高温大曲(high-temperature Daqu, HTD)是酱香型白酒生产的关键发酵剂,其品质主要取决于功能微生物群落与代谢活性[1]。传统HTD生产依赖母曲接种,但群落复杂性导致批次间属性差异显著[2]。近年来,合成群落强化策略因其定向调控优势在低温/中温大曲中取得进展,但在HTD中研究较少[3-4]。
红曲霉(Monascus spp.)是HTD中重要的功能微生物,其主要机制体包括:分泌淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和酯酶等,提供营养底物[5];与芽孢杆菌等互作,促进吡嗪类、苯乙醇等风味物质合成[6];通过氨基酸代谢基因富集增强风味前体供给[7]。例如,佛罗里达红曲霉(Monascus floridanus)强化提高了HTD风味物质总含量。紫色红曲霉(Monascus purpureus)强化提高了四川麸醋的有机酸、芳香酯和醇类含量[8]。红曲霉功能主要依赖微生态环境与代谢通路调控,并与发酵系统中的芽孢杆菌、链霉孢囊菌和嗜热放线菌等密切相关。
尽管红曲霉强化可定向调控HTD微生态,实际应用仍需解决以下问题:高温和湿度波动影响红曲霉酶活性的稳定性[5];与土著微生物(如芽孢杆菌)的碳氮源竞争可能抑制功能表达[9];需优化接种质量分数(如0.5%)与发酵阶段控制[8]。亟待解决关键问题则是结合动态环境调控与合成群落设计,以平衡功能性与生态稳定性。
本研究基于从HTD中分离的佛罗里达红曲霉菌株,生产强化HTD,并从理化酶活性质、代谢轮廓和微生物群落结构等角度,多维分析佛罗里达红曲霉强化对HTD属性的影响,以期为HTD品质定向调控策略建立提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
本研究使用的佛罗里达红曲霉H26菌株由本研究室分离自HTD并保藏。
1.1.2 原料与试剂
小麦原料,古蔺仙潭酒厂有限公司;Quant-iT PicoGreen双链DNA检测试剂盒,美国英杰生命技术有限公司;OMEGA Soil DNA Kit(D5635-02)试剂盒,美国欧米伽生物科技公司;辛酸甲酯标准品,Sigma-Aldrich公司;其余化学试剂(分析纯)均购自成都金山化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
Trace 1300-TSQ 9000 GC-MS仪,NanoDrop ND-1000分光光度计,美国赛默飞世尔科技公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头,美国Supelco公司;Illumina Miseq测序仪,美国因美纳公司。
1.3 实验方法
1.3.1 红曲霉种子麦曲制备
参考张柱等[8]报道的方法制备红曲霉种子麦曲。将一定量的小麦粉和水拌和均匀,使水分含量约为37%。小麦粉浸润30 min后,121 ℃湿热灭菌20 min,冷却至40 ℃以下,接种活化后的红曲霉H26的孢子3～4环,置于30 ℃培养箱中培养3～5 d,45 ℃下干燥12 h,粉碎备用。
1.3.2 HTD生产与样品采集
生产工艺如ZHU等[10]所述并稍作修改:将小麦粉与母曲粉按设计比例混合,加水至含水量37%,人工踩曲形成标准曲块(38 cm×29 cm×6 cm,中间最高处为12～13 cm高),置于曲房中堆积发酵45 d,期间进行2次翻曲(第7天第1次翻曲:F1、第16天第2次翻曲:F2)。实验设置2个组:佛罗里达红曲霉强化曲(HQ,实验组):将5.5%母曲粉与0.5%红曲霉种子麦曲(质量分数,以小麦粉计)复配使用;传统曲(CT,对照组):按常规添加6%母曲粉(质量分数,以小麦粉计)。采样:采用三维空间采样法,在翻曲(F1、F2)和转房(ZF)3个时间点,从曲房不同区域(靠门/中间/靠窗)和层次(上/中/下)采集代表性样品,经粉碎混匀后形成复合样本。取样后装入无菌袋,冷链运输至实验室,取分样置于-20 ℃和-80 ℃保藏,分别用于理化和代谢成分及微生物群落检测。HQ组在第1次和第2次翻曲及转房曲的样品依次简写为HQ-F1、HQ-F2和HQ-ZF,CT组则分别是CT-F1、CT-F2和CT-ZF。
1.3.3 理化与酶活力测定
