口腔是外界病原体入侵人体的途径之一,其健康状态与人体健康状态密切相关[1]。根据第四次全国口腔健康流行病学调查结果显示,虽然我国居民的口腔健康素养总体有所提升,但我国儿童乳牙和恒牙龋患率呈明显上升趋势,中老年人群的牙周健康水平与口腔卫生状况呈现显著下降趋势,龋病和牙周病等口腔疾病已成为当前我国居民普遍面临的健康问题。口腔是人体消化系统的起始部位,口腔健康容易受到多种内源性和外源性因素的干扰,包括口腔微生物、外界环境、营养状态以及年龄等各项因素,其中主要与口腔微生物有关[2]。口腔中种类繁多的细菌多以生物膜形式存在,几乎所有口腔疾病都是由多物种微生物群落组成的牙菌斑生物膜引起[3]。在唾液和龈上菌斑中,主要的微生物为革兰氏阳性菌,例如链球菌属和放线菌属;而在龈下菌斑中,则以革兰氏阴性菌为主导,常见如牙龈卟啉单胞菌、放线杆菌及齿垢密螺旋体等[4-5]。口腔微生物群落与宿主免疫系统之间维持动态平衡。然而,当机体受到外界刺激或处于免疫功能低下状态时,口腔微生态结构可能发生紊乱或生物量异常增加,导致微生物-免疫平衡被破坏,进而引发多种口腔问题[6]。
抗菌肽(antibacterial peptides, AMPs),一般由10～100个氨基酸组成,是一类具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤活性的小分子多肽,是生物体免疫系统的重要组成之一[7]。AMPs因具有广谱抗菌活性和较低耐药性,通过膜靶向和非膜靶向2种类型发挥抗菌作用,目前已成为抗生素的重要替代品[8]。与天然AMPs相比,人工AMPs克服了其生产成本较高、制备周期较长,难以实现规模化生产等问题[9]。李剑勋等[10]和易华西等[11-16]根据现有抗菌肽数据库从中筛选出对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有抑菌作用843条广谱抗菌肽,通过系统分析其序列参数(长度、电荷、疏水性及氨基酸组成),并遵循“出现频率最大”原则结合生物信息学预测及分析工具,最终从头设计出新型YHX系列低分子量抗菌肽。研究证明,YHX系列抗菌肽均具有广谱抗菌活性,并指出YHX-5和YHX-2能通过膜渗透作用发挥抗菌作用。YHX系列抗菌肽具有高效抗菌、分子质量低等优点,有望作为一种生物抗菌剂应用于食品防腐保鲜和医药卫生领域。在此基础上,本实验通过探究YHX系列人工AMPs对口腔致病菌的抑制作用以及安全性评价,为人工AMPs的多元化提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、变异链球菌(Streptococcus mutans),中国海洋大学功能性乳品与益生菌实验室;具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum BNCC 337608),北纳生物科技有限公司。
YHX序列抗菌肽来源本团队所设计的人工合成抗菌肽[11-16],由合肥森尔生物科技有限公司合成,纯度高于95%,抗菌肽冻干粉保存于-20 ℃条件下。其中,YHX-1[11]的序列为GKLLSKLLKKLLK;YHX-2[12]的序列为LKLLSKLLGKLLK;YHX-3[13]的序列为LKLLSKLLKKLLK;YHX-4[14]的序列为WKLLSKLLGKLLK;YHX-5[15]的序列为GKLLSKLLGKLLK;YHX-7[16]的序列为GFSKLLSWFGSLL。
小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7),中国海洋大学功能性乳品与益生菌实验室;枸橼酸钠抗凝无菌兔血,上海鸿泉似锦生物科技有限公司;TritonX-100、1%结晶紫染色液,北京索莱宝科技有限公司;氯化血红素、维生素K1,上海麦克林生化科技股份有限公司;液体硫乙醇酸盐培养基、BHI肉汤培养基、琼脂粉、DMEM培养基,青岛海博生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
SHP-250生化培养箱,上海精宏实验设备有限公司;VEGA3扫描电子显微镜,捷克TESCAN公司;Multiskan FC酶标仪,美国赛默飞世尔科技公司;LDZX-75KBS立式高压蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂;TG20KR-D高速冷冻离心机,长沙东旺实验仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 琼脂扩散法测定抑菌活性
