人乳脂肪球膜(milk fat globule membrane,MFGM)由磷脂、胆固醇、酶、蛋白质、糖鞘脂和糖蛋白等组成[1],是人乳的有效活性成分,近年来因其保护婴儿免受病原体入侵、调节免疫系统、改善神经发育、脑发育和肠道发育等对婴儿健康产生积极影响的功能及在食品领域中的应用而日益受到关注[2]。新生儿,尤其是早产儿,具有先天性和适应性免疫系统缺陷,特别是吞噬作用、细胞免疫、体液免疫和补体尚未发育完善,缺乏有效防御能力和几种生物活性成分,导致新生儿对感染的易感性增加[3]。早期母乳喂养为新生儿提供了免疫调节化合物,支持其能够面对免疫需求,包括应对感染和建立耐受性[4-5]。生命早期的炎症可能导致不良的神经发育,这凸显了减轻新生儿期炎症的重要性[6]。
许多乳脂肪球膜蛋白(milk fat globule membrane protein,MFGMP)已经显示或建议具有生物活性,MFGM中高浓度存在的蛋白质包括粘蛋白1(MUC1)、黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(xanthine dehydrogenase/oxidase,XDH/XO或XOR)、嗜乳脂蛋白(butyrophilin,BTN)、乳粘蛋白(PAS6/7、MFG-E8)、CD36和脂肪酸结合蛋白[7]。向IF中添加MFGM是使其更接近母乳的有效方式之一,目前IF的主要原料为牛乳,其牛源MFGMP成分与人源MFGMP存在一定差异,特别是在参与宿主防御的蛋白质组中所占的比例不同,牛MFGM富含抗菌蛋白而人MFGM富含多种与黏膜防御系统有关的蛋白质(IgA, CD14, LTF和LYZ)[8]。无论是MFGM还是MFGMP发挥其生物活性作用都需要经过婴儿胃肠道的消化,抵抗消化保持结构完整性更有利于其发挥作用[9],虽然婴儿胃肠道发育不完全,但仍有能力将其水解为氨基酸、多肽等小分子物质[10],因此,MFGMP可能通过其水解产物发挥相关的功能。随着对母乳营养成分研究的日渐深入以及IF行业的快速发展,有必要对不同乳来源MFGM的成分(特别是蛋白质组分)和其在婴幼儿发育功能方面发挥的作用进行分析,为IF更进一步接近人乳的功能提供一定的参考和支持。
不同乳源的MFGM及其蛋白质的结构组成存在差异,因而其消化特性和功能也存在差异。本研究通过对人MFGM、人MFGMP、牛MFGM、牛MFGMP四种样品进行体外模拟婴儿胃肠道静态消化,探究其消化特性的差异(游离氨基酸及多肽的变化),并通过细胞实验对比不同来源及存在形式MFGMP消化产物抗炎潜力的差异,阐释人源MFGMP对婴幼儿肠道抗炎方面的作用以及MFGMP存在形式对其消化功能的影响,为基于人源MFGMP消化产物功能成分特性开发婴幼儿配方奶粉提供了理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 乳源与细胞
新鲜的生牛乳,山东省青岛市奶站,保持4 ℃快速运至实验室。母(人)乳由山东省青岛市的6名健康母亲(26～30岁、足月分娩、产后1～6个月)自愿捐赠,每位提供3份成熟的母乳样本,共18份。将收集的成熟母乳样品等体积混合,然后贮存在-80 ℃下以便进一步研究。小鼠巨噬细胞RAW264.7,中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(上海,货号TCM13)。
1.1.2 试剂
BCA蛋白浓度测定试剂盒、NO检测试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司;PBS,武汉赛维尔生物科技有限公司;甘氨酸、胃蛋白酶(1∶>3 000)、脂肪酶(1∶>20 000)、胰蛋白酶(1∶>250)、胰酶(1∶>4 000)、牛胆盐、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、DMEM高糖培养基,北京索莱宝科技有限公司;甲酸(色谱纯),美国Sigma公司;乙腈(色谱纯),上海安谱实验科技股份有限公司;细胞计数试剂盒-8(CCK-8),上海宏叶生物科技有限公司;Mouse IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒,上海雅酶生物医药科技有限公司;实验所用其他化学试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
D9N-50乳脂分离机,昌隆牛奶分离器制造厂;SCIENTZ-ⅡD超声波细胞粉碎机,宁波新芝生物科技股份有限公司;DK-98-ⅡA恒温水浴锅,天津市泰斯特仪器有限公司;BCD-269 WDGG 4 ℃冰箱、HYCD-282-20 ℃低温冰箱,青岛海尔电器有限公司;TG20KR-D高速冷冻离心机,长沙东旺仪器有限公司;PB-10型pH计,德国赛多利斯公司;ZWY-1102C恒温振荡培养箱,上海智城分析仪器制造有限公司;Alpha1-2LDplus冷冻干燥机,德国Marin Christ公司;L-8900全自动氨基酸分析仪,日本日立公司;UPLC-Q-Orbitrap液质联用仪、Multiskan FC酶标仪,赛默飞世尔科技公司;timsTOF Pro 2质谱仪,德国Bruker公司;Evosep One纳升液相色谱系统,丹麦Evosep公司。
