N-乙酰基-5-甲氧基色胺又名褪黑素(melatonin, MT)是一种吲哚胺类衍生物,最先于1958年在牛松果腺中发现并提取,后发现其广泛分布于动植物、微生物等生物体中[1-2]。在植物体内,MT有调节开花、促进种子萌发、果实成熟、保护叶绿素、延缓叶片衰老等功效[3];在动物体内,MT可调节昼夜规律、改善睡眠质量、延缓衰老、增强免疫力和抗肿瘤等[4-5]。MT具有两亲性,可透过生物膜进入机体循环系统,并经血液进入牛乳[6]。世界贸易组织对成年人MT的推荐摄入量应低于0.2 mg/(kg·d)[7],过量摄入MT会引起头痛、头晕、恶心、嗜睡等不良反应,而MT缺乏则可能导致失眠和内分泌失调[8-9]。中国和美国、加拿大等国家要求满足特定条件可允许MT在保健食品或类似产品中使用,但欧盟则禁止将其作为食品原料使用。国外有乳品公司通过调节产MT的因素生产富含MT的牛乳,以作为商业化助眠剂[10-11],国内也有含MT乳制品开发的研究报道[12-14]。随着我国乳品产业的蓬勃发展,消费者对新价值、新功效乳品需求也不断提升,含MT牛乳及其制品或将成为睡眠障碍人群的重要选择[15-17]。因此,开发牛乳及其制品中MT的准确、灵敏、高通量检测方法,对于功能性乳制品开发、质量控制和市场监管具有重要意义。
目前,针对MT的检测方法主要有放射免疫和酶联免疫吸附法[18-19]、液相色谱法(HPLC)[20-21]、液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)[22-24]等,涉及生物样品(母乳、血液等)、植物样品(枸杞植株等)和食品样品(牛乳、鸡蛋、保健食品等)。其中,免疫分析方法因其抗体特异性不足或存在其他内源性物质和(或)结构类似物时,会影响测定的准确性[25];HPLC法所需分析时间较长,仅在MT含量较高时方可实现精准测定;而HPLC-MS/MS法的高特异性和灵敏度,是实现MT精准检测的较佳方法。JIN等[22]利用MT-d3作为替代标准品、MT-d4为内标,建立了二维液相质谱在线富集法对母乳中痕量MT的精准检测,定量下限达1 pg/mL,但此方法对仪器和人员要求高,且一维HPLC-MS/MS无法达到这种灵敏度;YAO等[24]开发了HPLC-MS/MS外标法测定牛乳中的MT,该方法定量限(limit of quantitation,LOQ)为0.10 ng/mL,但需全程在低温下进行;白富宇等[26]建立的HPLC-MS/MS方法,其前处理涉及氮吹、复溶等步骤,操作较为复杂,同时需要依赖内标实现准确定量,且仅适用生乳样品,方法定量限为0.05 ng/g;已发布的团体标准T/BDAS 001—2023《牛乳中褪黑素含量的测定-液相色谱-串联质谱法》也可实现对牛乳中MT的检测,但该标准也存在前处理复杂、基质效应明显、需依赖内标定量的问题。因此,开发前处理简单、灵敏度高、分析时间短的微量MT检测方法用于牛乳品质监测及含MT乳制品十分必要。本研究基于HPLC-MS/MS技术,采用蛋白沉淀和固相萃取净化技术,对乳粉及牛乳中蛋白、磷脂、糖类等干扰物进行除杂,同时优化分析条件,建立了乳粉及牛乳中微量MT的检测方法,为功能性乳制品开发和监管提供重要技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
乳粉、牛乳,本地市场;褪黑素标准品(CAS号:73-31-4,纯度>99%),北京曼哈格BePure标准物质有限公司;甲醇、乙酸、乙酸铵、乙腈(色谱纯),美国Thermo Fisher Scientific公司;Waters Oasis WAX、HLB、MAX、MCX固相萃取柱(规格500 mg、6 cc),美国Waters公司;LC-C18固相萃取柱(规格500 mg、6 cc)、乙酸锌、亚铁氰化钾(分析纯),广州化学试剂厂;实验用水为超纯水(Milli-Q超纯水系统制备),美国Millipore公司。
1.2 仪器与设备
Waters XEVO TQ-XS超高效液相色谱串联质谱仪、ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)及相应预柱(1.7 μm),美国Waters公司;MS 204TS万分位天平,上海梅特勒-托利多仪器有限公司;Allegra X-30R离心机,美国Berkman Coulter公司;2600TH超声波清洗器、固相萃取装置,上海安谱实验科技股份有限公司;EYEL4高速振荡机,上海爱朗仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 溶液的配制