水分含量、酸度、氨基酸态氮、糖化力和酯化力的测定参照 QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》所述的方法检测。pH和总氮含量指标的测定参照WANG等[11]所述方法。
1.3.4 挥发性化合物测定
挥发性化合物采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)技术检测,以辛酸甲酯为内标,具体参考QIN等[12]描述的方法。将1.00 g样品和10 μL内标物质(辛酸甲酯,0.007 9 g/100 mL)加入20 mL顶空瓶中,使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS纤维于60 ℃下萃取吸附挥发性组分45 min后,于250 ℃解吸5 min。气相色谱条件:进样口温度250 ℃,载气为流速1 mL/min的高纯氦气(He)(>99.999%),不分流模式;升温程序:初始温度40 ℃,维持5 min,以4 ℃/min升温至100 ℃,以6 ℃/min升温至230 ℃,维持10 min。质谱条件:离子源温度250 ℃,传输线温度300 ℃,电离方式为电子电离(electronic ionization,EI)源,电子能量70 eV,扫描范围35～400 amu。
1.3.5 高通量扩增子测序
参照MU等[13]的方法完成样品高通量测序及生物信息学分析。取2.00 g大曲样品,采用OMEGA Soil DNA Kit试剂盒提取总基因组DNA。0.008 g/mL琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop ND-1000分光光度计分别检测所提取的DNA含量(1.8～2.0)、纯度(≥2.0)和完整性。分别使用通用引物338F/806R(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′/5′-GGACTACHVGGGTWT-CTAAT-3′)和ITS5/ITS1(5′-GGAAGTAAAAGTCG-TAACAAGG-3′/5′-GCTGCTTCTTCATCGATGC-3′)对细菌16S rRNA V3-V4区和真菌ITS1区进行扩增。PCR组分包含5 μL Q5高保真反应缓冲液(5×)、5 μL Q5高保真气相色谱缓冲液(5×)、0.25 μL Q5高保真DNA聚合酶(5 U/μL)、2 μL脱氧核糖核苷三磷酸(2.5 mmol/L)、正反引物各1 μL(10 μmol/L)、2 μL DNA模板、8.75 μL ddH2O。细菌PCR扩增程序为:98 ℃预热2 min,98 ℃变性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸 30 s,共25个循环,最后72 ℃保持5 min;真菌PCR扩增程序为:95 ℃预热3 min,95 ℃变性30 s,61 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共32个循环,最后72 ℃保持10 min。用Vazyme VAHTSTM DNA 磁珠纯化扩增产物,并使用Quant-iT PicoGreen 双链DNA检测试剂盒进行定量。等量汇集扩增产物后,利用建库试剂盒 MiSeq Reagent Kit v3 进行文库构建,并送上海派森诺公司在Illumina NovaSeq平台进行双端2×250 bp测序。
原始测序数据基于QIIME2(2019.4)处理。首先,使用demux插件对原始序列进行解码处理,并利用 cutadapt 插件进行引物切除。然后使用DADA2插件对序列进行质量过滤、去噪、合并和嵌合体去除等数据处理。对上述获得的序列按100%的序列相似度进行归并,生成特征性序列(amplicon sequence variant,ASV)以及丰度数据表格,并进一步移除仅在一个样本和单一序列中发现的ASV。最后,根据Silva(v 132)和 UNITE(v 8.0)数据库,使用特征分类器插件中的classify-sklearn朴素贝叶斯分类器将物种分类分配至ASV。
1.4 数据分析