1.3 实验方法
1.3.1 MFGM的提取
MFGM的提取参照REN等[11]的方法,并作适当修改。将生牛乳预热至40 ℃左右,经乳脂分离机分离得到稀奶油;用3倍体积0.1 mol/L pH 6.8的PBS洗涤奶油,在4 ℃ 3 200×g条件下离心30 min,弃上清液得到洗涤后的奶油;用等体积的PBS复溶,使用超声波细胞破碎仪(60 W)处理,循环30次(每次5 s,间隔2 s),后放入4 ℃冰箱冷藏12 h增加其水合性,于42 ℃水浴中缓慢搅拌,直到获得均匀的熔融流体;在25 ℃ 1 000×g条件下离心10 min收集下层酪乳,使用1 mol/L HCl溶液调节pH值至4.8,静置30 min,在25 ℃ 10 000×g条件下离心15 min,收集下层组分;用1 mol/L NaOH溶液将pH值调节至6.8,经真空冷冻干燥机冻干,并于-20 ℃保存备用。
1.3.2 MFGMP的提取
MFGMP的提取参照LI等[12]的方法并稍作调整,具体步骤如下:将冷冻干燥的MFGM复溶于5 mL超纯水中,与10倍体积的冷丙酮在冰浴中充分混匀,于-20 ℃孵育24 h,在4 ℃ 11 000×g条件下离心30 min,小心吸取上清液,在通风橱中使丙酮充分挥发,得到干燥的MFGMP沉淀,于-20 ℃保存备用。
1.3.3 模拟婴儿胃肠道静态消化
婴儿食品在口腔停留时间很短,所以模拟消化时省略了口服阶段[13],使用的静态体外消化模型包括胃期和肠道期两个步骤。参照MÉNARD等[14]的方法并作适当修改,对牛MFGM、牛MFGMP、人MFGM、人MFGMP进行体外模拟婴儿胃肠道静态消化。
胃期消化:取5 mL上述各组样品(5 mg/mL蛋白质)分别与37 ℃预热的模拟胃液(simulated gastric fluid,SGF;含94 mmol/L NaCl,13 mmol/L KCl)按63∶>37的体积比混合,加入胃蛋白酶(268 U/mL)和脂肪酶(19 U/mL),用超纯水调节体积至15 mL,并用1 mol/L HCl调节pH值至5.3,置于37 ℃ 55 r/min的恒温振荡培养箱中消化1 h。分别在0、0.5和1 h时取样1 mL,沸水浴10 min以灭活酶,冷却后在4 ℃ 10 000 r/min条件下离心5 min,收集上清液并于-20 ℃保存备用。胃消化完成后,用1 mol/L NaOH将pH值升高至7.0,以便在肠消化前灭活胃蛋白酶。
肠道期消化:先加入CaCl2(浓度为肠液体积的0.3 mol/L),再将胃食糜与37 ℃预热的模拟肠液(simulated intestinal fluid,SIF;含164 mmol/L NaCl,10 mmol/L KCl,85 mmol/L NaHCO3)混合,使V(肠期膳食)∶>V(胃和肠道总分泌物)=39∶>61,即肠期的总体积由39%的膳食、23%的SGF和38%的SIF组成。加入胰蛋白酶(16 U/mL)、胰酶(90 U/mL脂肪酶)和胆盐(3.1 mmol/L),用超纯水调节体积至30 mL,用1 mol/L HCl调节pH值至6.6,置于37 ℃ 55 r/min的恒温振荡培养箱中消化2 h。分别在0、0.5、1、1.5、2 h时取样1 mL,取样后的处理方式同胃期。肠消化完成后,沸水浴10 min终止反应。
1.3.4 游离氨基酸测定
参照LI等[15]的方法并稍作修改,使用全自动氨基酸分析仪测定牛源与人源MFGM及其蛋白质消化产物中游离氨基酸(free amino acids,FAA)的组成变化。将样品与体积分数为5%的磺基水杨酸溶液按照1∶>1(体积比)充分混合,4 ℃孵育60 min后,在4 ℃ 10 000 r/min条件下离心10 min脱去蛋白质,上清液经0.22 μm水系微孔滤膜过滤后转移液相样品瓶中,进行氨基酸分析。
1.3.5 多肽组学分析
根据ZENG等[16]的方法并稍作修改,采用纳升液相色谱-串联质谱法(Nano LC-MS/MS)对消化产物进行多肽组学分析,使用Nano LC Ultimate 3000系列系统与配备电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)源的Q-Exactive质谱仪联用,分析人源与牛源MFGM及其蛋白质消化产物的肽谱。所有消化产物均用C18 Zip Tip微量层析柱脱盐处理,并通过0.22 μm微孔膜过滤,然后将10 μL样品注入Hypersil GOLD C18色谱柱(1.9 μm, 2.1 mm×100 mm),以含0.1%(体积分数)甲酸的水溶液(流动相A)和含0.1%(体积分数)甲酸的乙腈溶液(流动相B)进行线性梯度洗脱,在正离子模式下运行。MS/MS参数设置如下:喷雾电压3.6 kV,毛细管温度300 ℃,鞘气流速为35 psi,辅助气体流速为10 arb。扫描模式为全扫描数据依赖型二级扫描(Full MS-ddMS2, DDA),母离子扫描范围为m/z 200～3 000,一级质谱分辨率为70 000,数据依赖型MS/MS(DD-MS/MS)的归一化碰撞能量为30,二级质谱分辨率为17 500。
