPSS Statistics软件进行统计分析。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey多重比较检验分析组间均值的差异显著性,显著性水平设定为P<0.05。
2 结果与分析
2.1 ydaP和yvkC作为潜在中性位点的评价
在B.subtilis中,ydaP基因编码丙酮酸:醌氧化还原酶,参与丙酮酸代谢;yvkC基因编码类黄酮磷酸合成酶,参与黄酮类化合物代谢。已有研究表明[16,22],敲除这2个基因对菌株生长和某些代谢产物合成无显著影响,提示它们可能适合作为外源基因的整合位点。因此,本研究首先验证ydaP和yvkC作为基因组整合位点的可行性。使用引物对ydaP-U1/ydaP-D2对ydaP敲除菌株BSH12和对照菌株BSH11进行PCR扩增及凝胶电泳分析,理论上对照菌株的扩增产物大小为3 877 bp,敲除菌株为2 717 bp。如图2-A所示,BSH11和BSH12分别在约3 900 bp和2 700 bp处出现目的条带,与预期相符,表明ydaP基因已成功敲除。使用引物对yvkC-U1/yvkC-D2对yvkC敲除菌株BSH13和对照菌株BSH11进行PCR扩增及凝胶电泳分析,理论上对照菌株的扩增产物大小为3 981 bp,敲除菌株为2 167 bp。如图2-B所示,扩增产物大小与预期一致,证实yvkC基因敲除成功。
A-ydaP基因敲除验证(1-对照菌株BSH11;2、3-ydaP敲除菌株BSH12;M-DL 5 000 DNA Marker);B-yvkC基因敲除验证(1-对照菌株BSH11;2、3-yvkC敲除菌株BSH13;M-DL 5 000 DNA Marker);C-对照菌株BSH11、ΔydaP菌株BSH12和ΔyvkC菌株BSH13的生长曲线;D-发酵48 h后各菌株的胞外和胞内血红素含量
图2 ydaP和yvkC的敲除及其对菌株生长和血红素合成的影响
Fig.2 Knockout of ydaP and yvkC and its effect on strain growth and heme production
A-hemE过表达菌株BSH14的PCR验证(M-DL5 000 DNA Marker;1-对照菌株BSH11;2,3-hemE过表达菌株BSH14);B-对照菌株BSH12和hemE过表达菌株BSH14的生长曲线;C-发酵48 h后2菌株的胞外和胞内血红素含量;D-发酵12 h和24 h时hemE基因的相对转录水平
图3 过表达hemE对菌株生长、血红素合成及基因转录的影响
Fig.3 Effects of hemE overexpression on strain growth, heme synthesis, and gene transcription
注:***表示P<0.001(下同)。
为探究基因ydaP和yvkC的敲除对菌株生长和血红素合成的影响,对BSH11、BSH12和BSH13进行摇瓶发酵。如图2-C所示,3株菌的生长曲线基本一致,表明敲除ydaP和yvkC对菌株生长无显著影响。发酵48 h后测定血红素含量,结果显示(图2-D),BSH12的胞外血红素含量为(2.58±0.31) mg/L,胞内血红素含量为(5.75±0.13) mg/L;BSH13的胞外血红素含量为(2.72±0.08) mg/L,胞内血红素含量为(5.44±0.13) mg/L,与对照菌株BSH11相比均无显著差异(P>0.05)。上述结果表明,ydaP和yvkC基因的敲除对B.subtilis的正常生长和血红素合成能力均无明显影响,证实了这2个基因位点在本研究中是有效的中性位点,为后续的基因工程改造奠定了基础。
2.2 过表达hemE对菌株生长和血红素合成的影响