所有实验重复3次,数据以“平均值±标准差”表示,采用单因素方差分析和Duncan 多重比较检验,使用SPSS 26.0软件进行显著性评估,以P<0.05作为差异显著性判断标准。主成分分析(principal component analysis,PCA)、箱线图、主坐标分析(principal coordinate analysis,PCoA)、聚类热图在派森诺云平台(https://www.genescloud.cn/home)完成。正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)采用SIMCA 14.0软件完成。共现网络图、中性群落图、冗余分析、线性判别分析效应量(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)在图图云平台(http://cloudtutu.com.cn/)完成。在α多样性分析中,通过Chao1丰富度估计指数评估物种总数(丰富度),Shannon指数衡量群落的多样性(丰富度和均匀度),Simpson指数评估优势度,Pielou_e均匀度指数量化物种分布的均匀性。
2 结果与分析
2.1 理化和酶活性质差异
如表1所示,佛罗里达红曲霉强化显著影响HTD理化酶活性质在发酵阶段的动态变化。大曲水分含量随发酵过程逐段降低,HQ组显著低于CT组(P<0.05)。HQ-F1的酸度显著高于CT-F1(P<0.05),后续阶段HQ组大曲的酸度降低速率大于CT组大曲,致使HQ-ZF的酸度低于CT-ZF,表明佛罗里达红曲霉强化增强了大曲酸类物质的代谢。HQ组大曲的氨基酸态氮含量仅在第一次翻曲时低于CT(P<0.05),在后续阶段无显著差异。
表1 不同大曲样品间理化与酶活性质差异
Table 1 Differences of physicochemical and enzymatic properties among different Daqu samples
组别水分含量/%pH值酸度/(mmol/10 g)氨基酸态氮含量/(g/kg)总氮含量/%糖化力/[mg/(g·h)]酯化力/[mg/(50 g·7 d)]HQ-F136.02±0.17a4.55±0.01e5.01±0.03a3.62±0.07d15.26±0.01b34.01±3.52d21.95±9.46eHQ-F230.09±0.75c4.66±0.01d3.78±0.05b4.55±0.01b13.97±0.16c38.00±2.96d160.25±2.23cHQ-ZF14.55±0.40e5.64±0.01a1.29±0.08e3.87±0.13c12.70±0.09e96.20±5.03c403.39±10.63aCT-F132.33±0.40b5.12±0.01c3.79±0.02b5.89±0.07a15.79±0.23a172.20±17.67b6.53±2.77eCT-F225.62±0.65d5.18±0.01b3.02±0.05c4.48±0.02b14.18±0.06c244.80±28.29a73.16±7.77dCT-ZF11.85±0.22f5.13±0.02c2.91±0.02d3.99±0.06c12.83±0.02d24.40±2.42d207.28±22.17b
注：同一列中的不同上标字母表示显著差异(P<0.05)。
2组HTD的总氮含量都呈逐渐减少趋势,HQ-F1和HQ-ZF的总氮含量分别显著低于相应CT组大曲(P<0.05)。HQ组大曲的糖化力逐渐增高,而CT组大曲糖化力是先增后减,最后HQ-ZF显著高于CT-ZF(P<0.05)。2组大曲酯化力逐渐提高,并且HQ组大曲显著高于CT(P<0.05),与张柱等[8]报道的结果一致。
2.2 大曲挥发性化合物分析
