核桃(Juglans regia L.)中富含多种营养成分,是一种优质的植物蛋白来源,但其中含有多种过敏原,过敏人群食用后会引起严重的过敏反应,为公共安全带来隐患。世界卫生组织(World Health Organization,WHO)与国际免疫学会联盟(International Union of Immunological Societies,IUIS)联合成立的过敏原命名分委会共收录了8种核桃过敏原(Jug r 1～Jug r 8),其中Jug r 1、Jug r 2、Jug r 4和Jug r 6通常与严重的机体过敏反应相关[1]。欧美人群对核桃过敏最为普遍[2],但最新流行病学调查显示,亚洲群体中这种过敏反应的发病率正在上升,尤其在儿童群体中更为明显[3]。
现已开发多种物理及化学降敏手段,其根本原理是通过诱导过敏原蛋白变性或结构修饰进而破坏或掩盖过敏原的关键过敏表位,从而降低其免疫原性。热处理是目前核桃蛋白降敏研究中常用的物理方法之一,但其具体效果由于处理方式不同而存在区别。例如,姜松松等[4]的研究发现,微波加热处理会增强核桃蛋白的抗原性,与高温加压及湿热处理的降敏效果存在差异。多酚作为一种来源广泛的天然小分子物质,可通过共价键或非共价键与蛋白质相互作用,从而改变过敏原的分子结构和抗原表位的可及性,最终影响其抗原结合能力,现已广泛应用于多种食物过敏原降敏的研究中[5]。目前许多研究聚焦于探究多酚与单一过敏原蛋白的相互作用对其致敏性的影响[6],却忽视了天然食品蛋白质中过敏原类型的复杂性。也有研究评估了多酚作用于蛋白质时对整体致敏性的影响[7],然而在多种蛋白竞争结合多酚的情况下,多酚对不同过敏原作用的选择性尚未明确,导致无法明确多酚降敏的靶蛋白与关键路径。基于质谱的蛋白质组学技术可实现对蛋白质的全面分析,其中定量蛋白质组学技术能够对蛋白质表达水平进行量化,在食品科学应用中潜力巨大,现已广泛应用于食品安全监测和植物蛋白快速过敏原筛查中[8-9]。
基于本课题组先前的研究结果[10],本研究进一步探究核桃内种皮多酚提取物(polyphenol extract from walnut pellicle, PEWP)对核桃球蛋白(walnut globulin, WG)抗原性的影响,及其修饰后蛋白中过敏原蛋白质谱相对丰度的变化,旨在为开发低致敏性核桃产品奠定新的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
核桃球蛋白、核桃内种皮多酚提取物及核桃抗兔血清按照实验室之前的方法预先制备(实验前1个月),其中核桃球蛋白和核桃内种皮多酚提取物贮存于-20 ℃冰箱,核桃抗兔血清贮存于-80 ℃冰箱[11];PAGETM预制梯度胶(4%～20%),ACE生物技术有限公司;TMB显色液、丽春红染色液、分子质量标准品(10～170 kDa)、Folin-Ciocalteu试剂,碧云天生物技术有限公司;HRP标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)二抗,英国剑桥Abcam公司;质谱级乙腈、甲酸、胰蛋白酶,美国赛默飞公司;鞣花酸标准品,源叶生物科技有限公司;碘乙酰胺、二硫苏糖醇(1,4-dithiothreitol,DTT)、邻苯二甲醛(O-phthalaldehyde,OPA)、硝基蓝四氮唑(nitroblue tetrazolium chloride,NBT),Sigma-Aldrich公司。
1.2 仪器与设备
Epoch多功能酶标仪,美国Biotek公司;UltiMate 3000 高效液相色谱系统,美国赛默飞公司;Q-Exactive静电场轨道阱液相质谱联用仪,美国赛默飞公司;Chirascan V100光谱仪,英国应用光物理公司;Trans-Blot®半干转印系统转印槽,Bio-Rad;Tanon 5200凝胶成像系统,上海Tanon公司;DYY-6C电泳仪,北京六一生物科技有限公司;S3500激光粒度仪,美国Microtrac公司;Centrifuge 5430R台式高速冷冻离心机,德国艾本德公司。
1.3 实验方法
1.3.1 复合物制备