1.3.6 RAW264.7细胞的培养与处理
1.3.6.1 细胞的复苏、培养与传代
根据ZHENG等[17]的方法并稍作修改,迅速取出冻存的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞系,37 ℃水浴振荡至融化,立即将细胞冻存液与完全培养基混合于15 mL离心管中,1 200 r/min离心3 min,弃上清液后加5 mL完全培养基重悬细胞,将细胞吹打均匀后转移至细胞培养瓶中,轻轻摇晃使细胞分布均匀,置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。倒置显微镜下观察细胞密度达80%以上时进行传代,弃去旧培养基,用无菌PBS冲洗1次,弃PBS后加入新鲜的完全培养基,反复轻柔吹打使细胞脱壁并混匀,将细胞悬液平分至新胞培养瓶中,置于细胞培养箱中培养,待细胞状态稳定后用于后续实验。
1.3.6.2 人与牛源MFGM及其蛋白质消化产物对RAW264.7细胞增殖活力的影响
根据FAN等[18]的方法并稍作修改,将处于对数生长期(密度在80%以上)的RAW264.7细胞悬液稀释后用细胞计数板计数,用完全培养基将其稀释,每孔100 μL(1×105个细胞)接种于96孔板,在细胞培养箱中培养至细胞贴壁后,弃去原有培养基。设置如下分组:a)空白组:加入100 μL完全培养基(不含细胞);b)对照组:加入100 μL完全培养基(含细胞,未经任何处理);c)样品组:分别加入含有牛源MFGM消化产物、牛源MFGMP消化产物、人源MFGM消化产物和人源MFGMP消化产物的100 μL样品溶液,每种样品设置5个质量浓度梯度(50、100、200、400、600 μg/mL)。各组置于细胞培养箱中培养24 h后,采用CCK-8法测定细胞存活率。每孔加入100 μL 10%(体积分数)的CCK-8试剂,继续培养0.5～1 h,随后测定450 nm处吸光度。细胞存活率的计算如公式(1)所示:
细胞存活率
(1)
式中:A样品组、A对照组、A空白组分别表示样品组(含有细胞、培养基、CCK-8和待测化合物)、对照组(含有细胞、培养基和CCK-8)和空白组(含有培养基和CCK-8)的吸光度值。
1.3.6.3 人与牛源MFGM及其蛋白质消化产物对巨噬细胞产生NO的影响
NO作为炎症反应中的关键信号分子,过量产生会导致组织损伤[19],因此消化产物抑制巨噬细胞产生NO的能力是其具有抗炎潜力的特征之一。
根据LI等[15]的方法并稍作修改,将RAW264.7细胞以1×105个/孔的密度接种于96孔板,培养24 h后弃上清液,设置如下分组:a)空白对照组:加入DMEM培养基(含细胞,未经任何处理);b)模型组:加入等体积的含1 μg/mL LPS的DMEM培养基;c)实验组:分别加入等体积的含有不同浓度的4种消化产物和1 μg/mL LPS的DMEM培养基。各组于培养箱中孵育24 h后,取上清液在3 000 r/min下离心5 min去除细胞碎片,收集新上清液,使用Griess试剂盒测定NO生成量。
1.3.6.4 人与牛源MFGM及其蛋白质消化产物对巨噬细胞产生免疫因子的影响
免疫因子作为免疫细胞间通讯的关键介质,其表达水平可反映巨噬细胞的活化状态及功能取向。在炎症反应中,巨噬细胞通过模式识别受体(如TLRs)感知外界刺激,进而调控特定免疫因子的表达,形成复杂的细胞因子网络[20]。
细胞的铺板及处理按照1.3.6.3节的方法进行,处理完成后,吸取上清液在3 000 r/min下离心5 min以除去细胞碎片,收集新上清液,使用ELISA试剂盒测定IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。
1.4 数据处理与分析
采用SPSS 27.0.1软件进行统计学分析,P<0.05表示差异显著具有统计学意义,使用GraphPad Prism 10.1.2软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 乳脂肪球膜蛋白消化产物的游离氨基酸分析
2.1.1 消化各阶段游离氨基酸总量分析
氨基酸作为蛋白质的重要组成部分,在生物体的各种生命活动中起着至关重要的作用。氨基酸的存在,尤其是母乳中的FAA,在新生儿的免疫发育中起着至关重要的作用,并有助于发挥母乳喂养的独特保护作用[21]。