本研究采用GC-MS技术对大曲样品挥发性化合物(volatile compounds,VOCs)轮廓进行分析,结果显示,在所有样品中共检出114种VOCs,总含量为(1.296 9±0.024 8)～(3.585 7±0.090 6) mg/kg,包括酸类(5种)、醇类(18种)、醛类(10种)、酯类(24种)、酮类(14种)和吡嗪类(14种)物质。佛罗里达红曲霉强化显著改变了HTD的VOCs积累模式(图1-A)。HQ组大曲VOCs总含量在F2时降至最低,而在ZF反弹至峰值,呈V型曲线动态变化模式,而CT组大曲VOCs总含量则持续下降,从(3.349 5±0.222 4) mg/kg降低至(2.415 8±0.098 7) mg/kg,最终转房时为(1.296 9±0.024 8) mg/kg。2种大曲样品醇类、醛类、酯类和酮类VOCs含量呈相同的变化趋势,转房时HQ组大曲中这些种类VOCs含量显著高于CT组。吡嗪类物质是高温大曲中的重要VOCs,赋予其烘焙和坚果香气。2种大曲吡嗪类VOCs含量变化趋势完全相反,即HQ组大曲中吡嗪类VOCs含量呈逐渐增加趋势,而在CT组呈逐渐降低趋势,其中HQ-ZF中吡嗪类物质含量为(2.004 2±0.068 3) mg/kg,显著高于CT-ZF(P<0.05),证实了红曲霉对风味物质富集的关键作用。
A-不同种类VOCs含量;B-不同样品VOCs轮廓PCA;C-OPLS-DA分值图;D-PLS-DA模型300次检验结果图;E-差异VOCs(VIP值>1.0)
图1 不同大曲样品VOCs轮廓
Fig.1 VOCs profiles of different Daqu samples
PCA结果(PC1+PC2=63.46%,图1-B)显示,佛罗里达红曲霉强化显著改变了HTD的VOCs轮廓动态变化模式。HQ组各时间点样品在得分图中的分布范围较CT组更广,表明佛罗里达红曲霉强化可能扩大了VOCs轮廓沿主成分方向的变化幅度。基于OPLS-DA方法进一步分析HQ组与CT组大曲VOCs轮廓差异。结果显示HQ组和CT组大曲VOCs轮廓差异存在显著差异(图1-C)且模型没有过拟合(图1-D)。基于变量投影重要性(variable importance in projection,VIP)大于1.0筛选得到16种差异VOCs(图1-E)。四甲基吡嗪赋予了高温大曲明显的烘焙和坚果香气[14],在本研究中对2种大曲VOCs轮廓差异的贡献最显著,其在HQ组中的平均含量为1.099 3 mg/kg,高于在CT中的平均含量(0.731 5 mg/kg)。类似地,具有典型柔和玫瑰花香和轻微荔枝果香的苯乙醇在不同组大曲中的分布模式不同,其在HQ组中具有较高的平均含量。以上结果说明,佛罗里达红曲霉强化显著影响了高温大曲发酵过程中的VOCs轮廓动态变化模式,主要通过提高吡嗪类、醛类和醇类VOCs含量影响高温大曲风味轮廓。
2.3 大曲微生物群落结构分析
本研究采用高通量扩增子测序分析佛罗里达红曲霉强化对高温大曲微生物群落结构的影响,从18个样品中获得的细菌和真菌的有效序列数范围分别为57 038～107 103和78 510～138 949,其中的高质量序列数分别平均为65 715和110 361,占有效序列比例分别平均为79.63%和92.92%。佛罗里达红曲霉强化显著降低了HTD微生物群落α多样性(P<0.05)(图2-A和图2-B)。所有样品中共获得9 578个细菌ASV(B_ASV)和1 545个真菌ASV(F_ASV),分别隶属于485个细菌属和194个真菌属。本研究将各样品中总相对丰度(relative abundance,RA)排名前10的细菌属与真菌属分别定义为其优势属,其累计RA分别是89.72%～99.52%与86.78%～99.52%。如图2-C所示,优势细菌主要包括芽孢杆菌属(Bacillus)、克罗彭施泰特氏菌属(Kroppenstedtia)、枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)和岩芽孢杆菌属(Scopulibacillus)等;优势真菌属主要包括嗜热子囊菌属(Thermoascus)、曲霉属(Aspergillus)、红曲霉属(Monascus)和嗜热霉菌属(Thermomyces)等。佛罗里达红曲霉强化显著改变了Bacillus和Kroppenstedtia的优势度动态变化模式,在发酵过程中,前者的RA依次为(19.86±0.17)%、(46.24±0.19)%、(0.61±0.03)%,后者的RA依次为(36.36±0.33)%、(4.47±0.24)%、(49.7±0.4)%。在HQ-F2中Virgibacillus的RA为(2.91±0.18)%,显著低于CT-F2[(4.77±0.35)%](P<0.05)。佛罗里达红曲霉强化提高了F2～ZF阶段高温大曲中Virgibacillus的富集速率,导致其HQ-ZF中的RA显著高于CT-ZF。