蛋白质谷氨酰胺酶(protein glutaminase, PG, EC 3.5.1.44),主要以单体形式存在,分子质量为20 kDa左右,等电点为10[1-3]。PG主要作用于蛋白质或长肽侧链中的谷氨酰胺基团,在肽键不水解的情况下脱酰胺,减少蛋白结构中氢键的形成,改善蛋白质的溶解性和乳化性,是一种新型的蛋白质改性工具[4-5]。研究发现PG没有谷氨酰胺转氨酶的交联作用,也没有蛋白酶的水解作用,它只作用于蛋白质和多肽中的谷氨酰胺基团[6]。PG的这种特性,使其在蛋白质的脱酰胺应用研究中越来越受到研究人员的重视。2020年,国家卫生健康委员审查并通过了PG作为食品添加剂新品种的安全性评估,其可以作为食品添加剂在食品中使用[7]。

已报道关于PG的表达研究包括解朊金黄杆菌、大肠杆菌、毕赤酵母和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等多种,某些研究中PG的表达以前体的形式存在,后续需要经过胰蛋白酶的加工后得到成熟PG[8-9],工艺较为复杂。另外,PG的酶活力表达水平虽然相对于原始菌株提升较高[10-11],但发酵的酶活力表达水平并不高,可能导致生产成本较高,产业化的难度较大。构建高效表达PG的优良菌株,进一步提升PG的表达水平也成为许多研究人员关注的重点。枯草芽孢杆菌是基因工程改造常用菌株,它具有表达能力强、遗传背景清晰、非致病菌等优点,是酶制剂发酵工程中常用生产菌株[12-13]。本研究以构建筛选得到的产PG的枯草芽孢杆菌为材料,通过单因素筛选和Box-Behnken试验优化其发酵培养基配方,然后在发酵罐水平经单因素试验和正交试验进行发酵工艺优化,并建立发酵动力学模型,得到关于枯草芽孢杆菌产PG的培养基组分和发酵控制工艺,为PG的工业化发酵生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枯草芽孢杆菌PG-11-3-1、葡萄糖、酵母抽提物(FM902),安琪酵母股份有限公司;玉米浆(YMJ6011),临朐县华懋饲料有限公司;胰蛋白胨(LP0042B)、酵母浸粉(LP0021B),英国OXOID公司;Z-谷氨酰甘氨酸,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;氯化钠、硫酸亚铁、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾,国药集团化学试剂有限公司。

LB培养基(g/L):胰蛋白胨10,氯化钠10,酵母浸粉5,固体LB添加琼脂20。

发酵基础培养基(g/L):葡萄糖25,酵母抽提物FM902 45,硫酸镁1.2,磷酸二氢钾1.25,磷酸氢二钾0.75,消泡油聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚0.5(发酵罐试验添加);初始pH值调至7.0,115 ℃下灭菌30 min。

发酵罐发酵基础补料配方:碳源(葡萄糖500 g/L),115 ℃下灭菌30 min。氮源(酵母抽提物FM902 300 g/L),121 ℃下灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2FD双人单面净化工作台,苏州净化设备有限公司;FE28 pH计,瑞士梅特勒-托利多集团;SN120C高压灭菌锅,YAMATO科技有限公司;MJ-150生化培养箱,LEYTE公司;722G紫外分光光度计,INESA上海仪电有限公司;ZQZY-92CE恒温摇床,上海知楚仪器有限公司;3k15离心机,Sigma公司;HH-6B恒温水浴锅,常州易晨仪器科技有限公司;BioSTAT 5L发酵罐,德国赛多利斯公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种活化与培养

取出-80 ℃超低温冰箱中保存在冻存管中的甘油管,分别取0.1 mL涂布于LB培养基上,28 ℃恒温培养15 h,挑出单菌落接种至10 mL LB液体培养基中,在28 ℃,200 r/min条件下的振荡培养12 h。摇瓶培养按2%(体积分数)的接种量接种到50 mL/150 mL装液量的不同配方的培养基中,28 ℃,200 r/min条件下的振荡培养培养44 h,作为待测样品。发酵罐培养按8%(体积分数)的接种量接种,28 ℃发酵培养64 h,定时取样作为待测样品。