如图1所示,未消化状态下,人源组的FAA浓度显著高于牛源组,表明人源组具有更高的初始氨基酸含量;胃消化后,4组的FAA浓度均未显著增加,表明胃蛋白酶对氨基酸释放的作用有限[22];而在胃肠消化后,4组的FAA浓度均显著上升,其中人源P组的FAA浓度增幅最大,说明氨基酸释放主要发生在肠阶段。此外,牛源组消化后产生的FAA浓度显著低于人源组,可能与牛乳蛋白结构或抗消化特性有关[23]。胃消化阶段,人源M组的FAA总量显著高于人源P组,这可能是由于MFGM中的脂质组分在胃消化过程中对MFGMP免受蛋白酶水解具有一定的保护作用[9]。然而经过胃肠消化后,与人源M组相比,人源P组在肠消化阶段FAA的增加更为显著,表明MFGM结构在肠道被破坏,释放更多氨基酸,导致更大的消化压力。综合来看,肠道是蛋白质的主要水解部位并主导FAA的释放,且人源组更易被彻底水解,MFGM结构的存在并不影响蛋白质整体消化程度,但会降低胃对MFGM的消化程度。
图1 模拟胃肠消化过程中人与牛源MFGM和MFGMP产生的游离氨基酸浓度比较
Fig.1 Comparison of free amino acid concentrations between human and bovine MFGM and their proteins after simulated gastrointestinal digestion
注:M表示MFGM,P表示MFGMP;ab表示同物质不同消化阶段组内差异显著,ABC表示不同物质同一消化阶段组间差异显著(P<0.05)。
2.1.2 消化各阶段必需氨基酸含量分析
游离必需氨基酸的组成与含量是婴幼儿蛋白质营养的重要评价指标,直接影响其生长速率与生理功能发育[24]。如图2所示,胃消化阶段,所有检测的9种游离必需氨基酸(苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸、组氨酸)在胃部消化后浓度均无显著增加,表明胃蛋白酶对蛋白质的初步水解作用有限,氨基酸释放较少,这与婴儿的低胃酸环境有关[22]。肠道消化是FAA释放的关键阶段,胃肠消化阶段,所有氨基酸浓度均显著上升。人源组必需氨基酸浓度显著高于牛源组(约1.5～2倍),这一差异主要归因于苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸浓度的增加,其质量比均超过40 μg/100 g样品;蛋氨酸在胃肠消化后4组间无显著差异;组氨酸在胃肠阶段无组间差异,但其代谢产物(组胺)具有抗炎潜力。支链氨基酸(缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸)在肠道免疫成熟等过程中可能发挥积极作用[25],赖氨酸、苯丙氨酸等是婴幼儿生长发育的关键物质,其充足供应直接支持组织合成与代谢[26],组氨酸的代谢产物组胺可抑制促炎细胞因子分泌,有助于维持肠道免疫平衡[27]。
A-苏氨酸;B-缬氨酸;C-蛋氨酸;D-异亮氨酸;E-亮氨酸;F-苯丙氨酸;G-色氨酸;H-赖氨酸;I-组氨酸
图2 模拟胃肠消化过程中人与牛源MFGM和MFGMP消化产物中的必需氨基酸比较
Fig.2 Comparison of essential amino acids in digestive products from human and bovine MFGM and MFGMP after simulated gastrointestinal digestion
注:黄色代表未消化,蓝色代表胃消化后,粉色代表胃肠消化后;M表示MFGM,P表示MFGMP;abc表示同物质不同消化阶段组内差异显著,ABC表示不同物质同一消化阶段组间差异显著(P<0.05)(下同)。
综合分析结果提示,人源组的高浓度支链氨基酸可能通过相关通路促进肠道免疫成熟[25],人源组必需氨基酸总量显著更高(尤其苯丙氨酸、赖氨酸)可能更利于婴幼儿生长发育。人源组在肠道消化阶段释放的必需氨基酸(除蛋氨酸外)更丰富,可能与其更易被胰酶水解的构象有关,这一差异对婴幼儿营养配方设计具有重要指导意义。
2.1.3 消化各阶段非必需氨基酸含量分析
游离非必需氨基酸是婴幼儿代谢及生长发育的重要营养物质,其高效释放与充足供应可满足婴幼儿对氨基酸的基础需求,如图3所示,游离非必需氨基酸的释放呈现明显的阶段特异性,胃消化阶段,除牛源P组的酪氨酸外,所有检测到的9种游离非必需氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸)浓度均无显著增加,表明胃蛋白酶对MFGMP的水解作用有限。胃肠消化阶段,人源组与牛源组均表现出显著上升,但人源组的增幅更显著,约为牛源组的1.5倍,这一差异可能归因于酪氨酸、谷氨酸和精氨酸含量的增加,其质量比均超过了25 μg/100 g样品,提示胰酶对人源MFGMP的水解效率更高。谷氨酸参与肠道黏膜代谢,天冬氨酸助力能量代谢,酪氨酸涉及神经递质合成等[28]。
A-甘氨酸;B-丙氨酸;C-脯氨酸;D-酪氨酸;E-丝氨酸;F-半胱氨酸;G-天冬氨酸;H-谷氨酸;I-精氨酸
图3 模拟胃肠消化过程中人与牛源MFGM和MFGMP消化产物中的非必需氨基酸比较
Fig.3 Comparison of non-essential amino acids in digestive products from human and bovine MFGM and MFGMP after simulated gastrointestinal digestion