在F1～F2阶段,相较于CT组,HQ组大曲中Scopulibacillus优势度增加率较高。然而在发酵后期的F2～ZF阶段,HQ组大曲中Scopulibacillus的RA大幅降低,CT组则无显著变化。在所有大曲样品中,Monascus仅在HQ-F1中具有较高的优势度,RA为(38.09±16.04)%,显著高于CT-F1[(2.6±1.49)%](图2-D),说明本研究中采用的佛罗里达红曲霉强化方式显著提高了高温大曲在发酵前期中Monascus的RA。在后续F1～F2阶段,HQ组大曲中Monascus的RA大幅度降低,在ZF时为(0.01±0.01)%。而在CT-ZF中Monascus的RA为(8.5±0.43)%,显著高于CT-F2(P<0.05),这可能是由于传统曲中富集了来自环境中的微生物。在2组大曲中,Thermoascus的RA均呈先增后减的变化趋势,并且在CT组中的变化幅度显著小于HQ组。在HQ-F2真菌群落中,Thermoascus占据绝对优势地位,RA为(99.33±0.2)%,再次说明了HQ组大曲真菌群落较低的均匀度。基于Bray-Curtis距离的PCoA显示,不同大曲样品间细菌和真菌群落β-多样性差异显著(图2-E、图2-F)。佛罗里达红曲霉强化缩小了高温大曲在不同发酵阶段的细菌群落结构差异,随着发酵过程进行,不同种类大曲细菌群落结构差异趋于收敛,而对真菌群落演替方向的影响更为显著。本研究采用LEfSe识别不同组大曲的细菌和真菌生物标志物,如图2-G和图2-H所示。在属水平,HQ组细菌生物标志物为短杆菌属(Brevibacterium)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardiaceae)和糖多孢菌属(Saccharopolyspora),而CT组细菌生物标志物包括海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、魏斯氏菌属(Weissella)和厌氧盐杆菌属(Anaerosalibacter)。识别到的HQ组真菌生物标志物为犁头霉属(Lichtheimia),而CT组真菌生物标志物包括Aspergillus、Thermomyces、布氏白粉菌属(Blumeria)、威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)、葡萄束霉属(Botryotrichum)、嗜热丝孢菌属(Myceliophthora)和Fungi gen Incertae sedis。
A-细菌群落α多样性;B-真菌群落α多样性;C-优势细菌属分布;D-优势真菌属分布;E-细菌群落β多样性;F-真菌群落β多样性;G-细菌生物标志物;H-真菌生物标志物
图2 不同大曲样品微生物群落结构差异
Fig.2 Differences in microbial community structures of different Daqu samples
2.4 大曲微生物共现模式分析
为了探究佛罗里达红曲霉强化对高温大曲微生物共现模式的影响,本研究采用Spearman相关性(筛选标准:|Spearman’s r|>0.7,P<0.05)方法并基于平均RA大于0.01%的B_ASV和F_ASV构建共现网络,分别得到HQ网络和CT网络(图3-A、图3-B)。结果显示,佛罗里达红曲霉强化显著改变了高温大曲微生物共现网络的拓扑性质。首先,从整体规模和复杂性来看,CT网络的节点数和边数明显高于HQ网络,平均度也更高,说明CT组微生物间共现网络连接更加紧密,群落整体复杂性更强。佛罗里达红曲霉强化则使网络规模与连接性显著下降,可能抑制了部分微生物间的潜在相互作用,简化了群落的共现模式。从正/负边占比来看,HQ网络中负边比例较高,而正边比例较低,可能是红曲霉菌分泌的monascidin A(一种抗菌肽)抑制Bacillus生长所致,或红曲霉在生态位上的资源竞争或拮抗作用相关,从而打破了原有部分的协同网络。这一变化可能与红曲霉在生态位上的资源竞争或拮抗作用相关,从而打破了部分原有的协同网络。在网络连通性方面,HQ网络的平均路径长度略长、直径更大,显示其节点间的联系与网络效率相对不如CT网络。同时,HQ网络的平均聚类系数和密度低于CT网络,进一步支持其整体互作关系减弱的趋势。