菜心(Brassica rapa var.parachinensis)作为华南地区广泛种植的叶类蔬菜,因其质地鲜嫩、营养丰富而备受消费者青睐。然而,在采后运输及贮藏过程中,菜心易遭受微生物侵染而发生各种病害,其中软腐病危害最为严重。感染软腐病的菜心组织初期呈现半透明水渍状,随后病害迅速蔓延至整个植株,并伴有脓黄色渗出液和不良气味,导致菜心品质急剧下降,造成显著经济损失[1]。果胶杆菌属(Pectobacterium spp.)是一类能引起果蔬采后软腐病的病原菌,广泛分布于植物、土壤和水体中[2]。该类细菌主要依靠分泌大量果胶酶、纤维素酶与蛋白酶分解细胞壁,进而吸收宿主营养物质。其中,果胶酶的作用尤为重要,它可造成细胞破裂并引发内容物渗漏,导致蔬菜的根部或茎部出现软腐症状,对作物产量与品质产生严重影响[3]。果胶杆菌属细菌包括胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum,Pc)、马铃薯黑腐果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum,Pa)、甜菜果胶杆菌(Pectobacterium betavasculorum,Pb)和山葵果胶杆菌。其中,Pc进一步分为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(P. carotovorum subsp. carotovorum,Pcc)、香花亚种(P. carotovorum subsp. odoriferum,Pco)和巴西亚种(P. carotovorum subsp. brasiliense,Pcb)[2]。Pa和Pb分别对马铃薯和甜菜具有宿主特异性[4],而Pcc主要引起茄子[5]、白菜[6]、马铃薯[7]和洋葱[8]等作物的软腐病。然而,关于采后菜心软腐病的病原菌尚未有系统报道。因此,对采后菜心软腐病病原菌进行分离鉴定并探索有效防控措施具有重要意义。
目前,菜心软腐病的防控策略主要集中在采前阶段。然而,采后菜心的贮藏和保鲜需要采用更安全、更有效的措施。因此,筛选绿色、安全的抗菌物质以防治采后软腐病具有重要实际意义。植物源活性物质(如酚类化合物和精油)已因具有安全、高效、低毒且副作用小的优势而受到关注[9]。例如,研究表明丁香油能有效防治采后羽衣甘蓝和洋葱的软腐病[10]。此外,生物防治作为一种潜在的化学防治替代方案也备受青睐,其中拮抗微生物的应用是一个重要方向。近年来,解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens, BA)已被广泛用于防治植物采后病害[11]。研究表明,BA S917在体外和体内均表现出显著的抗软腐病活性[12],而BA DSBA-11对假单胞菌属UTT-25具有显著的拮抗作用[10]。丁香酚(eugenol,EU)和BA都是安全性高的绿色保鲜剂,但各自优势和限制不同,因此,可根据不同场景选择使用。EU作为天然植物提取物,其安全性高于合成防腐剂,且具有成本低、操作简便、性质稳定等优点。然而,也需考虑其可能存在残留及影响产品风味的潜在风险[13]。BA是公认安全的微生物,无化学残留风险,符合绿色农业和有机农产品的高标准要求。但其活菌剂的规模化生产、制剂化及保质期成本可能较高[14];且应用时对环境有特定要求,高温高湿环境会导致其失活[14]。
本研究从自然腐烂菜心中分离并纯化病原菌,结合形态学观察、致病性测定、生理生化特性分析、16S rDNA序列比对及系统发育树构建,对其进行系统鉴定。同时,EU和BA作为抗菌因子,分别评估其对软腐病原菌的抑制作用及对菜心品质的维持效果,为采后菜心软腐病的防控提供理论依据与技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