标准溶液:准确称量适量标准品,甲醇定容,制得1.0 mg/mL储备液。准确吸取储备液1.0 mL,用甲醇定容至100 mL,得到质量浓度为10.0 μg/mL的标准溶液1;吸取1.0 mL标准溶液1于100 mL容量瓶中,用甲醇定容,制得100 ng/mL的标准溶液2;吸取1.0 mL标准溶液2于100 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成1 ng/mL的标准溶液3;吸取适量标准溶液3,乙腈定容,得到0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 ng/mL的标准曲线。
乙酸锌溶液:准确称量21.9 g乙酸锌于烧杯中,加入3 mL乙酸,加水溶解并定至100 mL容量瓶,摇匀后转移至细口瓶备用。
亚铁氰化钾溶液:准确称取10.6 g亚铁氰化钾,加水溶解并定至100 mL容量瓶,摇匀后转移至细口瓶备用。
1.3.2 样品前处理
乳粉样品:准确称取1.0 g样品于50 mL离心管中,加入5 mL水,摇匀后依次加入10 mL甲醇、1 mL乙酸锌溶液和1 mL亚铁氰化钾溶液,振荡2 min后超声提取10 min,于8 000 r/min离心10 min,将上清液转移至25 mL比色管中,残渣加入5 mL甲醇重复提取1次,离心后合并上清液,甲醇定容至刻度。依次用5 mL甲醇和5 mL水活化SPE柱,移取5 mL提取液与等体积水混匀后共同流经SPE柱,用5 mL水淋洗,抽干,加入2 mL乙腈洗脱定容至2 mL,再过0.22 μm亲水有机滤膜后移至进样瓶中待测。
牛乳样品:准确称取1.0 g样品于15 mL离心管中,加入2 mL水,摇匀后乙腈定容至10 mL,振荡2 min后超声提取10 min,置于冰箱4 ℃冷藏10 min,8 000 r/min离心10 min得提取液;依次用5 mL甲醇和5 mL水活化SPE柱,移取5 mL提取液与等体积水混匀后共同流经SPE柱,用5 mL水淋洗,抽干,加入2 mL乙腈洗脱定容至2 mL,再过0.22 μm亲水有机滤膜后移至进样瓶中待测。
加标样品:选取乳粉和牛乳的阴性样品,在准确称量后依次按照质量浓度0.2、0.4、2.0 ng/g加入相应量的MT标准溶液,随后按上述步骤对样品进行前处理。
1.3.3 色谱-质谱条件
1.3.3.1 色谱条件
色谱柱:ACQUITY BEH C18 (2.1 mm×100 mm×1.7 μm),柱温40 ℃,流动相A:水,流动相B:乙腈。梯度洗脱程序如下:0～2.0 min,10% B;2.1～4.0 min,40% B;4.1～5.0 min,80% B;5.1～6.0 min,10% B。流速0.3 mL/min;进样量1.0 μL。
1.3.3.2 质谱条件
离子源:电喷雾离子源,扫描方式:正、负离子模式,检测方式:多反应监测模式(multiple reaction monitoring,MRM),毛细管电压2.0 kV,流量650 L/h,源温度150 ℃,脱溶剂气温度550 ℃。质谱优化参数见表1。
表1 褪黑素的质谱参数及出峰时间
Table 1 Mass spectrometry parameters and appearance time of melatonin
化合物母离子(m/z)子离子(m/z)锥孔电压/V碰撞能量/eV保留时间/minMT343.14174.08∗18164.38343.14159.1018264.38
注：*为定量离子。
1.3.4 基质效应
根据参考文献[27],选取乳粉和牛乳的阴性样品并按1.3.2节中步骤前处理,将所得最终测定液为溶剂,按1.3.1节中步骤配制乳粉和牛乳MT基质标准曲线,再将各浓度点的两样品基质标准工作液、对应相同浓度的乙腈标准溶液上机测定,每个基质的浓度点均进行6次重复测定,将同一浓度下样品基质的峰面积与乙腈的峰面积比值作为MT的绝对基质效应(absolute matrix effect, AME),如公式(1)所示:
(1)
1.4 方法稳定性考察
在乳粉和牛乳样品中分别添加低、中、高3水平MT标准溶液后按1.3.2节中步骤前处理,3个添加水平均重复测定6次以考察本方法的日内稳定性。对3水平加标样品分别在1、3、7 d等时间间隔下测定,每个样品重复测定6次,以评估本方法的日间稳定性。
1.5 数据处理
使用Waters Connect软件中Acquisition Method模块对HPLC-MS/MS数据进行采集,用MS Quan模块分析数据,采用Origin作图,数据均表示为“平均值±标准差”。
2 结果与分析
2.1 质谱裂解规律探究
