红甜菜(Beta vulgaris L.)也被称为紫菜头或火焰菜,因深紫红色的外观、独特的泥土风味和丰富的营养价值而成为全球广泛种植和食用的根茎类蔬菜。红甜菜富含多酚、糖类化合物、维生素、黄酮,以及钙、铁等多种矿物质元素,营养价值高,被世界卫生组织列为最具营养价值的蔬菜种类之一[1]。近年来,红甜菜因含有丰富的天然色素甜菜素[主要是甜菜红素(betanin,BT)和甜菜黄素]而吸引了越来越多的研究者和消费者的关注。
BT是一种天然的多酚类水溶性含氮色素,在天然甜菜素中占比超过90%,广泛应用于食品、医药和化妆品领域;其显著的抗氧化性还赋予它潜在的医疗价值。研究表明,BT通过清除自由基、抑制氧化应激等机制,在防治高血压、血脂异常、恶性肿瘤及血管狭窄等慢性疾病方面具有重要应用前景[2]。与多数天然色素类似,BT在加工与贮藏期间稳定性不佳,易受光照、高温、高pH值(>7)及金属离子等条件影响而发生降解,因而提取率偏低,保存也较为困难[2]。因此,需要采用稳定化技术来提高其稳定性。其中,较为常见的技术为客体分子通过非共价相互作用,如氢键、范德华力等与主体分子形成稳定复合物,再经过喷雾干燥等技术实现对客体分子的包埋,从而改善其稳定性;其常用的主体分子为蛋白质。本课题组前期以酪蛋白胶束(micellar casein,MC)为基质,通过非共价作用结合BT,制备了BT-MC复合物,发现复合后BT的热、pH稳定性明显改善[3]。有研究指出,BT与大豆分离蛋白复合后热保留率显著提升[4]。另外,经水稻-豌豆复合蛋白非共价负载后,BT在4 ℃下的贮藏稳定性显著改善[5]。可见,蛋白质负载是提升BT稳定性的有效途径。
乳清蛋白(whey protein,WP)来源于牛奶,主要由α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白和乳铁蛋白等组成[6];其成本低、来源广,且营养丰富,兼具抗菌与抗氧化特性,常被用作活性分子的载体。有研究表明,与WP复合后,黄豆苷元和葛根素的DPPH自由基清除活性显著提升,且有效减缓了黄豆苷元和葛根素的肠道释放率[6]。WP负载显著增强了姜黄素的DPPH自由基清除能力,并且调控了模拟胃肠消化过程中姜黄素的释放速率[7]。可见,WP是一种优良的小分子负载基质,但WP负载对BT的稳定性影响相关研究鲜为报道。
红甜菜根是红甜菜的可食部分,是BT的主要来源,也是目前商业加工及科学研究的主要原料。在对甜菜根进行收获时,茎和叶除少部分作为饲料外,大多被丢弃,造成了严重的资源浪费,也对农田环境具有潜在的危害。甜菜茎叶的产量约占块根产量的30%～50%,富含多种营养成分,作为原料在功能性食品开发方面有着一定的发展潜力。例如,甜菜茎叶中总酚含量为0.450 4～1.717 1 g/100 g[8];果胶提取率为(25.18±0.12)%[9]。甜菜茎叶提取物可抑制α-淀粉酶和脂肪酶的活性,被用于治疗肥胖症[10]。除此之外,红甜菜茎叶中还富含BT,但相关研究极少。因此,有必要对红甜菜茎叶中的BT进行研究,以期为提取BT提供新原料,解决甜菜茎叶废弃造成的资源浪费和环境污染问题。
基于循环农业理念,本研究以红甜菜茎叶为原料,提取了BT,以WP为载体进行了负载,利用荧光光谱法探讨了WP与BT的结合作用及结合机理,并通过喷雾干燥技术制备了BT-WP复合物;通过多种光谱技术、粒径及Zeta电位、扫描电镜等手段表征了复合物的结构和微观形貌,并系统考察了热、pH、金属离子、H2O2及光照处理下复合物中BT的稳定性变化。此外,还评价了复合物的抗氧化活性。研究结果可为BT的稳定性提升提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜红甜菜茎,采自甘肃省张掖市民乐县;WP,上海源叶生物科技有限公司;DPPH、ABTS,上海麦克林试剂有限公司;其他化学试剂,天津市百世化工有限公司。
1.2 仪器与设备
