聚苹果酸[poly (β-L-malic acid), PMLA]是一种以L-苹果酸为单体构成的水溶性脂肪族聚酯,具有优良的生物相容性、可降解性、无免疫原性及可修饰性,在药物递送系统和生物医学材料领域展现出广阔的应用前景[1]。目前,PMLA的化学合成方法因成本高、污染重且难以规模化而受限,相比之下,微生物发酵法凭借其高产率、高光学纯度和环境友好等优势,成为更具潜力的生产策略。在各类生产菌株中,短梗霉菌属(Aureobasidium spp.)作为一种重要微生物,具有良好的PMLA合成能力。
L-苹果酸是PMLA合成的前体物质,其主要代谢来源包括三羧酸循环、丙酮酸羧化途径和乙醛酸循环。研究表明,不同菌株中PMLA合成的主导代谢路径存在差异。例如,在产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)GXZ-6中,乙醛酸循环是苹果酸生成的主要途径[2]。由于代谢网络的复杂性,构建基因工程菌株仍存在攻克难点,因此通过添加外源代谢促进剂调控关键酶活性成为提高PMLA产量的有效手段[3]。已有研究显示,乙酸盐能够显著增强乙醛酸循环中的关键酶异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase,ICL),在谷氨酸棒状杆菌和分枝杆菌中的活性,进而强化乙醛酸循环通量和苹果酸合成[4]。
目前关于乙酸盐在Aureobasidium spp.中调控PMLA生物合成的系统性研究仍较缺乏,其对中心代谢网络及基因表达水平的影响尚未明确。因此,本研究以产黑色素短梗霉为对象,通过筛选乙酸盐种类与优化添加浓度,结合代谢组学与转录组学,深入揭示乙酸盐对PMLA合成的影响机制,旨在为微生物高效合成PMLA的发酵工艺开发提供理论依据与实践策略。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
产黑色素短梗霉,中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为:CGMCC NO.18996。
1.1.2 试剂
蔗糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、丁二酸、硫酸铵、碳酸钾、硝酸钠、硫酸镁、硫酸锰、碳酸钙、乙腈,国产分析纯。
1.1.3 培养基
种子培养基(g/L):蔗糖60,酵母膏3,丁二酸2,(NH4)2SO41,K2CO3 0.4,MgSO4 0.1,ZnSO40.05,0.1%(体积分数)玉米浆,121 ℃下灭菌20 min。
发酵培养基(g/L):蔗糖180,蛋白胨35,KH2PO4 0.1,NaNO3 2,MgSO4 0.3,KCl 0.5,MnSO40.05,CaCO320,pH自然,121 ℃下灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
ZWYR-D2403恒温培养振荡器,上海智城分析仪器制造有限公司;LC-20A液相色谱仪,日本岛津公司;Agilent 7980 A/5975 C安捷伦气质联用仪,安捷伦科技有限公司;TCL-12台式高速冷冻离心机,中科院生物物理所技术服务公司;四联5 L发酵罐,镇江格瑞生物工程有限公司;LRh-250A生化培养箱,韶关市泰宏医疗器械有限公司;SBA-40E生物传感分析仪,山东省科学院生物研究所。
1.3 实验方法
1.3.1 发酵条件
用适量无菌水将活化好的斜面菌株的孢子洗下来制备成孢子菌悬液,接种到含有100 mL种子培养基的500 mL锥形瓶中,于恒温摇床200 r/min,培养约40 h,制备种子液。将种子液接种到发酵培养基中,接种量10%(体积分数),于恒温摇床25 ℃、200 r/min条件下发酵168 h。在5 L发酵罐中,3 L的发酵培养基,在25 ℃下条件下发酵168 h,搅拌速度450 r/min,通风速率1.2 vvm。