综合分析结果显示,游离非必需氨基酸的释放以肠消化阶段为核心,人源组在浓度、释放效率及关键氨基酸贡献上均显著优于牛源组,其高水解度带来的高效释放及总FAA浓度优势(约为牛源组1.5倍),更贴合婴幼儿对非必需氨基酸的代谢与生长需求,这一差异为婴幼儿配方奶粉中游离非必需氨基酸的配比设计提供了重要参考。
2.2 多肽组学分析
2.2.1 消化产物中肽的基础信息
通过Nano LC-MS/MS对多肽进行鉴定,采集母离子和碎片离子的质谱数据后,借助MaxQuant软件和UniProt数据库进行肽段匹配,检索获得蛋白质名称、肽含量等基础信息。不同来源MFGM及其蛋白质经模拟婴儿胃肠道消化后产生的肽的数量与交集情况如图4所示,人源产生的肽共71种,牛源共45种。其中人源独有的肽为61种,牛源独有的肽为35种,两者共有的肽为10种,这些共有肽可能来源于高度保守的MFGMP(如ADFP,BTN等)[29],推测其在消化过程中可能产生相似的生物活性。
图4 人与牛源MFGM及其蛋白质经模拟胃肠消化后产生肽的韦恩图
Fig.4 Venn diagram of peptides in digestive products from human and bovine MFGM and their proteins after simulated gastrointestinal digestion
人源与牛源MFGM及其蛋白质经模拟婴儿胃肠道消化后产生的肽的分子质量和肽段长度分布如图5所示。从反映肽分子质量分布的图5-A可见,人源肽的分子质量主要分布在3 kDa以下,该范围内的占比高达90%以上,而牛源肽的分子质量主要集中在1～2 kDa、3～5 kDa。具体而言,人源肽在<1 kDa、1～2 kDa、2～3 kDa的占比分别为22.54%、50.7%、18.31%,均显著高于牛源肽,其中<1 kDa的肽含量约为牛源的4倍。从反映肽段长度分布的图5-B可见,人源肽段主要分布在2～10、11～20及21～30个氨基酸的区间,而牛源肽段则主要分布在11～20和31～41个氨基酸的区间。
A-肽的分子质量雷达图;B-肽段长度分布雷达图
图5 人与牛源MFGM及其蛋白质经胃肠消化后产生肽的分子质量和肽段长度分布
Fig.5 Molecular weight and length distribution of peptides in digestive products from human and bovine MFGM and their proteins after simulated gastrointestinal digestion
在肠道通透性方面,有研究表明分子质量与肠道渗透率呈负相关,不同分子质量肽的吸收路径不同[30];在功能活性方面,含有低分子质量肽(<3 kDa)和无规卷曲结构中含量最高的疏水性亚级分的蛋白质消化部分负责生物活性[31],低分子质量(<3 kDa)的水解物表现出较高的免疫调节活性[32],表明人源肽的抗菌效力和免疫调节作用可能优于牛源肽;在消化酶解抗性方面,<3 kDa肽的胰蛋白酶切割位点较少,3～5 kDa肽含更多芳香族氨基酸(胰凝乳蛋白酶靶点)[33]。
2.2.2 消化产物中的差异肽
先前的研究表明人乳中含有抗炎活性肽[34],基于肽段丰度分析,从人源MFGM及其蛋白质经模拟胃肠消化后产生的独有肽中,筛选出含量较高的多肽共6个。具体信息如表1所示,肽序列分别为PPSAGLGAPSPGK、RSHQQDCDEDDHR、DSTSAMREVPDFEAACQR、VLAAPAITQAPEALSRTR、VVPGATYAIL-HLWPLLLLVLALPQR、WEIIAEDETKETENQGLDISSP-GMSGHRQGHDSLEHDELR,其中分子质量小于3 kDa的肽有5个。
表1 人源肽中含量较高的差异肽
Table 1 Differential peptides enriched in human sources
肽序列长度分子质量/Da肽段丰度PPSAGLGAPSPGK131 134.6035 351 200RSHQQDCDEDDHR131 696.660 827 582 000DSTSAMREVPDFEAACQR182 068.894 245 486 000VLAAPAITQAPEALSRTR181 864.0532 124 700VVPGATYAILHLWPLLLLVLALPQR252 765.672 42 036 700WEIIAEDETKETENQGLDISSPGMSGH-RQGHDSLEHDELR404 545.073 946 143 000
2.3 消化产物浓度对RAW264.7细胞增殖活力的影响