实验选用菜心品种‘49’,中国湛江江南果蔬批发市场;EU,麦克林生化科技有限公司(上海);2×PCR Mix HiFi PCR Super Mix,北京全式金生物技术有限公司;拮抗菌解淀粉芽孢杆菌HY2-1(GenBank ID:MZ709015),广东海洋大学李昆太教授馈赠。
1.2 仪器与设备
YXQ-LX-70A立式压力蒸汽灭菌锅,上海云泰仪器仪表有限公司;BCM-1300A生物超净工作台,苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;KDC-160HR高速冷冻离心机,安徽中科中佳科学仪器有限公司;SPX-150C恒温培养箱,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;HZQ-F160立式恒温振荡培养箱,哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;UV-5500PC紫外可见分光光度计,上海元析仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 病原菌分离与纯化
病原菌分离参照HASAN等[15]的方法。从自然感染的菜心病变组织取样,用无菌手术刀切取感染部位,置于无菌烧杯中,加入无菌生理盐水[固液比1∶>5(g∶>mL)],于30 ℃、200 r/min振荡20 min。所得悬浮液进行10-1～10-8梯度稀释,各取10 μL涂布于果胶选择性培养基,30 ℃培养24 h。根据菌落周围果胶降解圈挑选单菌落进行纯化。纯化菌株与无菌甘油按1∶>1(体积比)混合,经液氮速冻后保存于-80 ℃。
1.3.2 形态学鉴定及革兰氏染色
形态学鉴定参照BARTHOLOMEW等[16]的方法。菌株在LB培养基中于30 ℃培养24 h后,观察并记录其菌落特征,包括大小、颜色、边缘形态、透明度、表面隆起及荚膜形成情况。
革兰氏染色时,取少量菌悬液滴于无菌载玻片,自然风干后通过火焰固定。依次以结晶紫染色、碘液媒染、乙醇脱色及番红复染,在光学显微镜下观察细菌形态。
1.3.3 病原菌的致病性测定
致病性验证采用科赫法则。实验选用新鲜、无破损、无病虫害的菜心。将每棵菜心底部第二片叶置于75%(体积分数)酒精溶液中浸泡30 s,随后用无菌水冲洗并移入铺有无菌滤纸的无菌培养皿中,培养皿内加入1 mL无菌水以保持湿度。使用无菌刀在菜心主脉中心制作十字形伤口(约2 mm×2 mm,深约1.5 mm),向切口接种10 μL 107 CFU/mL病原菌悬液,对照组接种等量无菌水。每个处理设3次重复。培养皿置于30 ℃恒温培养箱,每12 h观察并记录病症发展。
1.3.4 生理生化特性鉴定
菌株A1的生理生化特性参照《伯杰氏系统细菌学手册》进行鉴定。将菌株接种于结晶紫果胶(crystalline violet pectin,CVP)培养基,检测果胶降解能力;在KB(King’s B)培养基上培养后,于紫外光下观察荧光特性;通过明胶培养基评估明胶液化能力。同时,测定菌株在37 ℃的生长情况,以及在含5%和7%(质量分数)NaCl培养基中的耐盐性。此外,将菌株接种于含不同碳源(D-葡萄糖、甘露醇、D-果糖、甘油、蔗糖、半乳糖)的培养基,通过指示剂颜色变化判断产酸能力。
1.3.5 DNS法测定果胶酶活性
果胶酶活性采用DNS法测定,参照OUMER等[17]的方法。菌株以1%接种量接入50 mL LB液体培养基,30 ℃、200 r/min培养24 h后,9 000 r/min离心15 min,收集上清液作为粗酶液。测定体系包括2支试管,每管加入0.5 mL 5 mg/mL果胶溶液,于50 ℃水浴预热5 min后分别加入0.5 mL经1∶>3(体积比)稀释的粗酶液。其中一管于50 ℃水浴孵育15 min,另一管于沸水浴孵育15 min作为对照。孵育冷却后,加入1 mL DNS试剂,混匀后沸水浴5 min,冷却后补加8 mL蒸馏水。以蒸馏水为空白,在540 nm测定吸光度。以D-半乳糖醛酸绘制标准曲线(y=0.688 1x+0.040 7;R2=0.996 5)。果胶酶活性定义为每分钟催化释放1 μmol D-半乳糖醛酸的酶量(U/mL)。