采用碱处理方法制备了WG-PEWP复合物。将不同体积的PEWP溶液加入WG溶液中,分别调整PEWP与WG添加量为0%、5%、10%和20%(质量分数,与WG的质量比),随后将各反应体系的pH值调节至9。混合物于25 ℃下磁力搅拌孵育2 h。4 ℃透析除未结合的游离多酚。复合物经冷冻干燥后分别标记为对照组、WG-PE1、WG-PE2和WG-PE3。
1.3.2 酚结合当量及游离氨基含量的测定
取0.1 mL WG溶液与0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂混合,暗处孵育5 min。随后加入75 g/L碳酸钠溶液,继续孵育1 h。使用酶标仪测定760 nm波长下的吸光度值。最终通过没食子酸当量(gallic acid equivalent, GAE)计算结合酚含量,结果以每毫克蛋白质对应的纳摩尔数表示(nmol GAE/mg蛋白)。
将20 μL WG溶液与1 mL新配制的OPA试剂混合,随后在35 ℃下孵育5 min。使用酶标仪测定340 nm波长下的吸光度值。用L-赖氨酸(L-lysine,L-Lys)标准品生成的校准曲线计算复合物的游离氨基含量。
1.3.3 SDS-PAGE
将WG溶液(1 mg/mL)与等体积上样缓冲液混合后,在100 ℃下水浴加热变性5 min。随后将10 μL混合液上样至凝胶中,并在90 V电压下电泳85 min。电泳结束后,用染色液染色30 min。将凝胶浸泡于去离子水中过夜脱色,拍照。
1.3.4 NBT染色
采用半干式电泳转移仪将凝胶上的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride membrane,PVDF)膜上。丽春红染色液染色5 min确认蛋白质的转移情况。脱色后的PVDF膜在25 ℃避光条件下与NBT染色液(0.24 mmol/L)孵育45 min,用去离子水洗去染液,拍照。
1.3.5 蛋白质结构分析
1.3.5.1 紫外-可见光谱
样品蛋白溶液(0.05 mg/mL)在200～600 nm进行扫描分析,扫描分辨率设置为5 nm。
1.3.5.2 荧光光谱
测定样品溶液(0.05 mg/mL)在300～500 nm的荧光光谱,激发和发射的狭缝宽度为5 nm,扫描速度1 200 nm/min,电压600 V。
1.3.5.3 傅里叶变换红外光谱
通过溴化钾压片法制备样品蛋白-KBr混合物(1∶>50,质量比)。使用光谱仪记录400～4 000 cm-1的光谱,扫描次数32次,分辨率4 cm-1。
1.3.5.4 圆二色光谱
在25 ℃下使用1 mm石英比色皿收集样品溶液(0.2 mg/mL)在190～260 nm的光谱数据。
1.3.6 IgG结合能力分析
按照MA等[10]的方法,通过间接竞争酶联免疫吸附测定样品的IgG结合能力,使用酶标仪测定样品在450 nm处的吸光度(optical density, OD)值。兔抗核桃蛋白血清稀释比为1∶>16 000,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗稀释比为1∶>5 000。抑制率计算如公式(1)所示,其中抑制率越低,表明复合物的IgG结合能力越低。
抑制率
(1)
1.3.7 蛋白质组学分析
参考JIA等[12]的方法,样品蛋白经还原、烷基化处理后,用胰蛋白酶酶解16 h。提取的多肽经C18 ZipTips脱盐柱脱盐,真空浓缩后用0.1%甲酸水复溶,用于后续LC-MS/MS分析。多肽通过UltiMate 3000高效液相色谱系统分离后,导入Orbitrap Exploris 480质谱仪进行LC-MS/MS分析。流动相A为含0.1%甲酸的水相,流动相B为含0.1%甲酸的乙腈有机相。采用正离子模式采集质谱数据,参数设置如下:全扫描范围300～2 000 m/z;自动增益控制设为1×106;动态排除时间30 s;分辨率15 000;HCD碎片化时归一化碰撞能量设为30%。