1.3.2 发酵参数测定方法
1.3.2.1 菌体量测定
参照文献[5]的方法,进行菌体量测定。
1.3.2.2 发酵液中PMLA的测定
参照文献[5]的方法,进行发酵液中PMLA含量的测定。
1.3.3 ICL活性测定
采用BCA法微量蛋白质浓度测定试剂盒对细胞内蛋白质含量进行测定,使用ICL活性检测试剂盒,对经过液氮研磨后的粗酶液进行检测[6]。按照说明书测得初始吸光度值A1,样本吸光度A2,计算ΔA=A1-A2。ICL活力的单位定义为每毫克组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1 nmol的NADH定义为1个酶活力单位。其计算如公式(1)所示:
ICL/(U/mg prot)=ΔA×2 297/Cpr
(1)
式中:Cpr,样本蛋白质量浓度,mg/mL。
1.3.4 代谢组学实验方法
参照文献[7]的方法,进行样品处理、GC-MS的检测及数据处理。
1.3.5 转录水平分析实验方法
1.3.5.1 样品制备
以添加3 g/L乙酸钾的发酵培养基为实验组,基础发酵培养基为空白组,于恒温摇床发酵培养产黑色素短梗霉,获得发酵液。
1.3.5.2 RNA提取及样本检测
参照文献[5]的方法,进行RNA提取及样本检测。
1.3.5.3 数据统计分析
参照文献[5]的方法,进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 乙酸盐种类及质量浓度对PMLA合成的影响
摇瓶研究不同乙酸盐对PMLA产量的影响。结果如图1所示,添加乙酸钾对PMLA产量有较大提高,其产量为55.5 g/L,较空白组提高了23.91%。添加乙酸钾后,单位菌体产率为1.41 g/g,较空白组提高了36.67%。并对乙酸钾的最适添加质量浓度进行单因素优化,结果如图1所示,乙酸钾最适添加质量浓度为3 g/L。
a-乙酸盐种类对PMLA合成的影响;b-乙酸钾的最适添加质量浓度
图1 乙酸盐对PMLA合成的影响
Fig.1 Influence of acetate on synthesis of PMLA
2.2 在5 L发酵罐中添加3 g/L乙酸钾的发酵验证
在5 L发酵罐中研究乙酸钾对PMLA发酵过程影响的作用机制,结果如图2所示。添加3 g/L乙酸钾促进了A.melanogenum的生长和PMLA的合成。在96 h时,实验组和空白组PMLA产率最大,实验组的PMLA产量为44.57 g/L,比空白组提高19.27%(图2-d)。发酵168 h后,PMLA产量达到59.98 g/L,比空白组提高了121.53%(图2-a)。实验组在添加了乙酸钾后菌体量整体增加(图2-b)。同时,在该阶段,菌体的比生长速率呈先增长后降低的趋势,实验组到60 h时达到最大为0.63 g/(L·h);空白组在72 h达到最大为0.58 g/(L·h)(图2-c)。
除此之外,实验组的单位菌体PMLA生产效率均呈现先快速增加,随后趋于平稳的变化趋势,实验组的单位菌体PMLA生产效率在96 h达到最大,为1.05 g/g,空白组的单位菌体PMLA生产效率在72 h达到最大,为0.96 g/g(图2-d)。从实验组和空白组的单位菌体PMLA生产效率可以看出,菌体在添加乙酸钾的环境中合成能力得到了提升。
a-PMLA产量;b-菌体生物量;c-单位时间PMLA生产强度;d-单位菌体PMLA生产效率
图2 5 L发酵罐上乙酸钾对PMLA的影响
Fig.2 Influence of potassium acetate on PMLA in 5 L fermenters
2.3 乙酸钾对PMLA合成的代谢组学研究
2.3.1 胞内代谢物的差异性分析