1.3.6 软腐病病原菌的体外抗菌剂筛选
为评估抗菌剂对病原菌Pcc A1的抑制效果,检测了EU及BA的抑菌活性。EU处理体积分数设为0.1%、0.3%、0.6%、0.9%(体积分数);BA处理组菌悬液浓度为1×106、1×107、1×108、1×1011 CFU/mL。将10 μL Pcc A1菌悬液(1×107 CFU/mL)均匀涂布于LB琼脂平板,置入牛津杯后加入不同浓度EU和BA,于30 ℃培养24 h,测定抑菌圈直径(diameter of the inhibition zone,DIZ)。
最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(minimal bactericidal concentration,MBC)采用倍比稀释法测定[18]。将100 μL Pcc A1菌悬液(1×107 CFU/mL)与100 μL含不同浓度EU的LB液体培养基混合,30 ℃培养24 h后测定OD600nm值。BA处理组按1%接种量接入50 mL LB液体培养基,30 ℃培养72 h后,8 000 r/min离心10 min,取上清液于40 ℃、50 r/min条件下旋转蒸发浓缩至5 mL,经0.22 μm滤膜过滤并按二倍梯度稀释用于MIC测定。MIC定义为抑制可见细菌生长的最低浓度;将MIC下无生长的菌悬液(10 μL)接种于LB琼脂平板,30 ℃培养24 h,无菌落生长则确定为MBC。
Pcc A1的生长动力学参照ZHANG等[8]的方法测定。将1×107 CFU/mL菌悬液接入含不同浓度抗菌剂(0、1/2×MIC、1×MIC、2×MIC)的LB培养基,30 ℃培养,每2 h测定OD600nm值,以无抗菌剂组为对照。所有实验重复3次,取平均值分析。
1.3.7 抗菌剂对软腐病病原菌的体内抑制作用及菜心采后品质维持效果
菜心处理同1.3.3节,然后将不同浓度BA与EU接种于十字形伤口。待处理物干燥后,在伤口处加入10 μL浓度为1×107 CFU/mL的Pcc A1菌悬液。将培养皿密封,30 ℃培养2 d后观察菜心的发病情况。
在BA与EU处理后第2天,监测菜心叶脉软腐病的发病率及病斑直径,采用十字交叉法测量病斑直径,发病率的计算如公式(1)所示:
发病率
(1)
测量1、2 d的叶片失重率。失重率的计算如公式(2)所示,其中0 d质量为初始贮藏质量。
失重率
(2)
使用手持式折光仪测定法测定可溶性固形物含量。取2.0 g菜心组织放入研钵中研磨成浆,过滤后测定。重复测定3次,计算平均值和标准偏差。
叶绿素含量采用本团队之前的方法测定[19]。将0.1 g菜心组织浸泡在4 mL提取液[V(丙酮)∶>V(乙醇)=2∶>1]中,在4 ℃下过夜,在645 nm和663 nm处测量滤液的吸光值,叶绿素含量的计算如公式(3)所示:
叶绿素含量
(3)
式中:m为样品质量,g。
感官评价由10名经过培训的评价员(5男5女,年龄19～25岁)组成。所有评价员均通过味觉、嗅觉敏感度测试,且正式评价前均接受了关于菜心品质特性及评分标准的培训。每位评价员对所有样品进行3次重复评定,具体评定指标与标准见电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044307,下同)。
表1 菌株A1的生理生化鉴定结果
Table 1 Physiological and biochemical identifications of strain A1