然而,尽管CT网络拥有更多的模块,但其模块度低于HQ网络,说明接种红曲霉后高温大曲群落划分更为清晰,功能子群间的边界更加突出,群落内部呈现出更强的分区特征。从微生物域间与域内互作关系来看,在CT网络中细菌间正边比例高达56.61%,负边比例为17.40%,说明CT网络以细菌域内互作为主。佛罗里达红曲霉强化削弱了细菌域内互作强度,增强了细菌真菌域间和真菌域内互作强度。以上结果表明,佛罗里达红曲霉强化显著影响高温大曲微生物共现模式,使微生物共现网络由原本高复杂度、高连通性的结构转变为规模缩小、负相关增强、模块化更显著的结构。这一结果表明,接种红曲霉不仅改变了群落的整体互作格局,还可能通过增加竞争作用和强化群落分区,重塑微生物群落的稳定性与功能组织。基于模块内连通性(within-module connectivity,Zi)和模块间连通性(among-module connectivity,Pi)确定了HQ和CT网络的关键类群(图3-C、图3-D)。在HQ网络鉴定出一个关键物种,隶属于Virgibacillus属,该属是高温大曲生产和酱香型白酒酿造过程中的重要微生物,对吡嗪类物质的形成具有重要的促进作用[15-16]。而CT网络鉴定出的关键物种隶属于Byssochlamys属,被报道为大曲中重要的淀粉降解和产酯微生物[17-18]。网络抗毁性试验结果再次表明,CT网络表现出较强的冗余性,佛罗里达红曲霉强化将共现网络进一步简化并降低了共现网络鲁棒性(图3-E)。这一结果表明,强化不仅改变了群落的整体互作格局,还能通过增加竞争作用和强化群落分区,重塑微生物群落的稳定性与功能组织。
A-HQ网络;B-CT网络;C-HQ网络关键节点识别;D-CT网络关键节点识别;E-HQ网络和CT网络抗毁性差异
图3 微生物共现网络分析
Fig.3 Microbial co-occurrence network analysis
A-HQ组细菌群落NCM分析结果;B-CT组细菌群落NCM模型;C-HQ组真菌群落NCM模型;D-CT组真菌群落NCM模型;E-细菌群落不同发酵阶段βNTI分析结果;F-真菌群落不同发酵阶段βNTI分析结果;G-细菌群落不同组装过程占比;H-真菌群落不同组装过程占比
图4 群落组装过程分析
Fig.4 Analysis of the community assembly process
注:*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001(下同)。
2.5 微生物群落组装过程分析
阐明群落构建的机制对于实现群落及其代谢功能的定向调控具有重要意义。建立中性群落模型(neutral community model,NCM)是评估随机性过程对群落组装过程影响的重要方法[19]。结果显示,HQ组细菌和真菌群落拟合优度(Rsqr)(图4-A、图4-C)分别低于CT组的细菌和真菌群落(图4-B、图4-D),表明佛罗里达红曲霉强化削弱了随机性过程对高温大曲微生物群落组装的影响。本研究基于β最近分类单元指数(beta nearest taxon index,βNTI)和RCBray(Bray-Curtis richness curve similarity index)揭示了对高温大曲发酵过程中微生物群落组装过程的影响。基于系统发育零模型的βNTI分析结果显示,细菌群落和真菌群落β-NTI均分布于-2～2(图4-E、图4-F),表明随机性过程主导了群落组装。HQ组和CT组在不同阶段的微生物群落的β-NTI值存在显著差异(P<0.05),表明佛罗里达红曲霉强化对组装模式具有显著影响。进一步地,基于βNTI和RCBray分析不同过程对细菌和真菌群落组装的贡献(图4-G、图4-H)。结果显示,CT组在F1～F2阶段细菌群落细菌群落为扩散限制,在后续F2～ZF阶段转变为漂变,而HQ组细菌群落过程分别为漂变和扩散限制。HQ组和CT组真菌群落组织过程在F2～ZF阶段均为漂变,而在F1～F2阶段存在明显差异。异质性选择为典型的确定性过程,对HQ组F1～F2阶段真菌群落组装的贡献率为11.11%,表明佛罗里达红曲霉强化可能在发酵早期引入了新的环境筛选压力(如次级代谢产物或酶系),从而驱动了真菌群落的功能分化。相应地,HQ组扩散限制与漂变的贡献率分别为33.33%与55.56%,而CT组则为66.67%与33.33%,进一步表明佛罗里达红曲霉强化可能降低了真菌孢子的随机扩散限制效应。综合以上结果,佛罗里达红曲霉强化不仅显著削弱了随机性过程对高温大曲微生物群落组装的支配地位,而且在发酵早期引入了异质性选择,从而协同调控了细菌与真菌的群落结构演替方向。