在上述试验基础上,利用GC-MS对A.melanogenum胞内物质进行检测分析,将差异代谢物进行了主成分分析(principal component analysis,PCA),并应用正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partialleast squares discriminant analysis,OPLS-DA),进行了多元统计[8]。得到的PCA与OPLS-DA得分图(图3)、主要得分数据(表1)显示了2组代谢物之间的明显差异。
a-样品的PCA得分图;b-样品的OPLS-DA得分图
图3 样品的PCA及OPLS-DA得分图
Fig.3 PCA and OPLS-DA score plots of the samples
表1 交叉验证的主要统计学数据
Table 1 Statistical data from PLS-DA at different culture conditions
时间/h组别R2Q24810.900.817210.980.889610.990.96
注:R2为拟合优度;Q2为预测能力。
本实验将48、72、96 h时间点取样并测定的数据导入MetaboAnalyst网站进行数据处理[6]。由PCA得分图可知,不同时间点处的PCA得分均为50%～100%,说明模型的拟合度较好,选用的PCA模型可靠性较高。组内3个平行样品点的分布较为密集,说明组内差异较小,样品平行性较好;而组间差异显著,说明从PCA得分图中可以看出添加乙酸钾确实使得菌体的胞内代谢在48、72、96 h出现差异。由OPLS-DA得分图可知,实验组和空白组的样本能相互分开,而且能在各自的置信区间内聚集,有的样本点还出现重叠的情况,表明了该模型的建模能力和预测能力均较好,同时也说明2组样本的代谢差异性显著,此结果与PCA分析结果一致。
为进一步说明模型的真实与可靠性,又分析了交叉验证的结果,如表1所示。在不同的时间点下,OPLS-DA模型的拟合优度R2都接近于1,预测能力Q2都在0.8以上,表明实验结果理想,模型真实可靠。
为分析培养基中是否添加乙酸钾2种情况下,不同时间点代谢物的差异性,通过OPLS-DA模型中的变量在预测中的重要性(variable important in projection,VIP)图寻找差异代谢物质。
由图4可知实验组与空白组3个时间点的显著差异代谢物情况,发酵48 h的显著差异代谢物依次为β-D-半乳糖呋喃糖苷、磷酸、β-L-吡喃半乳糖苷、丙二酸、L-赖氨酸、L-谷氨酰胺、柠檬酸、D-果糖、丝氨酸、乙醇胺、乳酸、甘油、丁二酸、L-丝氨酸、4-氨基丁酸。发酵72 h的显著差异性代谢物依次为D-木糖、棕榈酸、L-谷氨酰胺、磷酸、D-果糖、DL-鸟氨酸、L-赖氨酸、乳酸、β-L-半乳糖呋喃糖苷、L-鸟氨酸、乙醇胺、醋酸、赤藓糖醇、L-谷氨酸、丁二酸。发酵96 h的显著差异性代谢物依次为2-丁酸、丁二酸、L-谷氨酸、磷酸、L-谷氨酰胺、β-D-半乳糖呋喃糖苷、D-葡萄糖、棕榈酸、L-鸟氨酸、D-果糖、DL-鸟氨酸、丙二酸、β-L-吡喃半乳糖苷、腺苷草酸。
a-48 h的VIP图;b-72 h的VIP图;c-96 h的VIP图
图4 不同时间样品的VIP图
Fig.4 VIP images of samples at different time
2.3.2 胞内代谢物对代谢途径影响
基于GC-MS和多元统计学分析,发现培养基中添加乙酸钾后A.melanogenum胞内代谢物有明显差异。通过KEGG富集分析,发现有10种与PMLA生物合成相关代谢物相对含量增加或减少,分别是D-葡萄糖、D-木糖、丙二醇、L-丝氨酸、缬氨酸、L-赖氨酸、DL-鸟氨酸、2-丁酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺。