UV-1780双光束紫外可见分光光度计、RF-5301PC荧光分光光度计,岛津仪器有限公司;LC-10 N-50D真空冷冻干燥机,上海力辰邦西仪器科技有限公司;MAI-GZJ小型喷雾干燥机,上海那艾精密仪器有限公司;Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)仪,美国赛默飞世尔科技公司;XD3 X-射线多晶衍射仪,北京普析通用仪器有限责任公司;BT-Zeta100 Zeta电位/纳米粒度/分子量分析仪,丹东百特仪器有限公司;STA 449 F5热重-差示扫描量热(thermogravimetric-differential scanning calorimetry,TG-DSC)分析仪,德国耐驰仪器制造有限公司;S-3400 N 扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM),日本日立公司。
1.3 实验方法
1.3.1 BT的提取
选取新鲜红甜菜茎叶,去叶,将茎杆清洗、切条、冷冻干燥、粉碎、过60目筛,粉末于4 ℃冰箱保存。称取粉末5.0 g,与50%(体积分数)乙醇溶液按料液比1∶50混合,于40 ℃恒温水浴锅中避光搅拌6 h,抽滤后在4 000 r/min下离心10 min,取上清液进行旋蒸浓缩,温度为40 ℃。将浓缩液冷冻干燥72 h后收集,即得BT粉末,于4 ℃避光保存。测得提取的粉末样品中BT含量为(24.33±0.46)%;多酚含量为(6.11±0.06)%;多糖含量为(23.36±0.20)%;黄酮含量为(8.50±0.63)%。
1.3.2 BT-WP复合物制备
准确称取适量BT粉末溶于水,配制成质量浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的系列水溶液,分别记为BT-0.5、BT-1.0、BT-1.5、BT-2.0、BT-2.5,现配现用。
将WP溶解于0.01 mol/L、pH 7.0的PBS缓冲溶液中,配制成质量浓度为20 mg/mL的WP溶液。按上述方法配制质量浓度分别为1、2、3、4、5 mg/mL的BT水溶液,与等体积WP溶液混合,于37 ℃下磁力搅拌60 min,即得BT-WP复合物溶液。将复合物喷雾干燥,制得BT-WP复合物粉末,以复合物中BT含量为依据分别记为BT-WP-0.5、BT-WP-1.0、BT-WP-1.5、BT-WP-2.0、BT-WP-2.5,于4 ℃避光保存。
1.3.3 荧光光谱测定
参考曾学而等[3]的方法,将浓度为1、2、3、4、5、6 mmol/L的BT溶液分别与4 mg/mL的WP溶液等体积混合,得到BT-WP混合溶液;将上述复合物溶液分别在298、310、318 K水浴加热20 min,测定溶液在290～500 nm的荧光光谱,激发波长290 nm,激发与发射狭缝3 nm。
由Stern-Volmer方程确定BT对WP的荧光猝灭机制,如公式(1)所示;利用Double-logarithmic方程计算BT与WP的结合常数Ka和结合位点数n,如公式(2)所示;用Van’t Hoff方程计算BT与WP结合过程的热力学参数,如公式(3)、公式(4)所示:
(1)
式中:F0,无BT加入时WP的荧光强度;F,有BT加入时WP的荧光强度;Kq,猝灭速率常数;τ0,荧光分子的平均寿命[(1×10-8)s];Ksv,猝灭常数;[Q],BT浓度。
(2)
(3)
ΔG=ΔH-TΔS
(4)
式中:Ka,结合常数;n,结合位点数;R,摩尔气体常数;ΔH,焓变;ΔS,熵变;ΔG,吉布斯自由能变;T,温度。
1.3.4 紫外-可见光谱测定
采用紫外-可见分光光度计测定BT及BT-WP复合物在波长300～700 nm的光谱。
1.3.5 FTIR测定
采用红外光谱仪对BT-WP复合物粉末进行测定,光谱采集范围为400～4 000 cm-1,分辨率为4 cm-1,累计扫描次数为32次。
1.3.6 X-射线衍射(diffraction of X-rays,XRD)测定
利用XRD仪(Cu Kα辐射)对样品进行分析,扫描速率为5°/min,以0.02°的步长在10°～80°进行扫描。