采用琼脂扩散法[17]进行抑菌实验。分别将牙龈卟啉单胞菌、变异链球菌和具核梭杆菌接种于BHI特殊培养基(添加氯化血红素和维生素K1)、BHI肉汤培养基及液体硫乙醇酸盐培养基中,置于37 ℃恒温培养箱培养18 h。将牛津杯放置在培养皿中,取7 μL菌液加入冷却至45～50 ℃的半固体培养基中,混匀后倒入培养皿中,冷却定型后取出牛津杯,形成均匀孔洞,向孔中加入160 μL系列抗菌肽溶液(3 mL超纯水中溶解1 mg抗菌肽),做好标记37 ℃继续培养24 h。最后,测量抑菌圈直径,实验重复3次,取平均值作为最终结果。
1.3.2 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测定
参考李剑勋等[10]的方法,按照二倍稀释法,将抗菌肽溶液用无菌PBS缓冲液(pH=7.4)分别稀释为8个倍比浓度(4～512 μg/mL)备用,将3种细菌菌悬液与不同浓度各组抗菌肽溶液各50 μL接种于96孔板内,以未用抗菌肽处理的菌液作为对照组,37 ℃培养24 h后,测量各孔在600 nm的吸光度,并结合以肉眼观察无沉淀或浑浊,取完全没有菌株生长的最低浓度作为抗菌肽的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)。
最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC)是指杀菌率达99%的最低药物浓度。通过涂布接种法测定实验结果,从所有未见菌株生长的孔中分别吸取50 μL溶液进行涂布处理,37 ℃恒温培养24 h后计算菌落数。
1.3.3 结晶紫染色法观察对口腔致病菌生物膜形成的抑制作用
将变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌培养至对数生长期,调整菌液浓度至1×106 CFU/mL。将无菌细胞爬片放置48孔板底部,分别加入0.5 mL单一变异链球菌菌液或牙龈卟啉单胞菌与具核梭杆菌共培养菌液。再分别加入终浓度为0.5×MIC、1×MIC、2×MIC和4×MIC的系列抗菌肽溶液,对照组则加入等体积生理盐水,于37 ℃恒温孵育48 h。孵育结束后,使用PBS缓冲液冲洗掉浮游态菌,每孔加入500 μL 70%(体积分数)甲醇溶液固定生物膜15 min,使用PBS清洗缓冲洗掉固定液。随后,每孔加入500 μL 1%(质量分数)结晶紫溶液,室温染色生物膜5 min,用蒸馏水轻柔冲洗3次并晾干。最后,每孔加入500 μL 33%(体积分数)冰醋酸溶液,溶解5 min后,于570 nm下测定吸光度值。
1.3.4 测定最小抑制生物膜浓度
向96孔板中加入活化至第二代的变异链球菌单一菌液或牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌共培养菌液50 μL,同时在孔中加入各浓度梯度AMPs溶液(同1.3.2节)50 μL,并以空白培养基作为空白对照组,未加抗菌肽的菌液作为阴性对照组。在37 ℃恒温培养箱培养48 h后,采用1.3.3节的方法对培养好的生物膜进行处理,用酶标仪测定OD570nm光密度值,以抑制50%生物膜生长所需的最低AMPs浓度定义为最小抑制生物膜浓度(minimal biofilm inhibitory concentration, MBIC)。
1.3.5 扫描电镜(scanning electron microscopy, SEM)观察抗菌肽处理后细菌表面形态变化
参考阿尔曼·阿卜力孜等[18]的方法并进行调整,将无菌细胞爬片放置48孔板底部,将3种口腔致病菌培养至对数生长期,向菌液中加入终浓度为2×MBIC的YHX-5肽溶液,在37 ℃下培养48 h形成生物膜,以不加抗菌肽处理作为对照组。使用PBS缓冲液洗涤生物膜,加入2.5%(质量分数)戊二醛固定生物膜过夜,用不同梯度的乙醇将样品进行脱水处理。接着采用V(100%乙醇)∶V(叔丁醇)=1∶1以及纯叔丁醇各处理1次。使用临界点干燥法对样品进行干燥。之后进行喷金处理,最后通过扫描电镜放大成像。
1.3.6 细胞毒性测定
将RAW264.7细胞复苏后在含有10%(体积分数)胎牛血清和1%(质量分数)青霉素链霉素混合液的DMEM培养基中,在37 ℃、5% CO2条件下传代培养。以1×104cells/mL的密度将细胞接种于96孔板中,培养24 h。去除旧培养基,加入200 μg浓度同1.3.2节的抗菌肽溶液处理24 h。去除原培养基及未贴壁细胞,用PBS冲洗3次。配制实验所需CCK-8工作液(每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液)并进行加样,37 ℃孵育2 h。然后吸取100 μg/孔培养基混合液至96孔板中,酶标仪450 nm下检测样本的OD值。以未经处理的细胞作为对照组,空白DMEM培养基作为空白组,计算细胞存活率。细胞存活率的计算如公式(1)所示:
