柑橘(Citrus reticulata Blanco)是芸香科(Rutaceae)柑橘亚科(Aurantioideac)柑橘属(Citrus)柑橘亚族(Citrinae)果树,是橘、柑、橙、金柑,柚、枳等的总称。柑橘味道酸甜可口,富含维生素C、多酚、类黄酮、类柠檬苦素、辛弗林等活性成分[1]。柑橘面积和产量均居全球第一,2024年我国柑橘种植面积超过2.73×106 ha,产量超过5 000万t[2],已成为重要的优势经济农产品之一。柑橘成熟期集中、产量大,约90%以上用于鲜销。但由于其上市时间密集且贮藏期短,采后阶段易造成大规模的腐烂和霉变。为降低经济损失并预防食品安全风险,亟需建立有效的采后保鲜技术体系。当前柑橘采后防治措施主要以物理防治、化学防治和生物防治为主。本文系统梳理柑橘采后致腐微生物及各类保鲜技术的最新研究进展,阐明其作用机理,以期为构建安全高效的柑橘采后保鲜技术体系提供理论依据。
1 柑橘果实采后常见病害
柑橘水果采后容易受到多种病原体的侵害,常见的柑橘采后腐烂的病害有20多种,如青霉病、绿霉病、黑霉病、炭疽病、蒂腐病和酸腐病等。常见柑橘侵染性病害(图1)主要是由指状青霉(Penicillium digitatum)引起的绿霉病、意大利青霉(Penicillium italicum)引起的青霉病和白地霉(Geotrichum candidum)引起的酸腐病,导致的采后腐烂率超过40%,严重制约柑橘产业发展[3]。
A-指状青霉;B-意大利青霉;C-白地霉;D-柑橘绿霉病;E-柑橘青霉病;F-柑橘酸腐病
图1 病原菌(指状青霉,意大利青霉和白地霉)及其侵染柑橘发病图
Fig.1 Pathogenic fungi (Penicillium digitatum, Penicillium italicum, andGeotrichum candidum) and diagrams of citrus diseases caused by their infection
指状青霉在柑橘果实表面初始阶段形成白色丝绒状菌落,随后渐变为黄绿色,最终发展为橄榄灰色[4](图1-A)。其分生孢子繁殖能力强,可通过空气流动、接触传播等途径侵染果实伤口,引发典型的绿霉病症状。该病征以蓝绿色粉状霉斑为标志,伴随白色宽带状菌丝扩展,导致果实组织快速液化腐烂(图1-D)。
与指状青霉相比,在低温贮藏和运输期间意大利青霉更易发病,并且可侵染完整的柑橘果实。意大利青霉在果实表面初始形成白色粉状菌丝体,随后变为典型的青色霉层(图1-B)。其分生孢子具有耐低温特性,可通过空气传播等机制侵染果实机械损伤部位,导致青霉病发生[5]。青霉病病征以蓝色粉状霉斑为特征,伴随狭窄的白色菌丝边缘,腐烂进程相对缓慢,但会产生明显的霉变气味(图1-E)。
白地霉广泛分布于蔬果及土壤中,其繁殖方式以裂殖为主,少数菌株可产生芽生孢子[6]。该菌在自然界中的菌落颜色呈白色至奶油色,部分菌株为浅褐色或深褐色,菌落质地由油脂状至皮膜状(图1-C)。其分生孢子具有较强的繁殖能力,可通过空气流动等媒介侵染果实损伤部位,导致酸腐病的发生。酸腐病典型症状表现为:柑橘果皮出现黄褐色圆形病斑,表面形成稀薄的白霜状霉层,病果极度软腐并伴有酸腐气味(图1-F)。酸腐病是柑橘贮藏后期高发性病害,且传统注册农药抑霉唑与噻苯唑对白地霉的抑制效果不佳。
在柑橘采后贮藏保鲜中,可通过应用物理保鲜(低温贮藏、气调保鲜)、化学防治(保鲜剂处理)和生物防控等手段,通过调控生理代谢、抑制病原菌活动等多重机制,有效延缓柑橘果实品质劣变和衰老进程,进而显著延长货架期。
2 柑橘保鲜措施研究进展
2.1 物理防治方法
物理防治主要是利用热介质、气体成分、紫外光或γ-射线等物理因素处理柑橘,抑制或杀死柑橘表面微生物,降低柑橘呼吸强度,从而减少柑橘采后病害的发生,使柑橘品质及风味得以保持。主要分为热处理、臭氧处理、辐照处理、气调处理等方式(表1)。
表1 柑橘不同保鲜方法及优缺点
Table 1 Different preservation methods for citrus and their advantages and disadvantages