1.3.7 粒径和Zeta电位测定
使用BT-Zeta100粒度仪测定样品的粒径及Zeta电位,设定平衡时长为120 s,测定温度为25 ℃。
1.3.8 TG-DSC测定
称取10 mg样品于坩锅中,空坩埚作为空白对照,使用TG-DSC分析仪测定样品在30～500 ℃的热分解特性,升温速率为5 ℃/min。
1.3.9 SEM测定
采用SEM仪对BT-WP复合物的表面形貌进行观察。
1.3.10 稳定性测定
1.3.10.1 热稳定性
参照SETIOWATI等[11]的方法,将不同浓度复合物溶液避光置于50、65、85、95 ℃下加热80 min,每20 min在535 nm处用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度,BT保留率的计算如公式(5)所示:
保留率
(5)
式中:A1,复合物溶液的初始吸光度值;A2,不同条件处理后复合物溶液的吸光度值。
1.3.10.2 pH稳定性
将样品溶液pH值分别调为7.0、9.0、11.0、13.0,室温避光静置120 min,每隔30 min测定溶液在535 nm处的吸光度,BT保留率的计算参照公式(5)。
1.3.10.3 金属离子稳定性
将样品溶液分别与等体积的金属离子溶液(FeCl3、ZnCl2、CuCl2,质量浓度均为0.5 mg/mL)混合。将混合液在室温避光条件下静置120 min,每间隔30 min测定其在535 nm处的吸光度值,BT保留率的计算参照公式(5)。
1.3.10.4 H2O2稳定性
将样品溶液分别与0.5%、1.0%、2.0%(体积分数)的H2O2溶液等体积混合,室温避光静置48 h,每隔12 h测定溶液在535 nm处的吸光度,BT保留率的计算参照公式(5)。
1.3.10.5 光稳定性
参照WU等[12]的方法并稍做修改。将样品溶液置于发光二极管(light emitting diode,LED)照明室中,暴露于25 W光源(照明距离为40 cm)或黑暗中48 h,每隔12 h测定溶液在535 nm处的吸光度,BT保留率的计算参照公式(5)。
1.3.11 抗氧化性测定
1.3.11.1 DPPH自由基清除率的测定
取3 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液,与0.5 mL样品溶液混合,室温避光反应30 min后测定517 nm波长处的吸光度值(A1),3 mL乙醇与0.5 mL样品混合液吸光度值为A2,3 mL DPPH与0.5 mL蒸馏水混合液吸光度值为A0。以0.5 mg/mL抗坏血酸水溶液(0.5 mL)作为阳性对照。DPPH自由基清除率的计算如公式(6)所示:
清除率
(6)
1.3.11.2 ABTS阳离子自由基清除率的测定
参考YANG等[13]方法,用pH 7.4的磷酸盐缓冲液调节ABTS工作液在734 nm波长下的吸光度值稀释为(0.70±0.02)(A0)。取3.0 mL ABTS工作液,与0.3 mL样品混合后室温静置10 min,测定734 nm处吸光度值(A1)。以0.5 mg/mL抗坏血酸水溶液(0.3 mL)作为阳性对照。ABTS阳离子自由基清除力的计算如公式(7)所示:
清除率
(7)
1.3.11.3 还原力的测定
取2 mL 浓度为0.2 mol/L pH 6.6的磷酸盐缓冲液,与2 mL样品、2 mL 10 mg/mL铁氰化钾溶液混合,于50 ℃反应20 min。冷却至室温后再加入2 mL 100 mg/mL三氯乙酸,于4 000 r/min离心10 min;取2 mL上清液,与2 mL蒸馏水及400 μL 1 mg/mL FeCl3溶液混合后静置10 min,测定700 nm处的吸光度值。以2 mL 0.5 mg/mL抗坏血酸溶液作为阳性对照。样品还原力以700 nm处吸光度值表示。
1.3.11.4 羟自由基(·OH)清除率的测定