1.3.2 摇瓶发酵培养基优化试验

在发酵基础培养基的基础上,分别改变单一变量碳源(葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糊精、麦芽糖、玉米淀粉、小麦淀粉水解糖、玉米淀粉水解糖、甘油)及最适碳源浓度、氮源(酵母抽提物、豆饼粉、玉米浆、氯化铵、硝酸钾)及最适氮源浓度、金属离子(硫酸镁、氯化钙、氯化锌、硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锰、氯化钴)及最适金属离子浓度,进行摇瓶培养,根据酶活力确定培养基组成。

1.3.3 摇瓶发酵培养基优化响应面试验

在单因素试验的基础上,选取葡萄糖添加量(A,g/L)、玉米浆添加量(B,g/L)、硫酸亚铁添加量(C,mmol/L)、硫酸镁添加量(D,mmol/L)为自变量,以PG酶活力为响应值(Y),设计进行4因素3水平的响应面Box-Behnken试验优化产酶培养基配方。响应面因素和水平见表1。

1.3.4 发酵工艺单因素试验

在5 L发酵罐中,底料为发酵基础培养基,培养温度28 ℃,培养时间64 h,研究培养条件分别改变单一变量发酵pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、补料氮源种类(蛋白胨、酵母粉、玉米浆)及其添加量(质量分数)、发酵液中葡萄糖控制质量浓度(0、10、20、30、40 g/L)4个因素对枯草芽孢杆菌发酵产PG的影响。

1.3.5 发酵工艺正交试验

在单因素试验的基础上,选择对发酵产酶影响较大的3个因素:pH(A)、补料氮源(B,%,质量分数)、发酵液葡萄糖质量浓度(C,g/L),设计3因素3水平正交试验,因素及水平见表2。

1.3.6 发酵动力学

在优化发酵培养基条件下,采用溶氧联控补料工艺进行50 L发酵罐放大实验,测得枯草芽孢杆菌产PG的分批补料发酵期间的菌体生物量、酶活力及葡萄糖耗糖量数据,分别选用Logistic方程、Luedeking-Piret及其相似方程来进行动力学模型的构建[14-16],通过Origin软件进行非线性拟合,得到各项参数与方程,建立相应的发酵动力学模型。

1.3.7 酶活力检测及SDS-PAGE分析方法

采用苯酚-次氯酸钠测定法:向试管中加入1 mL底物溶液及0.1 mL酶液,在37 ℃下反应10 min,反应结束后,加入1 mL三氯乙酸终止反应,取出0.2 mL反应液加入0.8 mL水,然后依次加入1 mL着色液A(苯酚和五氰基亚硝酰基高铁钠二水合物混合溶液)、0.5 mL着色液B(氢氧化钾溶液)、1 mL着色液C(碳酸钾和次氯酸钠混合溶液),混匀并在37 ℃水浴放置显色20 min,在流水中冷却,后于630 nm处,测定吸光度,通过氨含量标准曲线计算得出酶活力数据。规定在温度37 ℃条件下,每分钟水解Z-谷氨酰甘氨酸产生释放1 μmol氨所需的酶量,定义为一个酶活力单位,以U/mL表示。

SDS-PAGE分析参考文献中的方法[17]。

1.4 数据处理

采用Minitab软件进行实验设计、数据记录及统计分析,利用Origin进行实验绘图和分析。

2 结果与分析

2.1 摇瓶发酵培养基优化

2.1.1 不同碳源及其质量浓度对酶活力的影响

如图1-a所示,对枯草芽孢杆菌产酶效果最好的分别是葡萄糖和甘油,其中利用葡萄糖作为碳源时发酵产酶的效果显著优于其他碳源。由图1-b可知,葡萄糖质量浓度对枯草芽孢杆菌产PG有显著影响,在葡萄糖添加量为40 g/L时,达到最大值,发酵酶活力达到3.97 U/mL。有研究表明发酵培养基中因使用的碳源在种类和浓度上的差异,会影响菌体的生长和代谢,进而影响产酶的效果[18]。

2.1.2 不同氮源及其浓度对酶活的影响

如图2-a所示,玉米浆更有利于枯草芽孢杆菌的生长代谢和产物合成,可能的原因是玉米浆中含有的有机酸和氨基酸小肽等能被菌体更好的利用,有利于枯草芽孢杆菌的生长代谢和产物合成[19]。由图2-b可知,随着玉米浆浓度的提高,枯草芽孢杆菌产PG的最高酶活力也随之显著提高,当玉米浆质量浓度达到60 g/L时酶活力达到峰值,最高酶活力为4.73 U/mL。氮源主要以提供氮元素的方式参与枯草芽孢杆菌的生长发育和代谢合成,菌株对不同的氮源利用效率不一,不同氮源和浓度对产酶有重要影响[20]。