质谱数据通过Proteome Discoverer 2.4.0.305软件进行处理,采用MSPepSearch和Sequest HT两种检索引擎。针对核桃(Juglans regia L.)的UniProt/SwissProt数据库进行检索时,设定如下标准:胰蛋白酶消化(最多允许2次漏切);动态修饰包括甲硫氨酸氧化和N端乙酰化;静态修饰为半胱氨酸羧甲基化。肽段鉴定采用高置信度过滤(错误发现率<1%)。
1.3.8 蛋白质酸水解产物分析
将蛋白样品与6 mol/L盐酸按1∶>50(g∶>mL)混合,氮气吹扫5 min后在120 ℃下加热22 h。用氢氧化钠溶液中和混合物,随后经过滤并离心收集上清液。使用安捷伦EC-C18色谱柱(100 mm×4.6 mm,2.7 μm)分析蛋白酸水解产物及鞣花酸标准品溶液,流动相由含0.1%甲酸水(A相)和乙腈(B相)组成,流速为0.3 mL/min。质谱分析采用DDA模式,参数设置如下:干燥气流量12 L/min,温度350 ℃;离子源温度120 ℃;碰撞能量45 V;毛细管电压3 500 V;锥孔电压40 V;质量范围50～1 700 Da;扫描速率3 s;扫描次数5次;动态排除时间6 s。
将质谱数据转换为mzXML.格式文件后上传至全球天然产物社会分子网络(global natural products social molecular networking,GNPS)平台(http://gnps.ucsd.edu)进行分析[13]。使用Cytoscape软件(版本3.10.0)进行网络可视化及后续分析。
1.4 数据处理
所有分析均进行了3次独立重复实验。结果以“平均值±标准差”表示。统计分析采用单因素方差分析结合邓肯检验(SPSS v19.0),其中P<0.05视为具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 WG和PEWP复合物的表征
2.1.1 复合物中酚结合当量和游离氨基含量的定量
在碱性和含氧条件下,多酚易被氧化生成醌类物质,这些醌类可与蛋白质的亲核残基反应形成共价交联[14]。如表1所示,WG与PEWP形成的复合物展现出显著的酚结合特性,随着PEWP添加量的增加,复合物中的酚结合当量呈浓度依赖性上升趋势[从(3.27±0.12)增至(29.93±0.1) mg GAE/100 g蛋白,P<0.05];而复合物中的游离氨基含量呈现逐步下降趋势,与对照组相比,PEWP添加量达到20%时,复合物中的游离氨基含量降低了80.21%。由于OPA试剂中的十二烷基硫酸钠能破坏分子间的非共价相互作用[15],从而最大限度降低其对结果的干扰,这些结果表明,PEWP中的酚类化合物与WG的氨基酸侧链形成了稳定的共价相互作用。
表1 蛋白质的多酚结合当量和游离氨基含量
Table 1 Content of polyphenol binding equivalent and free amino groups in protein
样品 酚结合当量/(mg GAE/100 g 蛋白)游离氨基含量/(mmol/mg 蛋白)对照组—93.84±1.70aWG-PE13.27±0.12c55.40±2.51bWG-PE29.62±0.34b37.53±4.59cWG-PE329.93±0.10a17.63±2.11d
注：同列不同字母表示样本之间具有显著性差异(P<0.05)(下同);—表示未检出。
2.1.2 复合物SDS-PAGE和NBT染色结果分析
图1为还原条件下的蛋白质电泳图谱,清晰呈现了蛋白质分子质量分布及交联行为。图1-a中对照组条带为未添加PEWP的WG,随着PEWP添加量增加,可以观察到低分子质量条带强度逐渐降低或消失,同时在高分子质量区域出现拖尾现象。实验体系中SDS和DTT的存在可有效破坏分子间的非共价相互作用[16],这种分子质量条带变化的现象说明WG与PEWP之间的共价交联作用形成了蛋白高分子质量聚合物。LIU等[17]的报道也发现OVA与多酚的共价结合可改变复合物分子质量条带分布。值得注意的是,几种已知分子质量的核桃过敏原亚基Jug r 2(47 kDa,条带1)、Jug r 6(48.8 kDa,条带1)和Jug r 4(58 kDa,条带2)条带强度也随PEWP添加量的提高而降低。丽春红染色证实了蛋白质在膜上的高效转移(图1-b)。NBT染色(图1-c)结果可进一步验证蛋白质与多酚的共价结合[18]。对照组中未检测到染色现象,而随着PEWP的添加,复合物的染色强度逐渐增强。这些结果表明WG与PEWP之间的共价结合导致蛋白质分子质量增加。