保鲜方法类别种类优点缺点物理方法热处理热空气,热水经济、高效、便捷、无药剂残留处理周期较长臭氧处理O3绿色环保、强效杀菌与广谱性、成本低且操作简便浓度控制要求高,设备成本较高辐射处理短波紫外线,γ射线无污染、无化学残留辐照水果安全性问题气调保鲜高CO2低O2环保安全,保证品质成本高、应用受限化学方法化学杀菌剂抑霉唑,咪鲜胺和百可得等高效,成本低,工艺成熟抗性菌株的产生,健康风险和环境问题天然保鲜剂精油无毒高效、来源广泛提取成本高,可能影响风味盐离子保鲜脱氢乙酸钠,碳酸氢钠等强效抑菌与广谱性,环保与安全性浓度敏感,易引发果伤涂膜蜡类,蛋白多糖类成膜性好,部分可降解,良好生物相容性材料稳定性与成本问题,工艺要求高与标准化不足生物方法拮抗微生物细菌,真菌,酵母来源广泛,生长周期短,易培养,安全性好效果不稳定,受环境因素影响大代谢产物抗菌肽,挥发性有机物多种抑菌机制提取分离成本高
2.1.1 热处理
热处理是通过热传导介质(如热空气、热水)对柑橘进行物理干预的保鲜技术。其作用机制包括:杀灭表面微生物并抑制其增殖,调控果实呼吸代谢强度,降低乙烯生物合成速率,激活抗病相关酶系统活性,从而延长贮藏周期。根据介质类型主要分为热空气处理和热水处理两类。
热空气处理技术是最早商业化应用的技术之一,如今已被广泛应用于柑橘采后保鲜领域。陈瑶[7]采用37 ℃热空气处理柑橘36 h,结果发现热空气处理显著降低了柑橘的失重率与腐烂率;进一步研究表明,热空气处理可提高相关防御酶的活性,对果实品质无损伤,在延长柑橘贮藏期的同时维持了良好的感官品质。然而,热空气处理技术局限性在于其热力学传质系数相对较低,导致处理周期较长。
热水处理法利用热水作为介质,通过喷淋或浸渍方式杀灭柑橘表面微生物,同时诱导柑橘合成热激蛋白,从而提高柑橘的防腐能力。QUEB-GONZ
LEZ等[8]采用50 ℃热水处理柑橘果实2.5 min,冷却后贮藏13 d。结果发现虽然柑橘果实指状青霉的感染率显著降低,但果实维生素C含量损失率达50%。PENG等[9]最新研究表明,采用50 ℃热水处理2.5 min的方法,可通过组蛋白甲基化机制调控基因表达,从而有效增强柑橘对青霉病的抗性。
现有研究主要聚焦于确定热处理的最佳温度-时间参数组合,但多局限于单一或部分品质指标的优化。为推进热处理技术的产业化应用,未来需构建能够预测柑橘采后保鲜过程中多组分动态变化的数学模型,通过量化热效应与生理代谢的耦合关系,实现采后柑橘果实品质的精准调控。通过模型驱动的精准调控策略与工程技术和经济效益的结合,推进柑橘热处理技术从实验室向产业化转化。
2.1.2 臭氧处理
臭氧因其强氧化性和广谱杀菌特性,在柑橘采后保鲜领域展现出显著应用潜力。研究表明,其在较低浓度下可抑制指状青霉孢子萌发,高浓度可迅速杀灭指状青霉菌丝。臭氧抑菌及杀菌的主要机制为通过破坏细胞膜结构,改变膜的通透性,导致细胞内容物外渗,并且臭氧分子可迅速扩散进入细胞,直接氧化破坏DNA/RNA及蛋白质等生物大分子结构而致使致腐菌失活[10],臭氧还可以抑制乙烯、乙醇等气体的产生,进而抑制果蔬的后熟作用。乐梨庆等[11]研究了不同臭氧处理时间对其采后贮藏保鲜效果的影响,发现以固定质量浓度(2 g/h,54 L)处理柑橘10 min,可较好地维持柑橘可溶性固形物含量,延缓维生素C含量的下降,并显著抑制多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性。牛锐[12]采用57 mg/m3的臭氧处理柑橘果实5 min,发现柑橘可溶性固形物、有机酸、维生素C的含量下降速率显著减缓,丙二醛(malondialdehyde,MDA)积累速率降低,呼吸作用受抑制,从而延缓果实的衰老。
臭氧处理对柑橘品质无害,且该技术易于被消费者接受,被视为是一种绿色、安全的柑橘采后保鲜措施。然而,臭氧的强氧化性可能腐蚀保鲜库内的金属设备、电器元件及管道接口,同时要求操作环境具有良好的密封性与人员防护措施,以避免气体泄漏危害健康。在实际应用中需结合智能调控系统并严格执行操作规范,以充分发挥臭氧的保鲜潜力并降低潜在风险。
2.1.3 辐射处理
辐照保鲜技术是一种利用电离辐射[如紫外线(ultraviolet,UV)、电子束、X射线、γ射线]对柑橘进行辐照处理的技术,通过抑制柑橘采后病原菌的生长繁殖并延缓果实衰老进程,从而达到延长柑橘贮藏期的目的。该技术具有安全高效、操作简便、无化学残留等优点,因此可有效保持柑橘的营养成分和感官特性。
短波紫外线(ultraviolet-C radiation,UV-C,波长<280 nm)能量高、穿透能力强,但只能作用于果实的表面组织,通过破坏果皮上附着微生物的遗传物质,从而抑制侵染性病害的发生。UV-C处理柑橘时,其杀菌效能与辐照类型、强度、柑橘采收期、成熟度、果皮感染程度及贮藏温度相关。GÜNDÜZ等[13]使用3.17 kJ/m2的剂量UV-C处理柑橘后,发现接种于柑橘上的指状青霉和意大利青霉的孢子数量显著减少,进而降低腐烂率。