采用检测灵敏度较高的CCK-8法,测定了质量浓度为50、100、200、400、600 μg/mL的人源与牛源MFGM、MFGMP消化产物对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖活力的影响,结果如图6所示。在50～600 μg/mL范围内,各组处理的细胞存活率均在90%以上,表明样品对细胞无毒。各组内不同浓度样品作用对比显示:人M和牛M组中,200 μg/mL和400 μg/mL下细胞存活率显著高于其他浓度;人P组中,质量浓度为400 μg/mL细胞存活率显著高于50 μg/mL;牛P组中,200 μg/mL与400 μg/mL质量浓度细胞存活率无显著性差异,但是显著高于其他浓度。与对照组相比,质量浓度为100 μg/mL时仅人M组表现出显著促增殖作用,200 μg/mL和400 μg/mL时人M、人P及牛M组均表现出显著促增殖效果。综上,基于细胞存活率较高且表现出显著的促增殖活性,选择200、400 μg/mL两个质量浓度进行抗炎活性研究。
图6 不同浓度人与牛源MFGM、MFGMP消化产物对RAW264.7细胞增殖活力的影响
Fig.6 Effects of human and bovine MFGM and MFGMP digestive products at different concentrations on the proliferation activity of RAW264.7 cells
注:abcd表示同种物质不同浓度间有显著性差异(P<0.05);*表示与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。
2.4 消化产物对RAW264.7产生NO和免疫因子的影响
如图7所示,人源与牛源MFGM及其蛋白质消化产物均能显著降低LPS诱导的NO、IL-6、IL-1β及TNF-α等关键炎症因子的过量产生,表明其均具备抗炎活性。从整体抗炎效果来看,人源组优于牛源组,具体表现为:在炎症因子调控方面,人源组对IL-6、IL-1β、TNF-α的降低幅度均大于牛源组;在NO调控方面,人源P组表现最优,其NO水平已降低至与空白组间无显著差异,抗炎作用最为显著,人源M组和牛源P组的NO降低效果次之,而牛源M组相对较弱。
A-NO;B-IL-6;C-IL-1β;D-TNF-α
图7 人与牛源MFGM、MFGMP消化产物对RAW264.7细胞产生NO和免疫因子的影响
Fig.7 Effects of human and bovine MFGM and MFGMP digestive products on the production of NO and immune factors by RAW264.7 cells
注:M表示MFGM,P表示MFGMP;不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)。
同时,同源M和P组的差异分析显示:在炎症因子指标中,无论人源还是牛源,其M组与P组间无显著性差异,而在NO指标中,其P组抗炎活性均高于同来源M组,表明发挥抗炎作用的物质可能是MFGMP水解产生的,即蛋白质水解产物是抗炎活性的关键物质基础。
3 结论与讨论
本研究利用模拟婴儿胃肠道消化模型,系统性比较了人源与牛源MFGM及其蛋白质消化产物的构成及其在抗炎活性方面的差异,首次揭示了人源MFGM及其蛋白质消化产物在氨基酸释放、肽段特征及抗炎活性方面的显著优势,发现了人源MFGMP更易消化,能产生更多氨基酸及小分子多肽,人源消化产物的抗炎活性更强。本研究为在婴幼儿配方奶粉中优化氨基酸与功能性肽段构成、弥补牛源MFGM营养功能不足提供了理论依据。然而,本研究采用的体外模拟消化模型存在固有局限性,其生理相关性还需通过体内实验进一步验证。此外,未来研究可拓展至其他物种乳源MFGM的比较,并借助动物模型系统评价不同来源MFGM及其蛋白质消化产物的功能特性,从而深入阐明其在生物体内的作用机制及生理效应。
[1] CLAUMARCHIRANT L, CILLA A, MATENCIO E, et al.Addition of milk fat globule membrane as an ingredient of infant formulas for resembling the polar lipids of human milk[J].International Dairy Journal, 2016, 61:228-238.
[2] HERNELL O, TIMBY N, DOMELLÖF M, et al.Clinical benefits of milk fat globule membranes for infants and children[J].The Journal of Pediatrics, 2016, 173:S60-S65.
[3] GAROFOLI F, CIVARDI E, PISONI C, et al.Anti-inflammatory and anti-allergic properties of colostrum from mothers of full-term and preterm babies:the importance of maternal lactation in the first days[J].Nutrients,2023,15(19):4249.