检测项目 结果荧光检测-果胶利用+明胶液化+37 ℃生长+5% NaCl生长+7% NaCl生长+D-葡萄糖利用+麦芽糖利用-山梨醇利用-甘露醇利用+D-果糖利用+甘油利用+蔗糖利用+半乳糖利用+
注：“+”、“-”分别表示阳性、阴性反应。
1.3.8 16S rDNA和果胶酶基因PCR扩增
使用EasyPure Genomic DNA试剂盒提取基因组DNA。16S rDNA基因和果胶酶基因通过PCR扩增,使用通用引物。16S rDNA扩增引物为16S-qF(5′-TTACCGGAGCCCGAGCTGTGGCGT-3′)和16S-qR(5′-GGTGCGGTCGAGCGCTTCCGCTCA-3′);果胶酶基因扩增引物为Pcc-qF(5′-TTACCGGAGCCCGAGCTGTGGCGT-3′)和Pcc-qR(5′-GGTGCGGTCGAGCGCTTCCGCTCA-3′)。PCR反应体系为20 μL,包括1 μL DNA模板、0.5 μL正向引物、0.5 μL反向引物、8 μL 2×PCR Mix和10 μL无菌ddH2O。扩增程序遵循HiFi PCR Super Mix说明书。扩增产物由上海生工生物工程有限公司测序。
1.4 统计分析
实验结果均以“平均值±标准差”表示。统计分析使用SPSS 25.0软件进行,组间差异显著性通过邓肯多重比较法进行检验,显著性水平设定为P<0.05。使用Origin 2024绘制图表。
2 结果与分析
2.1 菜心软腐病的症状及病原菌的分离
在贮藏过程中,菜心易感染细菌性软腐病,主要侵染部位包括叶柄、枝条和茎部,表现出典型的软腐症状(图1-E和图1-F)。病斑初期呈浅褐色水渍状,随着病害发展,病斑颜色逐渐加深,并由初始感染部位向周围健康组织扩展(图1-B和图1-C)。最终,病原菌引发组织软化破裂,植株呈水渍状腐烂(图1-D),伴有明显恶臭气味。
A-0 h;B-48 h;C-72 h;D-96 h;E、F-局部症状
图1 常温下菜心软腐病的症状
Fig.1 Symptoms of soft rot in Chinese flowering cabbage
通过初筛(图2-A)与复筛(图2-B),共分离获得4株具有果胶酶活性的候选病原菌,这些菌株在刚果红果胶培养基上形成明显透明圈,分别命名为A1、A2、A3和A4。菌落形态主要为乳白色、圆形、中央微隆起(附表2)。在刚果红培养基上,4株菌均表现出果胶酶活性,降解圈直径分别为18、7、10、18 mm。其中,A1与A4的降解圈与菌落直径比值(Dp/Dc)分别为6.0和3.6,表明其果胶酶活性较强。
A-病原菌初筛;B-病原菌复筛;C-4株细菌果胶酶基因的PCR扩增
图2 病原菌的筛选及果胶酶基因的PCR鉴定
Fig.2 Screening of pathogenic bacteria and PCR identification of pectinase gene
2.2 病原菌株果胶酶基因的扩增、果胶酶活性测定及致病性评价
通过PCR扩增4株菌株的果胶酶基因,均获得约750 bp的阳性条带(图2-C),表明所有菌株均携带果胶酶基因。进一步测定A1、A2、A3和A4菌株接种后7 d内果胶酶活性的动态变化。如附图2-B所示,A1和A4的果胶酶活性在初期上升后略有下降,但整体维持较高水平;A2和A3的酶活性则持续下降,且2 d后始终低于A1和A4。具体而言,A1在第2～3天的果胶酶活性最高,达13.5 U/mL;A4在第4天达到峰值13.6 U/mL。
致病性实验显示,贮藏期间除对照组(control group,CK)外,A1、A2、A3和A4菌株在接种后48 h内均可导致菜心出现不同程度的病害(附图1)。接种24 h后,A1、A2和A4在伤口部位引发轻度褐变;36 h后,A3导致叶片发黄但无典型软腐症状,而A1、A2和A4在叶柄部位形成透明水渍状病斑。至48 h,A1、A2和A4诱导的软腐病灶显著扩大,其中A1致病性最强,导致叶柄组织完全软化、腐烂,并伴有明显恶臭。根据科赫法则,从发病组织中重新分离的菌株在LB培养基上的菌落形态与原始菌株一致,进一步确认其致病性。