γ射线辐照是电离辐射中能量最高的类型,具有穿透力强、辐照剂量易调节等特点。刘红等[14]研究结果表明,γ-射线辐照可有效抑制指状青霉生长,影响细胞膜透过性,进一步扰乱其正常的生理代谢。罗梦等[15]发现,采用0.50 kGy的γ-射线辐照椪柑,可有效降低贮藏过程中果实的失重率,抑制呼吸强度及丙二醛积累,延缓可溶性固形物、可滴定酸和抗坏血酸含量的下降,维持椪柑果实细胞内过氧化物酶(peroxidase,POD)的活性。
为推动辐照技术在柑橘保鲜中的规模化应用,需一方面加强公众科普宣传以消除对辐照水果的安全性质疑,另一方面在保障果实品质的基础上,优化最佳辐照剂量及工艺参数。
2.1.4 气调保鲜
气调贮藏通过调节贮藏环境中的气体组分(O2、CO2),抑制果实呼吸代谢和抑制果实呼吸代谢生长,同时抑制低氧和高二氧化碳敏感性微生物的生长繁殖,从而实现延长贮藏期和维持果实品质。范雨航等[16]在不同气调环境下贮藏柠檬果实,结果表明5%～7% O2与6%～9% CO2组合能保持果实较高的总酚和维生素C含量。气调贮藏技术对气体成分、包装材料、贮藏温湿度及设备类型等条件要求严格,因此导致其成本高昂、应用受限。
目前,气调贮藏技术已在大宗果品(如苹果、鸭梨和库尔勒香梨)采后贮藏中实现规模化应用。然而,由于柑橘类果实属于非跃变型果实,对低氧和高二氧化碳的耐受性差。因此气调贮藏在柑橘保鲜中的应用仍相对有限。
物理保鲜技术是柑橘采后绿色防控体系的重要组成部分,主要包括热处理(热空气、热水)、辐照(紫外线、γ射线)及气调贮藏等方法。该类技术通过直接抑制病原菌生长、诱导果实抗性及延缓衰老等机制延长保鲜期,具有环境友好、无化学残留的显著优势。然而,其应用仍面临热传递不均、处理能耗高、对柑橘病原菌效果有限等技术瓶颈。当前研究重点集中于优化物理参数(如温度-时间阈值、辐照剂量与气体比例)、开发与天然抑菌剂或生物防治的协同处理工艺,以提升抑菌效能与处理均匀性。未来产业化需突破节能高效物理处理装备的设计与制造,集成智能温控与实时品质监测系统,并构建基于动力学模型的处理效应预测平台,从而实现物理保鲜技术在柑橘采后处理中的规模化、标准化应用。
2.2 化学防治方法
化学保鲜剂通过涂抹、喷施或环境释放化学药剂,抑制/杀灭果蔬表面及环境中的微生物,从而防止采后病害发生,在果蔬采后贮藏保鲜中应用广泛。常见的化学保鲜方式有化学杀菌剂处理、天然保鲜剂应用、盐离子保鲜和涂膜保鲜等(表1)。
2.2.1 化学杀菌剂
化学杀菌剂是控制果蔬采后侵染性病害的主要防治方法,可有效抑制柑橘霉菌生长。其作用机制主要是通过抑制或杀灭表面微生物,延长保鲜期。我国柑橘致腐菌防治中已登记的可用杀菌剂分三类:第一类为苯并咪唑类;第二类为甾醇脱甲基抑制剂,包括抑霉唑和咪鲜胺;第三类为双胍盐类,其中百可得(双胍三辛烷基苯磺酸盐)是农业农村部推荐的柑橘采后杀菌剂。郑文艳等[17]的研究表明,75%抑霉唑硫酸盐可有效抑制柑橘腐烂,其效果优于百可得等其他保鲜剂,对青霉病和绿霉病表现出良好的抑制效果。化学保鲜剂具有高效、成本低廉及使用便捷等优势,适宜用量可降低果实贮藏期间腐烂的发生率,是当前防控采后侵染性病害的主要防治措施。然而,化学杀菌剂的广泛使用会导致抗性菌株的产生,降低其杀菌效率;同时,消费者对喷洒化学药剂的果蔬可能引发健康风险和环境问题的担忧,也限制了其应用推广。
当前研究多聚焦于化学杀菌剂对柑橘采后病害的防控效果,然而对其在果实中的分布规律、残留动态及环境生态毒性等方面的研究较为匮乏。因此,未来应致力于开发高效低毒化学杀菌剂,并系统评估其应用安全性。产业化推进需注重剂型优化与施用规范制定,以实现防腐效果与食品安全、环境相容性的统一。
2.2.2 天然保鲜剂
天然保鲜剂因抗菌性、安全性及广谱作用,已成为化学保鲜剂的理想替代品。天然酚类物质多存在于松树、胡麻、紫苏等植物中,其绝大多数含有苯环和羟基结构,表现出较强的抗氧化与抗菌性能。植物精油主要通过萃取植物中的萜类、芳香族、脂肪族及含氮、含硫化合物获得。潘小军等[18]评估了13种植物精油对指状青霉和意大利青霉的抑制作用,结果发现牛至、丁香和桂皮精油对柑橘的保鲜效果显著,可减少柑果实腐烂面积。CHEN等[19]研究发现,丁香精油处理能诱导柑橘防御反应,抑制丙二醛积累,同时提升防御相关酶活性并上调基因表达水平。YUAN等[20]研究发现反式-2-己烯醛可通过破坏线粒体超微结构、干扰能量代谢过程、特异性下调核糖体结构蛋白基因表达,最终抑制蛋白质合成,从而达到抑制指状青霉抑霉唑抗性菌株生长的效果。植物精油挥发性成分易受外界条件影响而加速挥发扩散,降低保鲜效果;其亲脂疏水特性及芳香气味易掩盖果蔬本味,导致消费者接受度低且影响柑橘感官品质。因此,兼具增溶和控释功能的精油递送体系构建成为研究热点。