2.1.3 不同金属离子及其质量浓度对酶活力的影响

如图3-a所示,实验所选的7种无机盐,添加硫酸镁和硫酸亚铁有利于发酵产酶,硫酸铜和氯化钴对产酶有抑制作用。金属离子在枯草芽孢杆菌的生长和产酶过程中起到不可或缺的作用,例如影响发酵液pH或作为辅助因子影响产酶过程进而影响最终酶活力[21-22],选择硫酸亚铁和硫酸镁进行后续的浓度梯度实验。由图3-b和图3-c可知,在分别添加10 mmol/L硫酸亚铁和5 mmol/L硫酸镁时,发酵酶活力相对最高。

2.1.4 响应面试验

响应面结果如表3所示,进行统计后预测的模型为:酶活力Y=5.62+0.052A-0.39B-0.22C-0.16D-0.018AB-0.18AC+0.098AD+0.25BC-0.016BD-0.069CD-0.64A2-0.28B2-1.10C2-0.45D2。

回归方程及方差分析结果见表4,该模型P<0.000 1,说明该模型极显著;失拟项P>0.05,不具有显著性;决定系数R2=0.967 7,表明实验模型拟合度较好。其中B、C、D、BC、A2、B2、C2、D2对酶活力具有显著影响,统计得到的模型可进行枯草芽孢杆菌产PG的预测和分析。

2.1.5 响应面各因素交互作用分析及验证

如各项因素的交互作用的三维响应面图(图4)所示,通过响应面优化顶点分析,得到模型的4个优化参数分别为葡萄糖质量浓度48.82 g/L,玉米浆质量浓度66.35 g/L,硫酸亚铁浓度9.51 mmol/L,硫酸镁浓度4.57 mmol/L时,预测酶活力可以达到5.312 U/mL。进行3次平行实验,通过实验验证,测得发酵液中PG酶活力为5.409 U/mL,与预测值接近,说明通过响应面法优化PG的培养基结果可靠,可以作为参考用于后续发酵实验。

2.2 发酵工艺优化试验

2.2.1 发酵工艺单因素试验

在5 L发酵罐研究了不同pH对产酶的影响,结果如图5-a所示,当发酵pH值控制在7时,产酶效果最好,弱酸或者弱碱环境均会使产酶效果下降,而该发酵菌株对偏碱性环境耐受性较偏酸环境更好,原因可能是枯草芽孢杆菌在生长过程中会消耗底物产生偏酸性的物质,中和了菌体周围环境,表现出一定的碱性环境耐受性。

随后探究了不同氮源补料种类对发酵产酶的影响,结果如图5-b所示,选择玉米浆和蛋白胨作为氮源补料对发酵产酶的效果更好,考虑到经济效应,选择玉米浆作为发酵氮源补料进行后续氮源补料浓度对产酶的影响研究实验,如图5-c所示,当氮源补料质量分数为20%和30%时,产酶效果较好。

有研究表明,不同发酵液营养物质浓度对菌体产物有一定的影响,葡萄糖主要应用于菌体的生长和维持菌体生命活动需要,但是过高浓度葡萄糖会影响渗透压,从而不利于菌体生长[23],实验中通过控制发酵补料速率来控制发酵液葡萄糖质量浓度,探究不同发酵液葡萄糖质量浓度情况下对酶活力的影响,如图5-d所示,当葡萄糖质量浓度保持在极低时,菌体无法获取充足的营养进而产酶效果底下;随着葡萄糖质量浓度升高,酶活力提升效果显著,在30 g/L时产酶效果最好;当葡萄糖质量浓度继续提升,产酶能力反而下降。

2.2.2 发酵工艺正交试验

选择对发酵产酶影响较大的3个因素:pH、氮源补料质量分数、发酵液葡萄糖质量浓度进行发酵正交试验,不同发酵工艺正交试验结果如表5所示,最高酶活力达到12.53 U/mL。通过极差R值判断3种因素影响程度由大到小依次为:C>A>B,即发酵液葡萄糖质量浓度控制>pH>氮源补料质量分数。根据表中k值可得最优发酵条件为A2B3C3,即pH控制7、氮源补料质量浓度30 g/L、发酵液葡萄糖质量浓度控制30 g/L。由表6主体间效应检测可知,发酵液葡萄糖浓度控制因素对最高酶活力有极显著的影响(P<0.01),pH对最高酶活力有显著影响(0.01<P<0.05),为后续发酵放大和生产提供了研究基础和优化思路。