2.3 16S rDNA 鉴定与系统发育分析
16S rDNA基因PCR扩增产物条带大小约为1 500 bp。NCBI BLAST分析表明(附表3),4株菌株分别隶属于不动杆菌属(Acinetobacter)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、欧文氏菌属(Erwinia)和果胶杆菌属(Pectobacterium)。其中,A1菌株与Pcc JB63的16S rDNA序列同源性为98.97%。基于高同源性序列,利用MEGA 7软件构建系统发育树,结果显示A1菌株与多个Pcc菌株聚为同一分支(图3-E)。上述结果确认A1为引起采后菜心软腐病的病原菌,隶属于Pcc亚种。
A、B-菌株A1在LB培养基上的菌落形态;C、D-革兰氏染色;E-系统发育树构建
图3 菌株A1形态学及系统进化分析
Fig.3 Morphological and phylogenetic analysis of strain A1
2.4 病原菌A1的形态学及生理生化特性分析
A1菌株在LB培养基上形成白色、圆形、中央略凸、表面光滑、半透明且边缘整齐的菌落(图3-A,图3-B)。革兰氏染色显示A1为红色杆状菌,表明其为革兰氏阴性菌(图3-C,图3-D),与果胶杆菌属典型特征一致。
生理生化分析表明(表1),A1菌株可在37 ℃、5% NaCl和7% NaCl条件下生长。在KB培养基上,A1未产生明显荧光或仅呈现微弱荧光。在CVP上,A1形成凹陷并伴随明显透明圈,显示出较强的果胶降解能力。此外,A1具有液化明胶的能力。碳源利用实验表明,A1可高效利用半乳糖、甘露醇、D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖和甘油产酸,但对麦芽糖和山梨醇的产酸能力较弱。
2.5 抗菌剂对病原菌A1的体外抑制效果
BA和EU对Pcc A1的抑菌效果如图4-A～图4-C所示。除0.1% EU外,其他浓度处理均能形成明显抑菌圈,并呈现一定的浓度依赖性。其中,BA在1×108 CFU/mL时DIZ最大,为2.13 cm;0.9% EU处理下的DIZ最大,为2.30 cm。
A-不同浓度BA和EU下的牛津杯实验;B-BA的DIZ;C-EU的DIZ;D-BA的MIC和MBC值;E-EU的MIC和MBC值;F-BA在1/2×、1×、2×MIC下的生长抑制效果;G-EU在1/2×、1×、2×MIC下的生长抑制效果
图4 BA和EU对A1菌株的体外抑菌效果
Fig.4 In vitro antibacterial effects of BA and EU against strain A1
注:数据表示为平均值±标准差(n=3),不同字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
A-体内抑菌效果(n=3);B-菜心发病率;C-病斑直径;D-感官评价;E-失重率;F-叶绿素含量;G-可溶性固形物含量
图5 BA和EU在不同浓度下对Pcc A1的体内抑制作用及最适浓度下对菜心品质的维持作用
Fig.5 In vivo inhibitory effects of BA and EU against Pcc A1 at different concentrations and their effects on the maintenance of quality in Chinese flowering cabbage at optimal concentrations