天然提取物具有无毒、高效、来源广泛等特性,但为达到与化学保鲜剂相当的效果,天然保鲜剂常需高浓度使用,导致成本增加并可能对柑橘品质产生不利影响。因此,合理确定使用浓度至关重要。所有新型天然保鲜剂均需通过严格的安全性测试(包括急性毒性、慢性毒性、遗传毒性和过敏反应等),以确保长期使用的安全性。单一天然提取物的保鲜效果有限,高浓度使用会降低柑橘品质,而与其他保鲜剂联合使用可显著提升效果。目前大多数天然保鲜剂的研究仍局限于实验室阶段,其商业化应用仍面临提取成本高、稳定性差、规模化生产工艺不成熟以及法规认可度有限等多重制约。基于此,未来开发应注重挖掘新型天然来源活性成分,并深入探索天然保鲜剂与物理处理、化学助剂或其他生物防治手段的协同增效机制,以推动天然杀菌剂在柑橘采后商业体系中的应用。
2.2.3 盐离子保鲜
盐类是被通常认为安全(generally recognized as safe,GRAS)的物质。因其低成本和高水溶性,在商业应用中展现出显著优势。盐类物质不仅在体外表现出强的抗真菌活性,在体内也能抑制果蔬采后病害发生。同时可维持果蔬色泽、硬度、可溶性固形物等品质,部分盐类可通过提升多酚氧化酶等酶活性,增强果蔬的抗病能力。MONTESINOS-HERRERO等[21]采用5种食品添加剂(脱氢乙酸、二碳酸二甲酯、乙二胺四乙酸、乙酸钠和苯甲酸钠),评估其对人工接种意大利青霉及指状青霉所致柑橘霉变的抑制效果,结果表明苯甲酸钠表现出最优的抑菌活性。TANG等[22]研究发现,脱氢乙酸钠处理酸腐病菌菌丝30 min后,可使细胞内ATP含量降低,ADP和AMP含量上升,同时Na/K-ATP酶活性显著增加。脱氢乙酸钠通过干扰能量代谢抑制白地霉的生长。盐离子通过多途径实现抑菌:调节培养基pH值改变生长环境,破坏细胞壁完整性,改变细胞膜通透性,干扰能量代谢及抑制蛋白质合成。
在柑橘保鲜产业化应用方面,盐离子处理技术展现出成本低廉、操作简便、安全性高等优势,但仍需进一步探索标准化工艺参数和长效复配配方,以推动其在大规模采后处理中的应用。
2.2.4 涂膜
涂膜技术通过在果实表面涂布可形成高分子保护膜的保鲜剂,形成致密保护层,从而实现保鲜效果,其作用机制包括:隔离微生物与氧气、减少水分散失、抑制气体交换,同时膜中化学物质可发挥抑菌作用。
传统涂膜剂主要是以石蜡、氧化聚乙烯蜡等工业原料制成,尽管提升表面亮度等方面效果明显,但使用不当易引发褐变及异味积累,显著降低果实内在品质。当前常用涂膜保鲜材料以多糖类、蛋白类和脂类等生物源原料制成的可食性涂膜剂为主[23]。不仅能保持果蔬原有外观与新鲜度,还可提升光泽度,在食品保鲜中广泛应用。ALSHALLASH等[24]采用浓度为0.8%的纳米壳聚糖处理瓦伦西亚橙,显著降低果实重量损失和腐烂率,同时有效维持果实硬度及维生素C含量。欧阳小艳等[25]用玉米醇溶蛋白开展柑橘涂膜实验,发现该蛋白膜可减缓柑橘营养消耗,从而实现保鲜效果。叶青青等[26]采用聚赖氨酸与壳聚糖复合溶液对柑橘涂膜处理,发现复合涂膜能有效减缓柑橘果实糖分和维生素C的损失,从而降低腐烂率。
涂膜技术广泛应用于柑橘、苹果等水果的保鲜领域,其产业化推进需聚焦于开发低成本、高性能的天然可食性膜材(如多糖、蛋白基复合材料),并优化成膜工艺与配套设备。
2.3 生物防治方法
生物防治主要通过利用微生物拮抗菌及其代谢产物等手段,干扰病原微生物的正常生命代谢,从而抑制或杀灭柑橘致腐微生物。该方法具有安全无害、稳定性佳、不易引发耐药性、专一性高等优势(表1)。
2.3.1 利用拮抗微生物
拮抗微生物通过抑制柑橘采后病原微生物在表面的定殖与生长,具有天然、生态友好、安全高效等特性,已成为开发生物保鲜技术的研究热点。基于拮抗微生物的生物防治技术,不仅能有效抑制柑橘致腐菌活性,还可降低采后腐烂率。