(1)
式中:R1,细胞存活率,%;B1,实验组OD值;B2,对照组OD值;B3,空白组OD值。
1.3.7 溶血活性测定
枸橼酸钠抗凝无菌兔血经4 000 r/min离心10 min后收集红细胞沉淀,使用无菌PBS缓冲液(pH=7.4)重复洗涤3次并重悬细胞。在96孔板中分别加入100 μL梯度浓度同1.3.2节的抗菌肽溶液,并与等体积重悬红细胞共孵育,以加入0.1% TritonX-100为阳性对照,加入PBS缓冲液为阴性对照。37 ℃恒温孵育1 h 后,离心取上清液,于570 nm处测定OD值,以评估抗菌肽的溶血活性。溶血活性的计算如公式(2)所示:
(2)
式中:R1,抗菌肽溶血率,%;A1,实验组OD值;A2,阳性对照组OD值;A3,阴性对照组OD值。
1.4 数据处理
所有实验均独立重复至少3次,结果以“平均值±标准差”表示。采用SPSS 27软件进行单因素方差分析,以P<0.05为差异具有统计学显著性。使用Origin 2019完成图表绘制,图中不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。
2 结果与分析
2.1 琼脂扩散法测定抑菌活性
通过琼脂扩散法对抗菌肽的抗菌活性进行了测定,实验结果如图1所示,抑菌圈直径汇总结果如表1所示。本实验选择3种常见口腔致病菌,变异链球菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌为指示菌抑菌圈直径越大代表抗菌活性越强。6种抗菌肽均对3种口腔致病菌具有抑制作用。YHX-1、YHX-5对变异链球菌的抑制活性显著高于其他4种抗菌肽,YHX-5对变异链球菌的抑菌圈直径最大,为19.42±1.18;YHX-5对具核梭杆菌的抑制活性显著高于其他抗菌肽,其抑菌圈直径为23.83±1.04;6种抗菌肽对牙龈卟啉单胞菌的抑制效果相对较差,仅YHX-7对牙龈卟啉单胞菌抑菌圈直径较大,为11.86 mm。整体来看,YHX-5抗菌肽对3种口腔致病菌的抑菌活性最强,其中对具核梭杆菌的抑菌效果最好。
表1 抗菌肽对口腔致病菌的抑菌圈直径
Table 1 Inhibition zone diameters of antimicrobial peptides against oral pathogenic bacteria
抗菌肽编号抑菌圈直径/mm变异链球菌具核梭杆菌牙龈卟啉单胞菌YHX-118.80±0.63a20.44±0.26b7.43±1.12bYHX-216.33±0.22b20.94±0.46b7.82±0.31bYHX-315.43±0.19b19.16±0.60c7.26±0.07bYHX-410.43±0.37d14.92±0.61e9.00±0.11bYHX-519.42±1.18a23.83±1.04a7.51±0.01bYHX-713.93±1.08c17.31±0.51d11.86±0.83a
注：表中不同字母表示存在显著差异(P<0.05)。
图1 抗菌肽的抑菌圈验证结果
Fig.1 Inhibition zones of antimicrobial peptides
2.2 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度
根据微量肉汤稀释法测定了6种抗菌肽对3种口腔致病菌的MIC和MBC,结果如表2所示。实验结果表明,6种抗菌肽对变异链球菌和具核梭杆菌均表现出良好的抗菌活性,其MIC值为4～32 μg/mL,MBC值为16～256 μg/mL;而对牙龈卟啉单胞菌的抑菌活性相对较弱,其MIC值为64～256 μg/mL。此外,各抗菌肽的MBC值普遍为其MIC值的1～4倍,与已有研究结果一致[19-20]。
表2 抗菌肽对口腔致病菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度
Table 2 MIC and MBC of antimicrobial peptides against oral pathogenic bacteria
抗菌肽编号变异链球菌/(μg/mL)具核梭杆菌/(μg/mL)牙龈卟啉单胞菌/(μg/mL)MICMBCMICMBCMICMBCYHX-1166441664128YHX-2321283264128>256YHX-316128161664256YHX-4322563264128>256YHX-516323232128>256YHX-732323232256>256