a-SDS-PAGE;b-丽春红染色;c-NBT染色
图1 复合物的凝胶电泳分析
Fig.1 Gel electrophoresis analysis of complex
2.1.3 复合物二级结构分析
图2-a为样品蛋白的傅里叶红外光谱,对照组蛋白在3 297.01 cm-1(酰胺Ⅰ带)、1 658.96 cm-1(酰胺Ⅱ带)和1 539.55 cm-1(酰胺Ⅲ带)处呈现显著吸收峰。当与PEWP形成复合物后,酰胺Ⅰ带及酰胺Ⅱ带向低波数方向发生红移,而酰胺Ⅲ发生蓝移,这反映了其化学键及结构的变化。圆二色光谱中(图2-b),208 nm和222 nm波长处对应于α-螺旋结构,而β折叠结构则在215 nm处呈现负峰[19]。与对照组相比,复合物中负峰强度减弱且出现光谱位移,表明PEWP相互作用导致了结构变化。表2的二级结构定量分析结果显示,随着PEWP添加量升高,复合物中的α-螺旋结构显著降低(P<0.05),同时β-折叠和无序卷曲增强(P<0.05),蛋白质结构的无序性增加。这些发现共同证明,PEWP能够诱导WG二级结构中α-螺旋结构显著降低。
a-傅里叶红外光谱;b-圆二色光谱
图2 复合物的二级结构
Fig.2 Secondary structure of complex
表2 蛋白质的二级结构含量
单位:%
Table 2 Content of protein secondary structure
样品α-螺旋β-折叠β-转角无规则卷曲对照组23.27±1.07a26.80±0.73c20.50±0.16b29.47±0.17dWG-PE121.27±0.26b27.73±0.33bc21.13±0.26ab29.93±0.17cWG-PE219.77±0.52c28.60±0.65bc21.07±0.21a30.53±0.12bWG-PE317.40±0.16d30.17±0.33a20.83±0.19a31.57±0.24a
2.1.4 复合物三级结构分析
紫外光谱位移和强度变化可反映蛋白质内部疏水性氨基酸残基的微环境改变,其中吸光度变化作为相互作用强度的指标[20]。如图3-a所示,随着PEWP添加量增加,WG特征吸收峰出现明显红移,且峰强度逐渐增强。荧光光谱分析技术通过芳香族残基的固有荧光特性反映蛋白质三级结构的改变[21]。如图3-b所示,随着PEWP添加量增加,复合物中出现显著的荧光猝灭现象,其发射峰从332 nm蓝移至327 nm,表明色氨酸/酪氨酸残基周围微环境的疏水性增强。ZHAO等[22]也观察到随鞣花酸添加量的增加,蛋白质复合物呈现紫外光谱的红移、荧光光谱蓝移及荧光强度降低的现象。这些结果表明PEWP的添加诱导了蛋白质的三级结构改变,使芳香族氨基酸残基暴露于外部疏水环境。
a-紫外可见光谱;b-荧光光谱
图3 复合物的三级结构
Fig.3 The tertiary structure of the complex
2.2 PEWP添加对WG的抗原性影响分析
本研究采用间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,IC-ELISA)测定蛋白样品的体外抗原性。图4-a的抑制率结果显示,对照组WG的IgG结合能力为(72.68±3.28)%,显著高于复合物组。值得注意的是,随着PEWP添加量的增加,复合物的IgG结合能力呈现剂量依赖性下降趋势(P<0.05)。当PEWP添加量达到20%时,WG-PE3蛋白的IgG结合能力降至(43.26±0.25)%。浓度-抑制效应曲线进一步量化了复合物的抑制能力,IC50值越小,说明该物质在更低浓度下就能达到50%的抑制效果[23]。对照组蛋白的半数抑制浓度(IC50)为0.34 μg/mL,而添加PEWP后,IC50值分别为0.44 μg/mL(WG-PE1)、0.76 μg/mL(WG-PE2)和1.94 μg/mL(WG-PE3)。这些结果表明,PEWP的添加能有效降低WG的IgG结合能力。