如图5所示,添加乙酸钾对于A.melanogenum合成PMLA的代谢调控,主要集中在糖酵解、丙酮酸代谢及乙醛酸循环途径[9]。DL-鸟氨酸在鸟氨酸脱羧酶的催化下合成腐氨,然后进入谷胱甘肽代谢生成甘氨酸,进而合成乙醛酸。丙二醛在经过β-丙氨酸代谢后,在β-丙氨酸-丙酮酸转运酶和丙二酸半醛脱氢酶的共同催化下生成乙酰辅酶A。L-缬氨酸通过缬氨酸降解转化成乙酰辅酶A和丙酮酸[10]。
图5 基于代谢组学数据的与PMLA生物合成相关的代谢途径
Fig.5 Metabolic pathways related to PMLA biosynthesis based on metabolomics data
添加乙酸钾后A.melanogenum胞内D-葡萄糖和D-核糖含量增加,通过糖酵解途径代谢为丙酮酸,进而积累了丙酮酸的含量。L-赖氨酸和L-缬氨酸这2种氨基酸含量增加,也能通过代谢积累丙酮酸和乙酰辅酶A的含量。2-丁酸可以和乙酰辅酶A相互转化,检测到的2-丁酸含量减少,说明乙酰辅酶A向其他方向如三羧酸循环或乙醛酸循环代谢。DL-鸟氨酸和L-丝氨酸含量的增加,能够促进乙醛酸的合成,进而增加乙醛酸循环。而L-谷氨酸和L-谷氨酰胺含量的减少,能够减少甘氨酸向L-谷氨酸和L-谷氨酰胺代谢,从而增强了甘氨酸合成乙醛酸的能力[11]。添加乙酸钾能够通过增强糖酵解途径和乙醛酸循环途径,从而提高A.melanogenum合成PMLA的能力。
2.4 乙酸钾对PMLA合成的转录组学分析
通过Illumina NOvaSeq 6000高通量测序仪,对实验组和对照组进行测序,结果表明,样品的组间差异较大,培养基中添加乙酸钾对A.melanogenum的基因表达起到调控作用。同时,根据样品中蛋白编码基因的表达量,对样品进行GO富集。每个差异表达基因的功能注释可分析整个差异表达基因集中最显著的功能,从而能够最大限度的挖掘出与A.melanogenum合成PMLA有关的基因。
差异表达基因的GO分析结果显示(图6),生物过程的上调的基因有144个,下调的基因有41个,这些基因主要与代谢过程、跨膜运输、能量转化、离子稳态有关;在分子功能中,上调的基因有113个,下调的基因有49个,主要与糖苷酶、转移、氧化还原酶、蛋白激酶、运转蛋白有关;在细胞组分中,上调的基因有37个,下调的基因有14个,主要与细胞质膜、细胞器膜有关[12]。从差异基因及GO富集,对代谢通路上的基因进行分析,探究培养基中添加乙酸钾对A.melanogenum合成PMLA通路的影响。差异表达基因的主代谢图(图7)及主要关键酶如表2所示。
MF-分子功能;BP-生物过程;CC-细胞组分
图6 差异表达基因的GO富集图
Fig.6 GO enrichment map of differentially expressed genes
图7 差异表达基因的主代谢图
Fig.7 Master metabolic map of differentially expressed genes
表2 差异基因表达的关键酶
Table 2 Key enzymes for differential gene expression
简写英文名称中文名称log2FC(对数倍变化)Padj (校正后P值)表达趋势sgA1glucoamylase葡萄糖淀粉酶1.905 20.000 000 032 92上调glyKglycerol kinase甘油激酶2.169 80.008 729 9上调hadh3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase3-羟酰基辅酶A脱氢酶5.409 10.007 830 5上调GlcPglucose transporter葡萄糖转运蛋白3.729 20.000 115 13上调gdeglycine dehydrogenase甘氨酸脱氢酶1.183 90.000 042 953上调