拮抗菌主要包括细菌、真菌和放线菌等,来源广泛。凌晓宁等[27]从海底淤泥中筛选到一株对指状青霉有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),其无菌发酵滤液对指状青霉的抑菌圈直径达(21.88±0.19) mm。CHEN等[28]发现毕赤酵母(Pichia galeiformis BAF03)对指状青霉具有较强的抑制能力。HU等[29]分离到海洋链霉菌(Streptomyces chumphonensis AM-4),实验显示其发酵液对指状青霉和意大利青霉的菌丝生长抑制率分别达66.23%和61.42%。一些生物公司已开发商业化生物防治制剂用于柑橘采后病害防控,例如美国Bio-Save®(Pseudomonas syringae)[30]、Aspire®(Candida oleophila)[31],荷兰ShemerTM(Metschnikowia fructicola)[32],以及西班牙Pantovital®(Pantoea agglomeran)[32]等。
尽管拮抗菌在柑橘采后病害防控中展现出潜力,然而单独使用时,拮抗菌的抑制效果相对有限,且其活性易受环境因素影响。因此,未来研究将聚焦于拮抗保鲜菌与化学物质或物理方法的协同应用,并利用合成生物学策略定向改良菌株的环境适应性与抗菌物质合成能力。产业化应用需突破大规模发酵、制剂稳定性及成本控制等关键技术瓶颈。
2.3.2 利用微生物代谢产物
微生物在生长过程中产生的部分次级代谢产物可以抑制柑橘采后病原微生物的生长,包括抗菌肽或挥发性有机化合物等抑菌活性物质。抗菌肽是由生物体合成的小分子量肽,通过基因编码经核糖体或非核糖体途径生成,属于进化上高度保守的天然免疫因子。其具有水溶性好、两亲性强且不易引发耐药性等特点,并具备广谱抗菌、抗病毒及抗肿瘤等生物学活性[33]。YANG等[34]从草酸青霉次级代谢产物中分离得到新型线性五肽——三峡肽素,其对指状青霉表现出显著抑制活性。TUNSAGOOL等[35]从枯草芽孢杆菌ABS-S14中分离得到环脂肽(iturin A, fengycin, surfactin),可通过调控柑橘防御反应相关基因的表达,进而增强柑橘对病原菌的抗性。ZHANG等[36]团队从螳螂、蚂蚁等昆虫中分离得到3种抗真菌肽:Masatopara-S、thanatin和ponericin W1。研究表明,这些肽通过破坏细胞膜完整性、改变菌丝形态,以及结合并破坏病原菌DNA双螺旋结构的作用机制,有效抑制白地霉生长。然而,新型抗菌肽的发现及其在保鲜领域的实际应用仍面临亟待解决的问题:首先是如何在自然界这个庞大资源库中发现并筛选出高效抗菌肽;其次,即使从植物或动物中发现了目标抗菌肽,其提取分离工艺也往往复杂繁琐,难以实现规模化生产。
未来研究可致力于通过基因工程构建高效异源表达系统,以实现抗菌肽的规模化生产。结合CRISPR/Cas9基因编辑技术,可对生产菌株进行定向遗传改造,增强其表达性能。进一步借助合成生物学策略,如设计合成基因线路、优化调控元件及适配宿主,能够实现对抗菌肽表达水平与活性的精细调控,显著提高产量与稳定性,为其在采后保鲜中的商业化应用提供支撑。
挥发性有机化合物(volatile organic compounds,VOCs)是微生物代谢产生的复杂的混合物,介导微生物间的种间及种内相互作用,并展现出显著的生物防治活性。微生物产生的挥发性有机物有多个类别,包括烃类、醇类、醛类、酮类、酯类、内酯类、杂环化合物、酚类、硫化合物等。这些化合物通过挥发扩散到环境中,发挥抗菌作用,是微生物间相互作用及生物防治机制的重要组成部分。从贝莱斯芽孢杆菌BV07中鉴定出24种挥发性有机化合物,其中以酮类化合物(如2-庚酮、2-十三烷酮、2-十一烷酮)为主,对柑橘指状青霉表现出较强的抑制效果[37]。通过气相色谱-质谱联用技术,在Kurtzmaniella quercitrusa BS-AY-S1中鉴定出20种挥发性有机化合物。这些化合物显著抑制了指状青霉孢子萌发、产孢及菌丝生长,有效减缓了柑橘果实绿霉病的发展进程[38]。WANG等[39]研究发现Burkholderia sp.NAU16的挥发性有机化合物中,二甲基三硫化物的抑菌活性最强,最低抑菌浓度仅为0.103 mL/L。
挥发性有机化合物具有环境友好、不易产生抗药性且可诱导果实抗性等优点,因此在柑橘采后保鲜中可作为合成农药的潜在替代方案。未来产业化需突破其规模化量产、稳定性保持(纳米封装等技术)及施用标准化等关键技术瓶颈,推动其在采后柑橘保鲜中的规模应用。
3 采后柑橘保鲜剂的作用机制
深入理解柑橘保鲜剂的作用机制是实施有效病害防控的关键,为新型抗真菌药物开发提供理论支撑。根据作用位点的不同,主要集中在研究对致病菌的细胞壁、细胞膜、遗传物质、能量代谢系统、活性氧代谢系统和其他靶点的影响(图2)。
A-保鲜剂作用于柑橘致腐菌的机制,包括细胞壁,细胞膜,线粒体和遗传物质等;B-诱导抗性;C-生物防控作用机制
图2 柑橘保鲜剂的作用机制图。