取1 mL样品溶液,与2 mL 6 mmol/L的硫酸亚铁溶液和2 mL 6 mmol/L水杨酸溶液混合均匀,再加入2 mL 6 mmol/L H2O2溶液,于37 ℃下反应30 min后测定510 nm处的吸光度值(A1);以2 mL蒸馏水代替水杨酸溶液,测吸光度值(A2);1 mL蒸馏水代替样品溶液,测吸光度值(A0)。以0.5 mg/mL抗坏血酸溶液(1 mL)作为阳性对照。·OH清除率的计算如公式(8)所示:
清除率
(8)
1.3.11.5 超氧阴离子自由基清除率的测定
参照LIU等[14]的方法并稍做修改。取0.2 mL样品溶液,与3 mL pH 8.2的 Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L)混合,于25 ℃水浴中反应10 min;再加入0.2 mL 30 mmol/L邻苯三酚,继续反应4 min;加入0.5 mL浓盐酸终止反应后,测定325 nm处的吸光度值(A1)。以0.2 mL蒸馏水代替邻苯三酚溶液,测吸光度值(A2);以0.2 mL蒸馏水代替样品溶液,测吸光度值(A0)。以0.5 mg/mL抗坏血酸溶液(0.2 mL)作为阳性对照。超氧阴离子自由基清除率的计算如公式(9)所示:
清除率
(9)
1.4 数据统计分析
所有实验均独立重复3次,数据以“平均值±标准差”表示。采用Origin Pro 2024软件绘图,采用IBM SPSS Statistics 22软件进行差异显著性分析(Duncan法),P<0.05为差异显著。
2 结果与分析
2.1 BT与WP结合机理分析
2.1.1 荧光光谱分析
由图1可知,WP在330 nm处有最大荧光值(4 341.65),随着BT浓度的增加,WP的荧光值降低,最大发射波长发生红移,表明BT对WP有荧光猝灭作用,即二者以非共价作用结合,形成了稳定的复合物。ZHAO等[4]研究发现大豆分离蛋白的荧光强度随BT浓度的增加而减弱,并且引起大豆分离蛋白最大发射波长红移,证实了复合物的形成,与本研究结果一致。
图1 BT-WP复合物的荧光光谱图
Fig.1 Fluorescence spectra of BT-WP complexes
2.1.2 结合机理及结合参数分析
BT与WP结合过程的相关参数计算结果见表1。由表1可以看出,BT对WP的最小猝灭速率常数Kq大于2.0×1010 L/(mol·s)(猝灭剂对分子的最大动态猝灭速率),表明BT与WP结合过程为静态猝灭过程。结合常数Ka值随着温度的升高而降低,表明高温不利于BT与WP复合物的形成,二者结合过程为自发进行的放热过程[15]。此外,结合位点分析表明,BT在WP上有1个单一的结合位点,在3种温度下的结合位点数均约为1。结合过程的ΔG<0,ΔH<0、ΔS<0,表明BT与WP的结合是焓驱动的自发过程,其作用力主要涉及范德华力和氢键,该机制与乳清分离蛋白和BT的结合作用一致[16]。
表1 BT与WP 结合过程的相关参数
Table 1 Binding parameters of BT and WP
温度/KKsv/(×103L/mol)Kq/[×1011 L/(mol·s)]Ka/(×103 L/mol)nΔG/(kJ/mol)ΔH/(kJ/mol)ΔS/[J/(mol·K)]2981.034±0.0021.034±0.0023.320±0.1691.221±0.011-20.19±0.183100.814±0.0020.814±0.0021.683±0.0581.141±0.007-18.79±0.12-54.87±5.16-116.38±16.843180.647±0.0040.647±0.0040.789±0.0681.041±0.017-17.86±0.22
2.2 BT-WP复合物的结构表征
2.2.1 紫外-可见光谱分析
图2为游离BT及BT-WP复合物在300～700 nm处的紫外光谱图。由图2-a可知,BT溶液的最大吸收波长为535 nm,其吸光度值与浓度呈正相关。如图2-b所示,与游离BT相比,复合物最大吸收波长蓝移至522 nm处,表明BT和WP形成复合物,且吸光度随着BT质量浓度的增大而增加。BT-WP复合物吸光度随质量浓度的变化程度小于游离BT,说明WP掩蔽了BT的部分发色团,再次证实了BT与WP的结合。