添加乙酸钾的实验组,PMLA生物合成中上调的差异基因主要富集在糖酵解、丙酮酸代谢和乙醛酸循环。葡萄糖淀粉酶(glucoamylase,sgA1)能够催化葡聚糖合成D-葡萄糖,进而进入糖酵解途径[13]。甘油激酶(glycerol kinase,glyK)能够催化甘油合成磷酸甘油,然后通过甘油磷脂代谢途径合成乙醛,乙醛能够合成丙酮酸。3-羟酰基辅酶A脱氢酶(3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase,hadh)能够催化戊二酰辅酶A合成乙酰辅酶A。甘氨酸脱氢酶(glycine dehydrogenase,gde)能够催化甘氨酸合成乙醛酸,乙醛酸进入乙醛酸循环合成苹果酸[14]。通过分析,sgA1、glpK、hadh和gde基因表达量上调,能够使丙酮酸含量得到积累,丙酮酸穿梭过线粒体膜进入后续循环途径[15]。
GO富集分析,葡萄糖转运蛋白(glucose transporter,GlcP)基因表达量上调,细胞外的葡萄糖不能被细胞直接吸收,因为葡萄糖无法自由通过细胞膜的磷脂双分子层,细胞对葡萄糖的摄取需要借助细胞膜上的GlcP[16]。细胞吸收胞外葡萄糖能够提高胞内代谢活动,提高菌体生长代谢能力。线粒体磷酸载体蛋白基因表达量上调,其能通过质子或羟基进行交换,催化磷酸盐进入线粒体机制。阿拉伯糖转运蛋白基因表达量上调,其能够携带糖和肌醇转运进入线粒体[17]。这些基因的上调能够促进代谢物质的磷酸化、葡萄糖的吸收以及糖的转运,提高细胞能量代谢水平,促进菌体生长代谢[18]。
2.5 添加乙酸钾后ICL活性检测
在添加乙酸钾的培养基中,对A.melanogenum细胞内ICL的活性进行检测,如图8所示,结果表明,在整个发酵过程中,添加乙酸钾后的A.melanogenum细胞内ICL活性均高于空白组,在72 h达到最大,是空白组的3.23倍。ICL作为乙醛酸循环的关键限速酶,其活性受“基因表达调控-酶分子功能调节-代谢网络协同”多维度调控。转录组学数据显示ICL表达量无明显差异,推测乙酸钾对ICL活性的提升作用,可能通过促进ICL的乙酰化、磷酸化等修饰改变其构象以激活活性[19];借助钾离子微调ICL构象或促进其形成活性多聚体,同时凭借缓冲特性维持适宜反应pH,保障催化效率;也可能通过调节代谢增加ICL底物(如异柠檬酸)生成,或影响辅因子浓度以改善作用条件。总体来说,添加了乙酸钾后,能够提高A.melanogenum细胞内ICL活性,而ICL属于乙醛酸循环的关键酶,进而验证了乙酸钾的添加增强了A.melanogenum的乙醛酸循环能力[20]。
图8 细胞内ICL活性检测
Fig.8 Detection of intracellular ICL activity in cells
3 结论与讨论
本文通过单因素法筛选乙醛酸循环关键酶的促进剂乙酸盐,确定乙酸钾能够提高PMLA的产量,研究添加不同质量浓度的乙酸钾对PMLA合成的影响,发现乙酸钾的最适添加质量浓度为3 g/L。结合代谢组学和转录组学分析,添加乙酸钾对PMLA生物合成的影响主要集中在糖代谢、能量代谢和乙醛酸循环[21]。在代谢组学中,葡萄糖、核糖体、丙二醛和赖氨酸含量增加,能够通过代谢积累丙酮酸;在转录组学中,sgA1、glpK、hadh和gde基因表达量上调,也能通过催化前体物质积累丙酮酸;丙酮酸进入线粒体内,在代谢组学中,丙酮酸流向三羧酸循环和乙醛酸循环积累苹果酸;在转录组学中,丙酮酸流向乙醛酸循环积累苹果酸[22]。综合代谢组学和转录组学分析,乙酸钾对A.melanogenum合成PMLA的影响主要是增强了糖酵解和乙醛酸循环能力。5 L发酵罐实验发现,添加乙酸钾后,乙酸钾能够显著提高PMLA的产量,发酵168 h后,实验组的PMLA含量和菌体量均达到最高值,分别为59.98 g/L和63.41 g/L,相比空白组PMLA含量提升121.53%,菌体量提高5.12%。
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