2.3 结晶紫染色法观察对口腔致病菌生物膜形成的抑制作用
2.3.1 抗菌肽对变异链球菌生物膜形成的抑制作用
6种抗菌肽对变异链球菌生物膜形成的抑制作用均表现出浓度依赖性,结果如图2所示。多数抗菌肽在不同浓度下对变异链球菌生物膜形成的抑制作用具有显著性差异,仅YHX-2(图2-B)、YHX-4(图2-D)虽然呈现出浓度依赖性,但不存在显著性差异(P>0.05);在4×MIC浓度下,YHX-1、YHX-2、YHX-3、YHX-4、YHX-5和YHX-7均显示出较强的抑制效果,其抑制率均超过60%。其中,YHX-1、YHX-5和YHX-7对生物膜形成的抑制效果尤为显著,抑制率分别达到96.00%、86.67%和93.00%。
A-YHX-1;B-YHX-2;C-YHX-3;D-YHX-4;E-YHX-5;F-YHX-7
图2 不同浓度的抗菌肽对变异链球菌生物膜的抑制活性
Fig.2 Inhibitory activity of antimicrobial peptides with different concentrations against Streptococcus mutans biofilms
注:不同字母表示存在显著差异(P<0.05)。
2.3.2 抗菌肽对具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌共培养生物膜形成的抑制作用
6种抗菌肽对具核梭杆菌与牙龈卟啉单胞菌共培养生物膜的形成均表现出浓度依赖性的抑制作用(图3)。在4×MIC浓度下,YHX-1～YHX-7系列抗菌肽对该共培养生物膜的抑制率均高于85%。其中,YHX-3、YHX-5和YHX-7的抑制效果尤为显著,抑制率分别达到95.00%、98.58%和98.09%,均超过95%。有研究表明,天然药植物石榴皮中常见活性成分鞣花酸在4 g/L时可以抑制50%以上的牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌单菌生物膜的形成[21]。值得注意,YHX-5在较低浓度(0.5×MIC)下即表现出较强的抑制活性,对共培养生物膜的抑制率已超过90%,显示出良好的抑菌潜能。
A-YHX-1;B-YHX-2;C-YHX-3;D-YHX-4;E-YHX-5;F-YHX-7
图3 不同浓度的抗菌肽对具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌共培养生物膜的抑制活性
Fig.3 Inhibitory activity of antimicrobial peptides at different concentrations against dual-species biofilms of Fusobacterium nucleatum and Porphyromonas gingivalis
2.4 最小抑制生物膜浓度
采用微量肉汤稀释法测定了6种抗菌肽的MBIC。由表3可知,所有抗菌肽对3种口腔致病菌的生物膜形成均表现出抑制活性,其MBIC值均低于64 μg/mL。其中,YHX-5的抑制效果最好,对具核梭杆菌与牙龈卟啉单胞菌共培养生物膜的MBIC为16 μg/mL,对变异链球菌生物膜的MBIC为4 μg/mL。
表3 抗菌肽对口腔致病菌的最小抑制生物膜浓度
Table 3 MBIC of antimicrobial peptides against oral pathogenic bacteria
抗菌肽编号MBIC/(μg/mL)变异链球菌具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌YHX-1832YHX-2832YHX-3864YHX-4832YHX-5416YHX-7864
2.5 扫描电镜观察抗菌肽处理后生物膜表面形态变化
使用扫描电镜观察YHX-5处理后变异链球菌单一生物膜、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌共培养生物膜表面的形态变化,结果如图4所示。YHX-5能够抑制变异链球菌生物膜、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌共培养生物膜的形成。对照组菌体生物膜密集且厚实,而经YHX-5处理后的实验组生物膜量减少,甚至没有生物膜存在。进一步发现,与对照组的菌体相比,经YHX-5处理后的菌体部分表面细胞变形,出现凹陷和破洞,菌体结构完整性被破坏,表明YHX-5可有效抑制菌体生物膜中细菌的完整性,最终导致生物膜结构的崩解。