[4] HOYT A E W, MEDICO T, COMMINS S P.Breast milk and food allergy:Connections and current recommendations[J].Pediatric Clinics of North America, 2015, 62(6):1493-1507.
[5] LANGEL S N, BLASI M, PERMAR S R.Maternal immune protection against infectious diseases[J].Cell Host &Microbe, 2022, 30(5):660-674.
[6] KUBAN K C K, O’SHEA T M, ALLRED E N, et al.The breadth and type of systemic inflammation and the risk of adverse neurological outcomes in extremely low gestation newborns[J].Pediatric Neurology, 2015, 52(1):42-48.
[7] SUN Y, MA S Y, LIU Y B, et al.Changes in interfacial composition and structure of milk fat globules are crucial regulating lipid digestion in simulated in-vitro infant gastrointestinal digestion[J].Food Hydrocolloids, 2023, 134:108003.
[8] STRUIJS K, VAN DE WIELE T, LE T T, et al.Milk fat globule membrane glycoproteins prevent adhesion of the colonic microbiota and result in increased bacterial butyrate production[J].International Dairy Journal, 2013, 32(2):99-109.
[9] LE T T, VAN DE WIELE T, DO T N H, et al.Stability of milk fat globule membrane proteins toward human enzymatic gastrointestinal digestion[J].Journal of Dairy Science, 2012, 95(5):2307-2318.[10] CAVALETTO M, GIVONETTI A, CATTANEO C.The immunological role of milk fat globule membrane[J].Nutrients, 2022, 14(21):4574.
[11] REN Q X, GUO F, TENG F, et al.A novel approach for the reconstitution of bovine milk fat globules with different-melting-temperature triacylglycerol cores[J].Food Chemistry, 2021, 345:128563.
[12] LI W X, LI M H, CAO X Y, et al.Quantitative proteomic analysis of milk fat globule membrane (MFGM) proteins from donkey colostrum and mature milk[J].Food &Function, 2019, 10(7):4256-4268.
[13] MINEKUS M, ALMINGER M, ALVITO P, et al.A standardised static in vitro digestion method suitable for food-an international consensus[J].Food &Function, 2014, 5(6):1113-1124.
[14] MÉNARD O, BOURLIEU C, DE OLIVEIRA S C, et al.A first step towards a consensus static in vitro model for simulating full-term infant digestion[J].Food Chemistry, 2018, 240:338-345.