按1.3.1节中步骤配制10 ng/mL的MT标准溶液,分别在正离子([M+H]+、[M+NH4]+和[M+Na]+)、负离子([M-H]-和[M+CH3COO]-)模式下对MT进行质谱条件优化。结果表明,MT母离子在正、负离子模式下均有响应,响应强度从高到低依次为[M+H]+、[M-H]-、[M+Na]+、[M+NH4]+和[M+CH3COO]-。因此,选择响应强度最高的[M+H]+作为母离子,再对[M+H]+的母离子进行二级质谱电离,以响应最高的174.08作为定量离子、响应第二的159.10作为定性离子,同时优化锥孔电压和碰撞能量,各参数优化结果见表1。根据MT[M+H]+的母离子、子离子的ESI电离结果,推测其裂解途径分别为麦氏重排和β-裂解(图1)。
图1 褪黑素的ESI裂解途径分析
Fig.1 Fragmentation pathway of melatonin by ESI
2.2 色谱条件优化
2.2.1 色谱柱温度优化
以5 ℃为一个温度梯度,分别考察25～45 ℃等5个不同柱温条件对MT(10 ng/mL)响应强度、出峰时间及峰型的影响(图2)。随着柱温的不断升高,MT响应强度呈现先增加再下降的趋势,在40 ℃时响应强度达最高;其出峰时间则伴随着柱温的升高逐渐从4.93 min前移至4.31 min,说明柱温的升高有利于缩短MT的分析时间;而柱温对MT的峰型则无影响。因此,选择40 ℃作为测定MT的柱温。
A-色谱柱温变化对响应强度、保留时间对褪黑素的影响;B-色谱柱温变化对峰型的影响
图2 色谱柱温度变化对褪黑素的影响
Fig.2 Influence of column temperature for melatonin
注:B中色谱峰对应温度依次为45、40、35、30、25 ℃。
2.2.2 流动相优化
考察MT(10 ng/mL)在乙酸铵-乙腈、乙酸铵-甲醇、水-乙腈和水-甲醇等4种不同流动相响应强度、保留时间及峰型的影响,结果见图3。在含有乙酸铵的流动相中,MT响应强度相较于在水的流动相中低10.7%～24.6%;在乙酸铵-乙腈和乙酸铵-甲醇体系的保留时间分别为4.34、6.11 min,说明保留时间受有机相影响较大;相比含有乙腈的流动相,MT色谱峰在含有甲醇的流动相中会出现拖尾现象(图3-C)。在水-乙腈流动相中,MT响应强度佳、出峰时间前移、峰型对称。
A-4种不同流动相对褪黑素的响应强度及保留时间;B-褪黑素在水-乙腈的总离子流图;C-褪黑素在水-甲醇的总离子流图;D-褪黑素在水-乙腈和水-甲醇的总离子流图比较
图3 10 ng/mL褪黑素在4种不同流动相下的响应强度、保留时间及峰型
Fig.3 Intensity retention time and peak shape of 10 ng/mL melatonin standard with 4 different mobile phases
而ZHAO等[23]在用HPLC-MS/MS测定MT时,发现采用甲醇作为流动相比用乙腈有更高的灵敏度和保留效果;但本试验表明,虽然甲醇确实比乙腈有更高的灵敏度,但甲醇对MT的保留效果不及乙腈(图3-D),这可能与所选用水相有关。此外,有研究表明,甲醇作为流动相的分析时间为9～17 min[24,26],乙腈作为流动相分析时间仅需5 min[22],这与本试验结果一致,即甲醇作为流动相所需分析时间更长,所以选择水-乙腈作为流动相。
2.3 样品前处理条件优化
实验以乳粉样品为基质,加标浓度为20 ng/g,按1.3.2节中步骤进行样品前处理,考察Waters Oasis MAX、MCX、WAX、HLB和LC-C18 5种不同净化小柱对MT提取效果的影响,提取回收率见图4。结果表明,使用MCX和LC-C18对MT进行提取净化回收率在25%以下,MAX和WAX对MT的提取回收率均高于120%,仅HLB对MT的提取回收率为100.3%。因此,选用Waters Oasis HLB作为MT的提取净化柱。
图4 五种固相萃取柱对褪黑素的提取回收率
Fig.4 Recoveries for melatonin by five solid phase extraction columns
2.4 基质效应
按1.3.4节方法,分别配制以乳粉、牛乳和乙腈为溶剂的系列标准曲线,基质效应结果见表2。结果表明,MT在乳粉和牛乳中的绝对基质效应分别为93.2%～105.1%和97.0%～109.1%,相对偏差分别为2.4%～9.6%和0.8%～8.6%。在仪器分析方法中,基质效应介于90%～110%可认为没有基质效应或基质效应较小[28]。说明本净化方法效果良好,可较好地消除基质效应,可直接采用乙腈溶液的标准曲线对其进行定量测定。
表2 褪黑素在乳粉和牛乳中的绝对基质效应(n=6)
Table 2 Absolute matrix effects of melatonin in milk powder and raw milk samples(n=6)