Fig.2 Diagram of the mechanism of action of citrus preservatives
3.1 作用于细胞壁
真菌细胞壁是病原真菌抵御外界环境变化的最外层屏障,主要由几丁质、葡聚糖、甘露聚糖、糖蛋白及脂质等成分构成。部分抗菌剂可直接靶向细胞壁多糖,通过结合几丁质破坏其完整性与刚性,使病原真菌丧失保护屏障并最终死亡。碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)通常位于细胞壁和质膜之间的周质空间,其活性变化可作为评估细胞壁完整性的关键指标。研究者常综合运用AKP活性检测、荧光染色(荧光钙白Calcofluor White)、电镜观察及细胞壁组分含量测定等技术,系统解析针对细胞壁的作用机制。
植物精油的烯萜类物质可直接抑制几丁质的合成,影响真菌细胞壁的正常合成,导致细胞的死亡[40]。部分抗菌肽通过破坏致病菌细胞壁完整性发挥抑制作用。MOURA等[41]研究发现killer toxin通过抑制几丁质酶活性干扰细胞壁几丁质合成,导致真菌死亡。抗菌肽C12O3TR影响细胞膜与细胞壁的合成途径,抑制指状青霉生长[42-43]。从间座壳属菌株Diaporthe sp.HT-799次级代谢产物中分离得到一种新型二倍半萜内酯类化合物sesterdiaporate,通过抑制细胞壁糖基磷脂酰肌醇的生物合成,进而影响意大利青霉的生长[44]。
3.2 作用于细胞膜
真菌细胞的正常增殖与代谢活动依赖于细胞膜这一关键结构,其膜系统主要由磷脂、鞘脂、固醇及膜蛋白等生物分子构成[45],是许多抑菌药物的作用靶点。目前大部分研究通过定量检测细胞裂解率、细胞内容物泄漏(可溶性蛋白、核酸,脂质和糖类等大分子)以及胞外电导率的变化,综合运用荧光探针标记(碘化丙啶、SYBR Green等核酸荧光染料等)、电镜观察等技术,解析其对细胞膜的影响机制。
抗菌肽对细胞膜的破坏能力主要取决于两亲性α-螺旋结构及阳离子特性。阳离子肽段通过静电作用吸附于带负电的磷脂双分子层,随后插入并嵌入膜内,破坏原有结构的磷脂双分子层与膜蛋白,导致膜离子通道通透性升高及细胞膜完整性丧失,最终引发细胞内容物泄漏和致腐菌死亡。李心丹等[46]发现抗菌肽Jelleine-I、O3TR均可抑制指状青霉的生长,其作用机制为通过增加细胞膜通透性,引起胞外电导率及胞内核酸物质泄漏量的增加,最终导致指状青霉死亡。
植物精油通过疏水作用促进细胞膜脂质相分离,改变膜极性状态;同时通过膜脂过氧化(MDA积累)破坏膜结构完整性与物质运输功能,并干扰致腐菌外膜蛋白及磷脂分子功能,最终导致细胞裂解死亡[47]。孙畅等研究发现,山苍子精油通过损伤细胞膜的机制抑制意大利青霉生长[48]。紫苏醛可通过诱导活性氧积累和引发脂质过氧化,破坏指状青霉细胞膜的通透性及完整性[49]。
百可得主要作用于病原菌细胞膜的类酯化合物的合成,导致脂溶性物质运输受阻和水溶性物质运输加剧,最终破坏细胞膜的选择透过性[50]。部分化学杀菌剂(如抑霉唑、咪鲜胺)通过抑制病原真菌的14α-去甲基化酶活性,影响真菌细胞膜成分麦角甾醇的生物合成,损伤细胞膜的通透性,进而导致柑橘致腐菌的死亡[51]。随着甾醇脱甲基抑制剂杀菌剂的广泛应用,指状青霉等病原菌对其的抗性问题日益严重,发现和挖掘新的杀菌剂靶标,创制绿色高效低毒杀菌剂,可望为柑橘采后病害的绿色防控建立新策略。
3.3 作用于能量代谢系统
能量代谢的主要场所是线粒体,一些保鲜剂通过抑制致病菌呼吸代谢关键酶(如琥珀酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶)的活性,导致致病菌死亡;或通过降低柑橘能量代谢酶活性,影响其呼吸强度,从而减缓果实衰老进程,最终达到柑橘保鲜的效果。研究者采用电镜观察线粒体超微结构,结合荧光染色(线粒体膜电位探针)与能量代谢指标(ATP、ADP、AMP等)的变化,系统探讨作用于线粒体的具体机制。张美红等[52]研究发现,松针活性成分β-蒎烯通过抑制意大利青霉呼吸作用,并影响三羧酸循环及糖酵解途径,导致病原菌能量代谢异常,最终引发细胞死亡。郑嘉鹏等[53]与彭旋等[54]研究发现,白薇提取液通过破坏意大利青霉菌丝体细胞膜结构及降低能量代谢酶活性等机制,有效减少脐橙果实腐烂。