a-复合物IgG结合能力;b-复合物的浓度-抑制效应曲线
图4 复合物的抗原性变化
Fig.4 Antigenic changes of complex
注:不同字母表示样本之间具有显著性差异(P<0.05)。
对复合物的制备条件、结构特征及抗原性进行了皮尔逊相关分析,结果如图5所示,复合物的IgG结合能力与PEWP添加量呈显著负相关(r=-0.979,P<0.05),同时与多酚结合量存在强负相关(r=-0.999,P<0.01)。此外,IgG结合能力与β-折叠(r=-0.959,P<0.05)和无规卷曲(r=-0.970,P<0.05)含量呈负相关,而与α-螺旋含量呈正相关(r=0.910,P<0.05)。上述结果说明,PEWP与WG之间的相互作用受到PEWP添加量的影响,进而改变蛋白的结构和IgG结合能力。
图5 复合物制备条件、结构特征和IgG结合能力相关性分析
Fig.5 Correlation analysis of preparation conditions, structural characteristics and IgG binding ability of complex
注:*和**分别表示P<0.05和P<0.01水平的显著相关性。
2.3 蛋白质组学分析
通过非标记定量蛋白质组学技术对WG中的各类蛋白进行鉴定与定量。图6-a展示了对照组与WG-PE3组蛋白质的总离子流图(total ion chromatogram, TIC)。在保留时间前30 min内,2组样品的峰分布模式相似,但45 min后WG-PE3样品的洗脱峰形状和强度发生明显变化。WEI等[24]在研究β-乳球蛋白与表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)复合物的结合机制时,发现二者形成的非共价复合物的质谱图与天然β-乳球蛋白一致,但是当EGCG与β-乳球蛋白形成共价复合物后,可观察到其特征峰强度的改变及新特征峰的产生。在2组样本中共鉴定到544种核桃蛋白,其中有208种蛋白质的肽段覆盖率超过10%(图6-b),有222种蛋白质在每次检测中均被稳定检出并定量(图6-c)。
a-TIC图;b-肽段覆盖率;c-蛋白质鉴定数量
图6 蛋白质组学鉴定结果
Fig.6 Proteomics identification results
主成分分析结果(图7-a)显示2组样本存在明显组间分离,前2个主成分(PC1+PC2)的累积方差贡献率达99%,表明2组样本在整体蛋白质表达水平上存在显著的系统性差异。以P<0.05且倍数变化(fold change,FC)>1.2 或<0.83为显著差异筛选标准,对2组样本的蛋白质表达数据进行火山图分析(图7-b),共筛选到163个差异表达蛋白质(differentially expressed proteins, DEPs),其中159种蛋白质显著下调。鉴定到的6种核桃过敏原蛋白中有4种蛋白的质谱相对丰度显著下调,分别是Jug r 2、Jug r 4、Jug r 6和Jug r 8,对应的下调倍数为-0.61、-0.73、-0.64和-0.63,相关信息详见表3。Jug r 2、Jug r 4和Jug r 6蛋白的特异性肽段数量均超过50条,表明这些致敏蛋白在各组样本中均可被高度特异性识别,其鉴定信号未受到同源蛋白或同家族其他蛋白的序列干扰。肽谱匹配(peptide spectrum match,PSMs)可反映定量结果的稳定性和重现性,蛋白质检测到的PSMs数量越多,说明信号越稳定,定量误差也越小。通过基因本体论(gene ontology,GO)注释分析将DEPs划分为3个功能类别:生物过程(biological process, BP)、细胞组分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)。统计结果如图7-c所示。163个DEPs被注释到64个GO项中,其中24个归类于BP、12个归类于CC、28个归类于MF。值得注意的是,许多过敏原蛋白属于种子贮藏蛋白家族[25],这类蛋白参与植物生长过程中种子发育及营养积累功能。