浓度/(ng/mL)基质效应/%乳粉牛乳0.01105.1±3.797.0±6.80.02103.4±5.3108.0±1.50.05101.5±2.4103.8±0.80.193.2±9.6106.4±5.50.299.9±3.8105.9±3.20.592.3±6.5109.1±8.6
2.5 方法学验证
2.5.1 线性范围、相关系数、检出限和定量限
按1.3.1节中步骤配制质量浓度分别为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 ng/mL的MT标准曲线1和质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 ng/mL的MT标准曲线2。以MT的峰面积(y)为纵坐标,以其质量浓度(x,ng/mL)为横坐标,建立标准线性回归曲线(图5);同时,以本方法能检测到实际样品中MT浓度的信噪比(S/N)≥3为检出限,同样以S/N≥10对应浓度为定量限。由表3可知,MT为0.05～0.5 ng/mL和0.5～10.0 ng/mL内均线性关系良好,相关系数R在0.995以上,且乳粉和牛乳的检出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ)均为0.05 ng/g和0.2 ng/g,说明本方法适用于乳粉和牛乳中MT的分析检测。
a-MT 0.5～10.0 ng/mL;b-MT 0.05～0.5 ng/mL
图5 褪黑素在不同线性范围的标准曲线图
Fig.5 Standard curve of melatonin at two linear range for melatonin
表3 褪黑素线性参数、相关系数、检出限和定量限(n=6)
Table 3 Calibration curve parameters, limits of detection and limits of quantitation for melatonin(n=6)
线性范围/(ng/mL)线性方程相关系数(r)栓出限/(ng/mL)定量限/(ng/mL)0.01～0.5y=7.47×105x-6.48×1030.999 60.0050.0200.5～10y=6.13×105x+1.83×1050.997 80.0050.020
2.5.2 日内加标回收率及精密度
按1.3.2节所述,在不含MT的乳粉和牛乳样品中进行低、中和高3水平加标回收率试验,结果见表4。乳粉样品在日内和日间的3水平加标回收率分别为93.1%～101.5%和90.5%～102.8%,牛乳样品在日内和日间的3水平加标回收率分别为94.4%～103.7%和92.3%～104.6%,2种基质在日间和日内RSD介于2.5%～6.9%,表明本方法稳定性较好。
表4 褪黑素在乳粉和牛乳中加标回收率及精密度(n=6)
Table 4 Within-day recoveries and precision of melatonin in milk powder and raw milk(n=6)
样品加标浓度/(ng/g)日内回收率/%日内RSDs/%日间回收率/%日间RSDs/%0.2101.5±3.93.7102.8±3.83.7乳粉0.493.1±4.14.490.5±6.26.92.093.8±2.82.592.9±5.25.60.2103.7±4.64.5104.6±3.93.7牛乳0.494.4±2.62.792.3±4.75.12.098.1±3.13.297.3±5.15.2
2.6 实际样品检测
采用本研究建立的MT检测方法,测定市售30批乳粉和10批牛乳的MT含量。检测结果表明,1批次乳粉MT含量为0.059 ng/g,略高于检出限;有2批次牛乳检测出较低含量的MT,浓度分别为(0.15±0.01) ng/g和(0.27±0.02) ng/g,说明本方法可有效加强对市售乳粉及牛乳中MT含量的检测和风险监测。
3 结论
本文利用SPE-HPLC-MS/MS技术建立了一种快速测定乳粉及牛乳中MT的分析方法,通过探索、优化液相分析条件、质谱裂解规律及样品前处理方法,以Waters Oasis HLB柱为净化柱,采用水-乙腈作为流动相,在摆脱内标法的同时可消除基质效应,并且缩短了分析时间、提高了分析准确性、降低了定量限值。该方法灵敏度好、准确度高,可用于乳粉及牛乳中微量MT的测定,为功能性乳制品开发提供重要方法依托,同时也对加强我国乳制品市场监管具有重要现实意义。
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