[15] LI Z Y, ABOU-ELSOUD M, CHEN H, et al.Identification and molecular mechanism of novel two-way immunomodulatory peptides from ovalbumin:In vitro cell experiments, de novo sequencing, and molecular docking[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2024, 72(17):9856-9866.
[16] ZENG J H, LIN K, ZHANG X Q, et al.Insight into the molecular-level details of αs1 casein interactions with IgG:Combining with LC-MS/MS and molecular modelling techniques[J].Food Chemistry, 2023, 399:133987.
[17] ZHENG Z M, HUANG Q L.New insight into the structure-dependent two-way immunomodulatory effects of water-soluble yeast β-glucan in macrophages[J].Carbohydrate Polymers, 2022, 291:119569.
[18] FAN H T, SUN M, LI J, et al.Structure characterization and immunomodulatory activity of a polysaccharide from Saposhnikoviae Radix[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2023, 233:123502.
[19] BOUGHTON-SMITH N K, EVANS S M, WHITTLE B J R, et al.Nitric oxide synthase activity in ulcerative colitis and Crohn’s disease[J].The Lancet, 1993, 342(8867):338-340.
[20] LAMPIASI N.Macrophage polarization:Learning to manage it 2.0[J].International Journal of Molecular Sciences, 2023, 24(24):17409.
[21] VAN SADELHOFF J H J, SIZIBA L P, BUCHENAUER L, et al.Free and total amino acids in human milk in relation to maternal and infant characteristics and infant health outcomes:The Ulm SPATZ health study[J].Nutrients, 2021, 13(6):2009.
[22] BOURLIEU C, MÉNARD O, BOUZERZOUR K, et al.Specificity of infant digestive conditions:Some clues for developing relevant in vitro models[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2014, 54(11):1427-1457.
[23] VANDERGHEM C, FRANCIS F, DANTHINE S, et al.Study on the susceptibility of the bovine milk fat globule membrane proteins to enzymatic hydrolysis and organization of some of the proteins[J].International Dairy Journal, 2011, 21(5):312-318.
[24] BURSTAD K M, LAMINA T, ERICKSON A, et al.Evaluation of dietary protein and amino acid requirements:A systematic review[J].The American Journal of Clinical Nutrition, 2025, 122(1):285-305.
[25] NIE C X, HE T, ZHANG W J, et al.Branched chain amino acids:Beyond nutrition metabolism[J].International Journal of Molecular Sciences, 2018, 19(4):954.
[26] CHEN L L, ZHONG Y, OUYANG X Q, et al.Effects of β-alanine on intestinal development and immune performance of weaned piglets[J].Animal Nutrition, 2023, 12:398-408.
[27] DE PALMA G, SHIMBORI C, REED D E, et al.Histamine production by the gut microbiota induces visceral hyperalgesia through histamine 4 receptor signaling in mice[J].Science Translational Medicine, 2022, 14(655):eabj1895.
[28] HOPE H C, SALMOND R J.The role of non-essential amino acids in T cell function and anti-tumour immunity[J].Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 2021, 69(1):29.
[29] LU J, WANG X Y, ZHANG W Q, et al.Comparative proteomics of milk fat globule membrane in different species reveals variations in lactation and nutrition[J].Food Chemistry, 2016, 196:665-672.
[30] WANG B, LI B.Effect of molecular weight on the transepithelial transport and peptidase degradation of casein-derived peptides by using Caco-2 cell model[J].Food Chemistry, 2017, 218:1-8.
[31] HU S, YUAN J L, GAO J Y, et al.Antioxidant and anti-inflammatory potential of peptides derived from in vitro gastrointestinal digestion of germinated and heat-treated foxtail millet (Setaria italica) proteins[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2020, 68(35):9415-9426.
[32] YU F M, HE K, DONG X Z, et al.Immunomodulatory activity of low molecular-weight peptides from Nibea japonica skin in cyclophosphamide-induced immunosuppressed mice[J].Journal of Functional Foods, 2020, 68:103888.
[33] VIENNOIS E, PUJADA A, ZEN J, et al.Function, regulation, and pathophysiological relevance of the POT superfamily, specifically PepT1 in inflammatory bowel disease[J].Comprehensive Physiology, 2018, 8(2):731-760.
[34] NING J T, YANG M, ZHU Q, et al.Revealing the diversity of endogenous peptides and parent proteins in human colostrum and mature milk through peptidomics analysis[J].Food Chemistry, 2024, 445:138651.