2.3 发酵动力学研究

2.3.1 发酵验证试验

优化后的发酵工艺对酶活力提升明显,平均3组平行实验酶活力为13.72 U/mL,较基础发酵工艺提升了168.5%,选取1组实验数据作图,如图6所示,整个发酵过程菌体代谢正常,酶活力正常增长至达到预期,酶活力为14.04 U/mL,生物量OD600值为70.9,耗糖量正常增长,发酵过程中没有出现异常情况,为发酵动力学模型的构建提供稳定的保障。取发酵不同阶段的发酵液,经离心分离后进行SDS-PAGE分析,如图7所示,目的蛋白PG的分子质量为20 kDa左右,在整个发酵周期中PG的蛋白表达量呈逐步提高的趋势,发酵结束总蛋白质量浓度达到8.74 mg/mL。

2.3.2 发酵动力学模型建立与分析

将实验数据分别代入方程中,通过Origin软件进行非线性拟合,得到菌体生长动力学模型X(t)、产物生成动力学模型P(t)和底物葡萄糖消耗动力学模型S(t)(表7),模型动力学参数如表8所示,实验值及模型拟合曲线如图8所示。

一般对微生物生长使用数学模型描述时,主要运用Monod方程与Logistic方程。相较于Monod方程,Logistic方程认为菌体生长过程并不依赖物质限制,能够反映菌体浓度对自生生长的抑制,主要限制因子是菌体浓度和发酵时间,能够较好地拟合大部分菌株的生长规律[24]。选择Logistic方程进行菌体生长动力学模型拟合后得到模型X(t)(表7),方程相关系数R2=0.969,表示该模型能够较好地描述枯草芽孢杆菌的发酵菌体生长规律,为优化产PG的提供发酵策略的参考。结合图8-a发现拟合值初期与实验数据有一定偏差,推测是因为发酵前期培养基中杂质会影响OD值,导致前期误差较大,中后期更为准确。

在发酵过程中,Gaden根据菌体生长与产物合成将发酵分为三类:产物合成与菌体生长偶联型、产物合成与菌体生长部分偶联型、产物合成与菌体生长非偶联型[25]。本实验选用由Luedeking和Piret提出的Luedeking-Piret方程来探究发酵过程中产酶与菌体生长的关系,得到产物生成动力学模型P(t)(表8),拟合后方程相关系数R2=0.984,表示该模型能够较好地描述枯草芽孢杆菌的产酶过程。由表8-b所知,拟合参数α=-0.012、β=0.004,即α≠0且β≠0,可以判断枯草芽孢杆菌发酵生成PG的过程属于部分偶联型,但α为负值,推测可能是菌体生长较快,生长过程中对营养需求较大,会通过蛋白酶消耗部分产物作为营养物质消耗掉,导致发酵酶活力降低。

在枯草芽孢杆菌产PG的发酵过程中,葡萄糖的消耗主要应用于菌体的生长繁殖消耗和维持菌体基本的生命活动两方面。本实验选择运用Luedeking-Piret模型及其相似模型来模拟补料发酵时葡萄糖的消耗过程,得到底物消耗动力学模型S(t)(表7),拟合相关系数R2=0.991,表明拟合模型能够较好的描述发酵过程中耗糖量与时间的关系。结合图8-c发现发酵在对数生长期,耗糖量提升较快,发酵进入平稳期后,耗糖量上升速率稍有下降,葡萄糖作用于生成产物的得率系数YP/S=1.736×1013,即模型中1/YP/S极小,推测枯草芽孢杆菌作用于生成产物的葡萄糖较少,大部分葡萄糖都用于菌体生长和维持菌体生命活动。

3 结论

本研究通过单因素法和响应面法对枯草芽孢杆菌产PG的摇瓶培养基进行了优化,获得了最佳摇瓶发酵培养基条件为:葡萄糖质量浓度48.82 g/L、玉米浆质量浓度66.35 g/L、硫酸亚铁浓度9.51 mmol/L、硫酸镁浓度4.57 mmol/L、磷酸二氢钾质量浓度1.5 g/L、磷酸氢二钾质量浓度0.75 g/L、初始pH 7.0、培养温度28 ℃,最终发酵酶活力为5.409 U/mL。