为构建hemE过表达菌株,将强组成型启动子TP2与hemE基因融合后整合至BSH11基因组的ydaP位点。使用引物对ydaP-U1/hemE-2对重组菌株进行PCR验证,预期扩增产物大小为2 830 bp。如图3-A所示,重组菌株在约2 800 bp处扩增出预期大小的目的条带,而在对照菌株BSH11中未见该条带,表明TP2-hemE表达盒已成功整合。测序结果显示插入序列无突变,将该hemE过表达菌株命名为BSH14。
对ΔydaP菌株BSH12和hemE过表达菌株BSH14进行摇瓶发酵。生长曲线显示(图3-B),BSH14在12～48 h期间的生长均高于对照菌株BSH12。血红素含量测定结果显示(图3-C),发酵48 h后,BSH14的胞外血红素含量达到(23.90±1.49) mg/L,较对照菌株BSH12提高826%(P<0.001);胞内血红素含量为(7.03±0.17) mg/L,较BSH12提高22%(P<0.001)。
实时荧光定量PCR分析表明(图3-D),BSH14中hemE基因的相对转录水平在发酵12 h和24 h时分别较BSH12提升303倍和40倍(P<0.001)。结果表明,TP2启动子能够显著提高hemE的转录水平,过表达hemE能够有效提高血红素产量,尤其是胞外血红素的积累。
2.3 过表达hemQ对菌株生长和血红素合成的影响
为构建hemQ过表达菌株,将强组成型启动子P43与hemQ基因融合后整合至BSH11基因组的yvkC位点。使用引物对yvkC-U1/yvkC-D2对重组菌株进行PCR验证,预期对照菌株BSH11的扩增产物大小为3 981 bp,hemQ过表达菌株为3 265 bp。如图4-A所示,重组菌株在约3 300 bp处出现目的条带,而对照菌株在约4 000 bp处出现条带,与预期相符。测序结果显示插入序列无突变,将该hemQ过表达菌株命名为BSH15。
A-hemQ过表达菌株BSH15的PCR验证(M-DL5 000 DNA Marker;1-对照菌BSH11;2,3-hemQ过表达菌株BSH15);B-对照菌株BSH13和hemQ过表达菌株BSH15的生长曲线;C-发酵48 h后2菌株的胞外和胞内血红素含量;D-发酵12 h和24 h时hemQ基因的相对转录水平变化
图4 过表达hemQ对菌株生长、血红素合成及基因转录的影响
Fig.4 Effects of hemQ overexpression on strain growth, heme synthesis, and gene transcription
注:*表示P<0.05(下同)。
对ΔyvkC菌株BSH13和hemQ过表达菌株BSH15进行摇瓶发酵。生长曲线显示(图4-B),BSH15与对照菌株BSH13的生长趋势基本相似,但在24～48 h期间的菌体密度稍有降低。血红素含量测定结果显示(图4-C),发酵48 h后,BSH15的胞外和胞内血红素含量与对照菌株相比均无显著差异(P>0.05)。实时荧光定量PCR分析表明(图4-D),BSH15中hemQ基因的相对转录水平在发酵12 h和24 h时分别较BSH13提高了27%和37%(P<0.05)。尽管如此,hemQ的转录水平有所提升,但血红素产量并未相应增加。
2.4 共表达hemE和hemQ对菌株生长和血红素合成的影响
鉴于单独过表达hemE能够显著提高血红素产量,而单独过表达hemQ效果有限,为探索2个基因的协同效应,在菌株BSH14基因组yvkC位点整合表达hemQ,构建hemE和hemQ共表达菌株BSH16。摇瓶发酵结果显示(图5-A),与hemE单独过表达菌株BSH14相比,共表达菌株BSH16在12～48 h期间的生长略有降低,其生长模式与单独过表达hemQ的菌株BSH15基本相似。血红素含量检测结果表明(图5-B),发酵48 h后,BSH16的胞外血红素含量为(15.60±0.71) mg/L,比hemE单独过表达菌株BSH14降低约35%(P<0.001);胞内血红素含量为(6.57±0.20) mg/L,比BSH14降低约7%(P<0.05)。
A-BSH14和BSH16的菌株生长曲线;B-发酵48 h后各菌株的胞外和胞内血红素含量