当线粒体电子传递链被攻击导致其破坏,或质子电动势过高时,活性氧(reactive oxygen species,ROS)会大量产生,打破线粒体的氧化还原平衡,线粒体膜蛋白和膜脂发生氧化损伤,造成线粒体功能进一步受损,最终导致结构破坏、膜电位下降及通透性转换孔开放,最终导致细胞凋亡和坏死。抗菌肽PepGAT和PepKAA通过激活线粒体内氧化还原环境失衡,导致ROS过度累积,诱导细胞凋亡,从而抑制指状青霉生长。抗真菌肽AfpB诱导指状青霉ROS积累并传递信号,降低线粒体膜电位、破坏呼吸电子传递链,最终通过积累的ROS,引发脂质过氧化并诱导细胞死亡[55]。
3.4 诱导抗性
诱导抗性通过物理(如温度)、生物(如拮抗微生物)或化学诱导因子(如化学物质)激活植物防御反应,可增加相关防御基因的表达和积累抗性物质(类黄酮和多酚类)以应对病原菌侵袭。其中,抗性蛋白积累的增加是宿主植物自我保护免受病原体侵害的典型特征之一。当植物通过信号转导识别病原体时,部分抗菌肽可诱导防御反应并激活诱导抗性[56]。Bacillus subtilis ABS-S14分泌的环脂肽可诱导抗性蛋白积累和引发柑橘果实抗性反应,从而有效抑制病原菌[57]。ε-poly-l-lysine可上调脂肪酸代谢相关基因表达,降低油酸水平,提高亚麻酸和亚油酸含量,同时促进C9醛生物合成,显著延缓柑橘青霉病的发生[58]。三峡肽素通过激活苯丙烷途径,同时显著激活果实中CAT、POD和SOD活性,降低H2O2与丙二醛水平,从而减少膜脂过氧化,增强对指状青霉的抗性[33]。
也有报道部分精油可诱导抗性。肉桂醛能显著提高苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)、过氧化物酶、多酚氧化酶、β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,GLU)和几丁质酶(chitinase,CHT)的活性,同时促进总酚、黄酮(含二氢黄酮醇与黄酮醇)及木质素的积累[59]。反式-2-己烯醛可显著激活苯丙烷生物合成途径关键基因的表达,促进采后柑橘果皮中木质素和黄酮的合成,并提升抗氧化能力,进而增强对指状青霉的抗性[20]。
研究发现,多种细菌(如枯草芽孢杆菌[60]、贝莱斯芽孢杆菌[37])、丝状真菌(草酸青霉[34]等)和酵母(解脂耶氏酵母[61]、Pichia membranifaciens菌[28]、隐球菌[62]、酿酒酵母菌[63]、Metschnikowia spp.[64]等)可用于柑橘采后疾病的防控,主要通过诱导柑橘的防御酶活性、积累黄酮类化合物和总酚类化合物,提高柑橘对青绿霉病的抗性(表2)。
表2 部分拮抗微生物抑制采后柑橘病原菌及其作用机制
Table 2 Inhibition of postharvest citrus pathogenic fungi by partial antagonistic microorganisms and their mechanisms of action
生物防控组别种类致腐菌机制参考文献细菌Bacillus velezensis HY19指状青霉,意大利青霉挥发性有机物;诱导抗性[65]Bacillus velezensis S161指状青霉微生物代谢产物(抗菌肽);挥发性有机物[66]Bacillus velezensis BV07指状青霉微生物代谢产物(抗菌肽);挥发性有机物;诱导抗性[37]Bacillus sp.B15指状青霉微生物代谢产物(抗菌肽)[67]Bacillus sp.W176指状青霉微生物代谢产物(抗菌肽)[68]Bacillus subtilis ABS-S14指状青霉微生物代谢产物(抗菌肽);诱导抗性[57]Bacillus subtilis L1-21指状青霉微生物代谢产物(抗菌肽);挥发性有机物;[69]Bacillus sp.WE-3白地霉推测细胞壁[70]Bacillus amyloliquefaciens HY2-1指状青霉细胞膜;ROS;微生物代谢产物(抗菌肽;诱导抗性[71]Lactiplantibacillus paraplantarumCRL 1905指状青霉,意大利青霉微生物代谢产物[72]Lactobacillus sucicola JT03,Weissella paramesenteroides JT13,Pediococcus acidilactici JY03指状青霉微生物代谢产物(抗菌肽)[73]Pseudomonas fluorescens指状青霉诱导抗性[74]Pseudomonas fluorescens ZX意大利青霉挥发性有机物;微生物代谢产物(有机酸)[75]Pantoea agglomerans CPA-2指状青霉营养物质和空间竞争;诱导抗性[76]