a-主成分分析图;b-火山图;c-DEPs的GO分析
图7 蛋白质组学分析结果
Fig.7 Proteomics analysis results
表3 过敏源信息
Table 3 Allergen information
登录号生化名称过敏原覆盖率/%肽谱匹配数特异肽段数P值FCP931982S白蛋白种子储存蛋白Jug r 1731 233190.291.05Q9SEW47S球蛋白种子储存蛋白Jug r 2792 202779.88×10-8-0.61C5H617非特异性脂质转运蛋白Ⅰ型Jug r 3436060.09-0.90Q2TPW511S球蛋白种子储存蛋白Jug r 4721 519503.74×10-5-0.73A0A2I4E5L67S球蛋白种子储存蛋白Jug r 6751 373642.96×10-5-0.64A0A2I4EB91非特异性脂质转运蛋白Ⅱ型Jug r 822638.94×10-3-0.62
此外,MATTISON等[26]发现与脂肪酸代谢相关的基因硬脂酰-ACP脱氢酶的表达与山核桃过敏原的基因表达存在关联。综合蛋白质组学分析结果表明,PEWP可能通过与这些DEPs相互作用来影响其检测丰度,在这些相互作用中,PEWP与WG中4种过敏原蛋白的共价结合可能是导致其抗原性改变的重要因素。
2.4 酸水解产物鉴定分析
本研究采用液相色谱-串联质谱技术分析对照组与WG-PE3复合物的酸水解产物,分子网络的可视化结果见图8。GNPS中共精确鉴定到20种化合物,氨基酸及多酚鉴定结果已标注在图中,鞣花酸(1)、异亮氨酸(2)、精氨酸(3)、谷氨酸(4)、蛋氨酸(5)、苯丙氨酸(6)、酪氨酸(7)、脯氨酸(8)及缬氨酸(9)。值得注意的是,多酚类物质鞣花酸仅在WG-PE3复合物中被鉴定,这表明它们可能源自PEWP,并与WG发生了共价相互作用。KONG等[27]证实鞣花酸是PEWP中的主要多酚成分。图9为鞣花酸在GNPS中匹配的镜像质谱图,将其与鞣花酸标准品进行对比确认,样品产生的多个离子碎片(m/z 229.01、m/z 201.02及m/z 173.02等)与数据库中的标准品谱图相匹配。WANG等[28]的研究发现,鞣花酸可对核桃蛋白进行共价修饰,进而改变其结构与功能特性。ZHANG等[29]探究多种多酚对杏仁过敏原的影响时也发现鞣花酸的结合会改变其抗原性。
图8 蛋白质酸水解产物的质谱分子网络
Fig.8 Mass spectral molecular network of hydrolyzed protein acid products
注:图中编号1～9为GNPS精确鉴定到的化合物。
图9 鞣花酸在GNPS中的镜像匹配图
Fig.9 Mirror matching diagram of ellagic acid in GNPS
鉴于样品制备过程中通过充分透析去除了游离多酚,这些结果表明鞣花酸是PEWP中与WG发生相互作用的主要多酚成分。结合复合物中过敏原蛋白质谱相对丰度的降低和整体IgG结合能力降低的结果,说明这可能是由于鞣花酸对过敏原的共价修饰所致。
3 结论
本研究探讨了PEWP对WG结构特征及抗原性的影响。实验结果表明,PEWP与WG形成共价交联复合物,显著改变其结构并降低IgG结合能力。相关性分析显示,IgG结合能力下降与PEWP浓度水平及PEWP介导的二级结构修饰存在强关联。相较于对照组,WG-PE3组中4种核桃过敏蛋白(Jug r 2、Jug r 4、Jug r 6和Jug r 8)的质谱相对丰度显著降低。酸水解产物鉴定证实,EA是参与WG复合物形成的PEWP中主要多酚成分。这些发现表明,PEWP可通过其成分EA修饰WG中的4种过敏原,从而削弱过敏原的免疫识别能力。由于过敏的本质是机体免疫系统与过敏原的系统性相互作用,实际的降敏效果还需要通过体内实验进一步验证。
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