BA与EU的MIC和MBC如图4-D、图4-E所示。其中,BA的MIC为50%无细胞滤液,MBC为100%无细胞滤液;EU的MIC与MBC分别为0.1%和0.4%。Pcc A1的生长动力学分析结果表明,BA与EU的抑菌作用均呈浓度依赖性,并逐渐增强(图4-F、图4-G)。CK的OD600nm值随时间延长持续上升,表明细菌生长未受抑制。BA和EU在MIC下仍观察到部分细菌生长,但在2×MIC下则被显著抑制。
2.6 抗菌剂对病原菌A1的体内抑制效果及菜心品质维持作用
对照组菜心培养2 d后伤口部位出现明显水渍状腐烂并向周围扩展(图5-A)。不同浓度的BA和EU处理均在一定程度上延缓菜心软腐病的发生。施用1×108 CFU/mL BA时,培养2 d内仅观察到伤口轻微褐变,但无水嫩腐烂症状;而施用1×1011 CFU/mL BA处理腐烂程度加深,因此选用1×108 CFU/mL的BA进行后续品质维持实验。EU处理则随体积分数升高显著抑制病害,但0.9%下部分菜心叶片发黄,出现轻微药害,故后续采用0.6% EU开展相关实验。
接种病原菌2 d后,对照组病情指数为87.5%,而1×108 CFU/mL的BA和0.6% EU处理组分别为36.1%和37.5%(图5-B)。类似的,对照组的病斑直径为0.4 cm,BA和EU处理组分别为0.024 cm和0.124 cm(图5-C)。叶片的感官品质随时间延长而下降(图5-D),1 d内,对照组的感官评分开始下降,且明显低于其他组。而BA组感官评分较高,EU次之,表明菜心的品质得到了维持。
接种期间,菜心失重逐渐增加(图5-E)。对照组失重在第2天时增至0.63%,分别为BA组和EU组失重的1.94倍和1.91倍。菜心叶绿素含量在各组均呈持续下降趋势(图5-F)。至第2天,对照组降至0.11 g/kg(占0 d的28.9%),而BA和EU处理组在各时间点均显著高于对照,并且在第2天分别维持在0.24、0.20 g/kg。总可溶性固形物含量在对照组中随时间延长下降至1.9%(1 d)和1.5%(2 d),而BA与EU处理组在整个培养期均维持在2.7%以上(图5-G)。
3 结论与讨论
软腐病是采后菜心的常见病害,表现为组织表面褐色、水渍状且松软(图1),症状与十字花科蔬菜(如白菜)的软腐病症状相似[20]。在十字花科作物中,软腐病主要由Pcc引起,该细菌通过叶柄基部伤口侵入植物[1]。果胶是植物细胞壁胶层的重要成分,连接纤维素和半纤维素,维持组织结构[21]。软腐病菌通过分泌果胶酶分解果胶,导致组织软化并呈现水渍状腐烂[22]。基于贮藏期间菜心腐烂特征(图1),推测病原菌为具有果胶酶活性的细菌。因此,初筛采用刚果红果胶培养基替代LB培养基,以菌株果胶分解能力为依据,分离获得4株细菌(图2-A,图2-B)。PCR检测确认所有菌株均携带果胶酶基因(图2-C)。果胶酶是软腐病原菌的主要毒力因子,其活性在侵染早期体现。通过DNS法测定果胶酶活性及致病性实验发现,菌株A1和A4酶活性较高(附图2)。A1酶活性在第1、2天较高,符合侵染早期起到瓦解植物细胞壁的作用;而A4则是在第4、5、6天酶活性才达到最高值。致病性分析表明,A1菌株在菜心上诱发软腐病症状也较A4更为强烈(附图1)。16S rDNA序列分析显示,A2菌株与约翰逊不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)高度同源,A3菌株与西班牙金黄杆菌(Chryseobacterium hispalense)同源性最高(附表3)。这2种菌株通常与植物促生作用相关[23-24],但本研究发现A2和A3对菜心具有一定腐烂诱导能力,提示其在不同植物中的作用可能存在差异。A4菌株与土壤欧文氏菌(Erwinia soli)高度相似,属欧文氏菌属,该属菌株是采后蔬菜腐烂的主要病原菌之一。综合果胶酶基因序列、酶活性测定、16S rDNA测序及致病性分析,确认A1菌株为引起菜心软腐病的主要病原菌。系统进化树分析进一步将其鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌,命名为Pcc A1(图3-E)。