续表2
生物防控组别种类致腐菌机制参考文献真菌Metschnikowia pulcherrima指状青霉,白地霉,意大利青霉挥发性有机物;产生活性氧;诱导抗性[77]Metschnikowia citriensis FL01白地霉铁消耗;诱导抗性[78-79]Ceriporia lacerate HG2011意大利青霉挥发性有机物[80]Pichia kudriavzevii指状青霉生物膜的形成,营养竞争;挥发性有机物[81]Aureobasidium pullulans白地霉生物膜的形成[82]Kurtzmaniella quercitrusa BS-AY-S1指状青霉挥发性有机物[38]Yarrowia Lipolytica ATCC 20460指状青霉,意大利青霉营养物质和空间竞争;诱导抗性[83]Pichia galeiformis (BAF03)指状青霉营养物质和空间竞争;挥发性有机物[28]Metschnikowia fructicola (277)Candida oleophila (182)—产生活性氧;诱导抗性[84]Kloeckera apiculate strain 34-9意大利青霉生物膜的形成[85]Aureobasidium pullulans GE17 and Meyerozyma guilliermondii KL3指状青霉营养物质和空间竞争;挥发性有机物[83]Pichia guilliermondii Z1意大利青霉营养物质和空间竞争[86]Kloeckera apiculata 34-9—诱导抗性[87]Metschnikowia citriensis FL01T and FL02,Candida oleophila FL14 andPseudozyma antarctica FL17指状青霉,意大利青霉生物膜的形成;铁消耗;诱导抗性[88]Pichia membranaefaciens指状青霉,意大利青霉产生活性氧;诱导抗性[89]
3.5 作用于其他位点
部分抑菌剂可穿透细胞膜,通过直接结合DNA/RNA或抑制DNA/RNA合成酶活性,从而抑制柑橘致腐菌生长并致使菌体死亡。抗真菌肽PAF26能结合DNA并下调DNA复制/修复相关基因的表达[90]。拮抗微生物的抑菌机制相对复杂,拮抗菌可通过争夺营养物质和生长空间,抑制病原微生物生长。在特定生理和分子水平的变化下,某些拮抗菌会形成生物膜,这种转变可能有助于它们抑制采后病害,具体通过以下方式实现:减少发育所需的物理空间,阻断营养供应及宿主向致腐菌孢子传递的萌发信号。荧光假单胞菌ZX通过与指状青霉竞争柑橘内的葡萄糖、果糖、天冬氨酸等营养物质,并快速繁殖形成稳定的生物膜位,抑制指状青霉生长,从而有效防控柑橘采后绿霉病[91]。部分接抗菌通过提高柑橘果皮组织中超氧阴离子
和过氧化氢(H2O2)的水平,并抑制致腐菌对果实的侵染[84,92]。特殊作用机制包括铁载体的产生,降低致腐菌的致病力和分泌水解酶改变微生物细胞壁的组成[93]。某些拮抗菌通过竞争螯合铁元素(病原微生物生长必需的微量元素),从而抑制其代谢活动。
4 总结与展望
本研究系统总结了柑橘采后主要病害,并综合评估了物理、化学及生物防治技术在保鲜应用中的效果,从细胞膜、细胞壁、能量代谢系统及诱导抗性等靶点深入解析其作用机制。现有研究表明,虽然上述方法在维持柑橘品质方面各具优势,但化学保鲜剂可能引发环境残留与安全性问题,天然保鲜剂的稳定性与成本控制仍是亟需突破的瓶颈。为实现绿色高效的柑橘采后病害防控,未来研究应聚焦以下方向:(1)开发高效低毒的天然保鲜剂。通过超临界流体萃取、纳米封装等先进技术,提升活性成分的稳定性与生物利用度,并结合多组学与分子互作研究,系统阐明其抑菌机制;(2)构建协同复合保鲜体系。通过在天然保鲜剂中科学复配化学抑菌成分,开发兼具高效、稳定与经济性的绿色配方;(3)建立安全性评价与标准化体系。制定新型保鲜剂的毒理学评价体系和最大残留限量标准,推动天然保鲜剂的合规化和商业化应用;(4)整合转录组、代谢组、蛋白质组等组学工具以及CRISPR/Cas9、RNA干扰等分子技术,深入解析病原菌致病机制与柑橘抗病性调控网络,为靶向生物防治提供新靶标和理论支撑。通过多学科交叉与技术创新,构建高效稳定的采后病害绿色防控技术体系,显著提升柑橘采后保鲜效果,提升柑橘产业效益与可持续性。
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