A1、A2、A3-变异链球菌生物膜对照组;B1、B2、B3-变异链球菌生物膜实验组;C1、C2、C3-具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌共培养生物膜对照组;D1、D2、D3-具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌共培养生物膜实验组
图4 扫描电镜观察抗菌肽对变异链球菌生物膜和具核梭杆菌与牙龈卟啉单胞菌共培养生物膜的抑制效果
Fig.4 Scanning electron microscopy analysis of the inhibitory effects of antimicrobial peptides on single-species biofilms of S.mutans and dual-species biofilms of F.nucleatum and P.gingivalis
2.6 细胞毒性
目前研究表明,多数抗菌肽仍存在较高的哺乳动物细胞毒性[22]。例如,α-鹅膏毒肽[23]在2 500 μg/mL浓度下可使人正常肝细胞活力下降超过50%;抗菌肽Mastoparan-C新型类似物L1GA5K[24]在64 μg/mL质量浓度下即可导致肾小管上皮细胞和肾小球系膜细胞活力均低于60%。本研究采用CCK-8法评估了不同浓度抗菌肽对RAW264.7细胞的毒性作用,结果如图5所示,各抗菌肽对RAW264.7细胞的毒性效应均表现出明显的浓度依赖性。在质量浓度低于32 μg/mL时,各抗菌肽均显示出较低的细胞毒性,细胞存活率均维持在70%以上。当肽质量浓度升高至32 μg/mL以上时,经YHX-3和YHX-4处理的RAW264.7细胞存活率急剧下降,在128 μg/mL时已低于10%,表明其细胞毒性较强。而在相同低浓度条件下(≤32 μg/mL),YHX-1、YHX-2、YHX-5、YHX-7处理组的细胞存活率均超过80%。尤其值得注意的是,YHX-5和YHX-7在128 μg/mL质量浓度下仍保持50%以上的细胞存活率,显示出相对更低的细胞毒性。
图5 抗菌肽对RAW264.7的细胞毒性
Fig.5 Cytotoxicity of antimicrobial peptides towards RAW264.7 cells
2.7 溶血活性
测定了6种抗菌肽的溶血活性,结果如图6所示。该结果与细胞毒性趋势基本一致,各抗菌肽对兔血红细胞的溶血活性也表现出浓度依赖性。YHX-4和YHX-7在质量浓度高于32 μg/mL时表现出显著溶血作用。当质量浓度达到256 μg/mL时,两者的溶血率分别高达90.33%和102.26%,显示出强烈的溶血活性。相比之下,YHX-1、YHX-3和YHX-5在最高测试质量浓度256 μg/mL下,对兔血红细胞的溶血率均低于10%。值得关注的是,YHX-5在256 μg/mL质量浓度下的溶血率仅为2.24%,远低于文献报道的人工合成抗菌肽Loong-3在相近质量浓度(250 μg/mL)下对鸡血红细胞大于70%的溶血率[25]。结合2.1和2.2实验结果,表明YHX-5具有较优的细胞选择性。
图6 抗菌肽的溶血活性
Fig.6 Haemolytic activity of antimicrobial peptides
3 结论
本研究系统评估了6种YHX系列抗菌肽对3种口腔致病菌(变异链球菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌)的抑菌作用及其生物安全性。结果表明,所有测试抗菌肽均能有效抑制上述病原菌及其生物膜的形成,对变异链球菌和具核梭杆菌的MIC为4～32 μg/mL,MBC为16～256 μg/mL。YHX-5对3种致病菌均表现出较强的抑菌活性,对具核梭杆菌的抑制效果最为显著,抑菌圈直径达到(23.83±1.04) mm,对变异链球菌生物膜的MBIC低至4 μg/mL,可能通过使菌体表面发生细胞变形和破裂,从而达到有效抑制菌体生物膜的效果。细胞毒性及溶血实验表明,YHX-5在128 μg/mL质量浓度下细胞存活率仍维持在50%以上对兔血红细胞的溶血率均低于10%。综合以上结果,YHX-5抗菌肽兼具优良的抗菌活性、低溶血毒性与低细胞毒性,显示出作为口腔抗菌剂的潜在应用价值。
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