图5 共表达hemE和hemQ对菌株生长和血红素合成的影响
Fig.5 Effects of co-expression of hemE and hemQ on strain growth and heme synthesis
然而,与单独过表达hemQ的菌株BSH15相比,BSH16的胞外和胞内血红素含量分别显著提高了491%(P<0.001)和15%(P<0.01)。上述结果表明,hemE和hemQ的共表达并未产生预期的协同促进效应,反而导致血红素产量较单独过表达hemE有所下降。
3 讨论
本研究首先验证了ydaP和yvkC作为基因组整合位点的适用性。结果显示,敲除这2个基因对B.subtilis的生长和血红素合成均无显著影响,这与前期在β-丙氨酸[16]和表面活性素[22]合成研究中的报道一致,证实了它们是用于代谢工程改造的安全、中性的整合位点,为后续基因的稳定表达奠定了基础。
在此基础上,本研究对CPD途径的关键酶进行了系统研究。hemE编码的UroD属于非氧化性脱羧酶,不依赖辅因子,催化尿卟啉原Ⅲ的4个乙酸基团脱羧生成粪卟啉原Ⅲ,是血红素合成的关键步骤[23]。在E.coli中,利用高拷贝质粒过表达hemE,血红素产量提升24%[24]。在C.glutamicum中,将hemE的天然起始密码子GTG替换为ATG并过表达,血红素产量增加7%[11]。本研究中,hemE的天然起始密码子同样为GTG,将其突变为ATG并与强组成型启动子TP2[19]融合整合至基因组的ydaP位点,获得了远超预期的效果:胞外和胞内血红素产量分别实现了826%和22%的显著增幅。这一结果有力地证明,在本研究的出发菌株BSH11中,UroD的催化效率是限制代谢流从尿卟啉原Ⅲ流向血红素合成途径的首要限速步骤。同时,观察到过表达hemE的菌株生长速率加快,这可能是由于血红素供应增加,促进了呼吸链中细胞色素的合成,从而提升了细胞整体的能量代谢水平。
与hemE的显著效果相反,过表达CPD途径末端的hemQ并未提高血红素产量。hemQ编码的ChdC以过氧化氢(H2O2)为氧化剂,催化粪血红素Ⅲ的2个丙酸基团脱羧生成血红素[25]。在C.glutamicum中,利用质粒过表达hemQ,血红素产量增加9.1%[11]。结合本研究中UroD是主要限速步骤的结论,可推断在前体粪卟啉原Ⅲ供应不足时,下游的ChdC酶未达到催化饱和。因此,单纯提高其表达量无法拉动整个代谢流,对终产物合成的贡献有限。然而,P43启动子在其他研究中表现出更强的转录促进效果,如驱动hemA基因转录提高27.3倍[13],驱动pfkA和aspB基因转录分别提高2倍和4.2倍[16]。推测这可能与hemQ的mRNA稳定性较差或P43启动子在该整合位点的实际效率有关。
然而,组合强化hemE和hemQ时,并未出现预期的协同增效,共表达菌株的血红素总产量较单过表达hemE的菌株下降了28%,并伴随生长抑制。这种负面效应可能是由于2种蛋白的高水平表达加重了细胞的代谢负担,与细胞生长竞争资源。更直接的原因可能在于,hemE的过表达导致其中间产物粪卟啉原Ⅲ的快速积累。此类卟啉化合物是已知的光敏剂,其在胞内过度积累会诱发氧化应激,从而损伤细胞[26]。此外,hemQ编码的ChdC催化反应需要消耗H2O2[25],其过表达可能扰动细胞内氧化还原稳态。
综上所述,本研究确定了UroD是B.subtilis血红素合成的关键限速酶,同时揭示了不平衡的代谢流改造可能带来的负面效应,强调了途径中各酶表达水平精确匹配的重要性。因此,后续的优化工作应着眼于多基因表达的精细调控,例如通过筛选不同强度的启动子文库来优化hemE和hemQ的表达配比,或引入动态调控元件,实现途径中各酶的协同表达,从而在最大化代谢通量的同时,避免因失衡而产生的负面效应,最终实现血红素的高效、稳健生产。
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