2.6 差异微生物的识别及其与理化、酶活力及差异代谢物相关性分析
本研究整合LEfSe分析与随机森林算法,系统鉴定了HQ与CT组间的核心差异微生物(图2-G、图2-H、图5-A、图5-B)。随机森林结果显示,造成不同种类大曲群落结构差异贡献率最高的前3种差异细菌属分别为Virgibacillus、Scopulibacillus和葡萄球菌属(Staphylococcus),而贡献率前3的差异真菌属分别为Thermoascus、Unclassified_o_Eurotiales和小囊菌属(Microascus)(图5-A、图5-B)。而LEfSe结果显示,HQ组中的细菌标志物是吡嗪合成关键菌(Virgibacillus)和纤维素降解菌(Pseudonocardiaceae),真菌标志物是Lichtheimia;CT中的细菌标志物包括Oceanobacillus、Leuconostoc等,而真菌标志物含有Aspergillus、Thermomyces等。值得注意的是,2.2节所述红曲霉对吡嗪类物质的高效提升,可能与Virgibacillus(关键节点菌)的甲基转移酶基因(KEGG ko00240)表达上调有关[15]。
A-差异细菌属;B-差异真菌属
图5 基于随机森林算法识别差异微生物
Fig.5 Identification of differential microorganisms based on random forest algorithm
如图6-A和图6-B所示,冗余分析(redundancy analysis,RDA)结果显示,RDA1和RDA2累计解释率分别为86.36%和88.10%。结果显示,Bacillus属与大曲酸度、糖化力、总氮含量、氨基酸态氮含量和水分含量等多种理化酶活性质间表现出显著正相关性。Bacillus是白酒大曲中的重要属,在酿造过程中具有原料降解、风味合成和微生态调控等重要功能。有研究报道,pH是驱动大曲微生物群落组装的重要理化指标,在本研究中Kroppenstedtia属与大曲pH呈显著正相关,提示该属微生物可能在高温大曲微生物群落生态分化中具有重要作用。这些结果证实了Bacillus在原料降解中的核心作用[9],Virgibacillus与四甲基吡嗪强相关(图6-C),与FANG等[15]报道的结果一致。此外,CHEN等[20]也报道了Scopulibacillus与酯化力呈显著正相关。综上所述,随机森林的核心任务在于识别对强化曲与对照曲群落差异贡献最大的关键微生物,并据此构建“菌群-代谢物”关联假说。后续研究将聚焦于上述差异微生物,整合宏基因组与转录组数据,系统阐释其功能基因表达与差异代谢物合成之间的动态耦合关系,从而深化对群落功能差异机制的理解。
A-差异细菌属与理化酶活性质间RDA;B-差异真菌属与理化酶活性质间RDA;C-差异微生物与差异挥发性化合物间相关性分析
图6 差异微生物与理化酶活性质及差异化合物间相关性分析
Fig.6 Correlation analysis of differential microorganisms with physicochemical, enzymatic activity properties, and differential metabolites
3 结论
本研究系统探究了佛罗里达红曲霉强化对高温大曲微生物组成和代谢特性的影响。佛罗里达红曲霉强化显著降低HTD水分、加速酸度回落并提升糖化力与酯化力;挥发性代谢组揭示114种VOCs中关键香气物质四甲基吡嗪和苯乙醇在强化曲富集。高通量测序表明强化可降低α多样性、重塑群落演替,缩小共现网络规模并提升负边比例,使稳定性下降;零模型分析证实红曲霉引入异质性选择压力,驱动组装由随机向确定性转变。综上,佛罗里达红曲霉强化可定向调控HTD微生态与代谢功能,为其品质强化提供了参考。
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