Pcc A1菌株的菌落形态、菌体形态、大小及颜色(图3-A～图3-D)与前人描述的Pcc亚种特征高度一致[25]。该菌株表现出广泛的碳源利用能力,可分解果胶(表1)并将其作为碳源,这是软腐病菌的典型特性[20]。菌株还具有液化明胶的能力(表1),表明其具备蛋白水解活性。碳源利用实验进一步确认,Pcc A1能够利用甘露醇、果糖、葡萄糖、山梨醇、蔗糖和甘油(表1),与Pcc亚种的生化特征一致[25]。文献报道,软腐病菌通过分泌果胶酶、纤维素酶和蛋白酶等降解植物细胞壁,引发典型软腐病症状[26]。本研究对Pcc A1的生化特性分析进一步证实其作为菜心软腐病病原菌的关键作用。
现有的软腐病防控措施主要集中在采前阶段,常用四环素、赤霉素和新霉素等农用抗生素处理[27]。然而,长期使用抗生素可能导致微生物抗药性,因此亟需开发绿色、安全的采后抑菌技术。芽孢杆菌作为一种重要的生防微生物,主要通过占据空间、竞争营养及分泌抗菌物质(如脂肽、聚酮和挥发性有机化合物等)来抑制病原菌生长[28]。本研究使用的解淀粉芽孢杆菌HY 2-1从北部湾沉积物中分离,具较广谱抗菌活性[28]。实验表明,BA在体内外均对Pcc A1表现出显著抑制作用,其最大DIZ及病斑直径分别为2.13 cm和0.024 cm(图4-B,图5-C)。在体外实验中,牛津杯周围形成透明抑菌圈,表明BA可能通过占据生存空间和竞争营养,同时分泌抗菌代谢物,直接抑制Pcc A1的生长。体内实验中,BA处理组病斑直径显著小于对照组,提示其有效削弱了病原菌的侵染能力。值得注意的是,本研究中高浓度BA(1×1011 CFU/mL)的体内抑菌效果减弱,其可能机制包括:BA的抗菌次级代谢产物的合成通常受群体感应系统精确调控,高浓度下群体感应调控失衡[12],可能触发代谢途径重编程,使资源从抗菌代谢产物合成转向孢子形成等,降低抑菌物质产量。其次,超高浓度菌体快速消耗营养与氧气[12],引发激烈的种内竞争,并可能积累对自身有害的代谢产物(如有机酸),反而抑制自身的生长与功能。此外,大量菌体形成致密生物膜[14],阻碍抗菌物质扩散作用。类似的,相关研究结果表明1×107 CFU/mL BA FT5可显著抑制番茄软腐病,但更高浓度却无明显抑制效果[14]。植物精油是一类天然植物提取物,其安全性和群众认可度高于合成防腐剂[9]。本研究采用的EU是丁香精油中发挥抑菌作用的主要活性成分。本研究结果显示,EU在较高浓度(≥1 MIC)显著抑制Pcc A1生长,2×MIC下完全抑制菌体生长,并在14 h培养期间保持稳定(图4-G)。体外果胶酶测定显示,未经处理的Pcc A1在7 d内果胶酶活性维持较高水平(附图2-B),而体内实验中对照组病斑显著大于EU组,提示EU可能通过降低其果胶酶分泌能力来抑制Pcc A1生长及代谢,从而缓解菜心软腐病的发生。这一结果与前人关于精油抑制病原菌毒力因子和胞内物质泄露的机制一致:SUN等[29]报道表明,EU能够显著抑制百香果中可可毛色二孢菌的菌丝生长和孢子萌发,并导致病原菌的电导率升高、核酸释放以及蛋白质和可溶性糖含量增加,提示其可能通过破坏细胞膜结构干扰病原菌代谢。此外,测定了最适浓度BA和EU对采后菜心的感官品质的影响。结果表明,1×108 CFU/mL的BA和0.6% EU处理均能延缓采后菜心接种Pcc A1后的腐烂和失重率的增加,抑制叶绿素含量和可溶性固形物含量的下降,从而维持更好的感官品质。上述结果表明,BA和EU能够通过抑制软腐病原菌的生长来降低采后菜心软腐病的发生,可以作为防治采后菜心软腐病的备选抑菌剂。
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