在摇瓶培养基优化的基础上,通过在5 L发酵罐进行pH、补料氮源种类、补料氮源浓度和发酵液葡萄糖控制质量浓度单因素试验,再选择对发酵产酶影响较大的3个因素进行正交试验,得到最优发酵条件为:pH 7、氮源(玉米浆)补料质量分数30%、发酵液葡萄糖质量浓度控制30 g/L,验证最高酶活力平均为13.72 U/mL,较发酵基础工艺提升了168.5%。不同发酵阶段样品的SDS-PAGE电泳分析结果显示,PG的分子质量为20 kDa左右,在整个发酵周期中PG的蛋白表达量呈逐步提高的趋势。为提高PG的表达量,研究人员在菌株筛选、重组表达和发酵优化等方面做了大量工作,相关报道中的结果表明相对于原始水平提升比例均比较显著,但发酵酶活力一般低于10 U/mL[8-11,13],相较而言本研究的发酵水平较高,具备一定的工业化生产潜力。

选择Logistic方程和Luedeking-Piret及其相似方程进行发酵动力学模型的构建,得到了菌体生长动力学模型X(t)、产物生成动力学模型P(t)和底物葡萄糖消耗动力学模型S(t),模型R2分别为0.969、0.984、0.991,其中S(t)模型拟合程度相对最好。在实际生产发酵放大中,应用建立的动力学方程能够较好地描述预测发酵液中枯草芽孢杆菌生物量和产物表达的动态变化,同时也有助于工业生产中减少不必要的原料消耗,更对优化提升产酶量和稳定发酵工艺提供了参考。本研究通过对培养基和发酵工艺优化,使枯草芽孢杆菌发酵生成PG的酶活力明显提升,并深入进行发酵动力学的研究分析,对发酵过程控制工艺的放大和进一步改进提供了一定的理论基础。

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Optimization of protein glutaminase production by Bacillus subtilis and study on its fermentation kinetic

WU Yao1, SUN Jie2, MAO Zejing1, ZHANG Wei1, ZHANG Yan1,3, YU Huashun1*

1(The Hubei Provincial Key Laboratory of Yeast Function, Angel Yeast Co.Ltd., Yichang 443003, China)

2(College of Biological and Pharmaceutical Sciences, China Three Gorges University, Yichang 443002, China)

3(National Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Yichang 443003, China)

ABSTRACT Protein-glutaminase (EC 3.5.1.44 PG), characterized by its protein deamidation function, can be widely used as a new type of food industrial enzyme preparation for modifying plant proteins.Improving the fermentation expression level of PG can provide references for its industrial production.Using a constructed Bacillus subtilis strain producing PG as the material, shake flask medium composition was optimized and screened through single-factor and response surface experiments.At the 5 L bioreactor scale, fermentation process optimization was conducted via single-factor and orthogonal experiments.Optimal fermentation medium composition and control parameters were determined, and a fermentation kinetic model was further established.Results showed that after medium optimization, the maximum enzyme activity in shake flasks reached 5.409 U/mL.Following fermentation process optimization in the 5 L bioreactor, the enzyme activity increased to 13.72 U/mL, representing a 168.5% improvement over the basal fermentation level.The results of SDS-PAGE revealed that the molecular weight of PG was approximately 20 kDa.Based on the established fermentation kinetics model, it can be concluded that the process of producing protein glutaminase through Bacillus subtilis fermentation belongs to the partially coupled type.

Key words Bacillus subtilis; protein-glutaminase; medium optimization; fermentation process optimization; fermentation kinetic

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044303

引用格式：吴尧,孙杰,毛泽敬,等.枯草芽孢杆菌产蛋白质谷氨酰胺酶培养优化及发酵动力学研究[J].食品与发酵工业,2026,52(12):43-51.WU Yao,SUN Jie,MAO Zejing, et al.Optimization of protein glutaminase production by Bacillus subtilis and study on its fermentation kinetic[J].Food and Fermentation Industries,2026,52(12):43-51.

第一作者：硕士,中级工程师(余华顺高级工程师为通信作者,E-mail:yuhs@angelyeast.com)

基金项目：湖北省自然科学基金项目(2024AFD182)

收稿日期：2025-08-22,改回日期:2025-11-01