a-游离BT;b-BT-WP复合物
图2 游离BT及BT-WP复合物的紫外光谱图
Fig.2 UV-Vis spectra of BT and BT-WP complexes
2.2.2 FTIR分析
BT-WP复合物的FTIR谱图见图3。对于WP,酰胺Ⅰ带(1 624.73 cm-1)归属于C
O的伸缩振动,酰胺Ⅱ带(1 537.47 cm-1)则对应于N—H的弯曲振动[17]。BT的红外光谱具有由C—H(1 347.03 cm-1)、CN(1 617.98 cm-1)和O—H(3 313.59 cm-1)键的伸缩振动引起的特征吸收带。加入BT后,WP的酰胺Ⅰ带从1 624.73 cm-1蓝移到1 639.68 cm-1,酰胺Ⅱ带从1 537.47 cm-1蓝移到1 542.29 cm-1,且1 347.03 cm-1和3 313.59 cm-1处的峰消失,这是因为BT与WP之间形成了氢键(表1),但没有新的吸收峰出现,说明二者仅通过非共价作用结合。
图3 BT-WP复合物的FTIR图
Fig.3 FTIR spectra of BT-WP complexes
2.2.3 XRD分析
BT-WP复合物的XRD如图4所示。由图4可以看出,WP与BT在20°附近出现1个宽的衍射峰,表明二者均为无定形结构。BT与WP混合后,没有出现新的晶体衍射峰,但衍射峰强度随着BT质量浓度的增加而略有增加,再次证实了BT-WP复合物的形成。根据TANG等[18]的研究,WP、麦芽糊精负载栀子黄素的微胶囊在20°附近出现宽的衍射峰,与本研究结果类似。
图4 BT-WP复合物的XRD图
Fig.4 XRD patterns of BT-WP complexes
2.2.4 热降解特性分析
图5为BT-WP复合物的DSC、TG和DTG曲线。由图5-a可以看出,BT在80 ℃附近出现吸热峰,是由游离水和结合水的蒸发所致,导致出现明显的质量损失(图5-b);在210 ℃出现吸热峰,推测为其熔融所致;在345 ℃出现尖锐的吸收峰,为BT的热分解所致。WP在220 ℃处出现吸热峰,为蛋白质的熔融峰;当BT与WP结合后,其在345 ℃处的特征吸热峰消失,在220 ℃处也出现显著的吸热峰(图5-c),这是因为BT与WP非共价复合,分散于WP中,原有的结构被破坏,导致其特征分解峰消失。
a-DSC;b-TG;c-DTG
图5 BT-WP复合物的DSC、TG和DTG曲线
Fig.5 DSC, TG, and DTG curves of BT-WP complexes
由TG曲线(图5-b)可知,BT在80 ℃出现第1次明显的质量损失(8.56%),为水分蒸发所致;第2次失重在100～230 ℃,为BT的热分解,质量损失为14.03%;第3次失重在330～350 ℃,质量损失为12.16%,为BT的碳化。BT-WP复合物与WP的TG曲线相似,在150～220 ℃有明显的质量损失,为蛋白质的热熔融所致,之后随着温度的持续升高而逐渐降解,质量逐渐减少。复合物残留质量大于WP残留质量。这是因为BT与WP之间形成了非共价作用,增加了分子间作用力,提升了WP的稳定性,使得残留量增加。
2.2.5 粒径及Zeta电位分析
由图6-a可知,水溶液中WP粒径较大;与BT复合后,WP粒径迅速减小,与游离BT粒径接近,且随着BT含量的增加而显著增大(P<0.05),说明BT的结合导致WP结构发生改变,可能由线性分子转变为包覆BT的球形复合物,结构变得紧密。ZHANG等[19]的研究显示,随着花青素的加入,乳清分离蛋白-花青素复合物的平均粒径减小到64.20 nm,与本研究结果一致。此外,随着儿茶素浓度的增加,大豆分离蛋白-儿茶素复合物的粒径呈现增大趋势,该现象证实了复合物的形成[20]。
Zeta电位的绝对值决定了分散体系的稳定性,高绝对值通过静电排斥作用稳定体系;低绝对值则导致粒子快速聚集和不稳定[21]。由图6-b可知,游离BT及WP均带负电荷,且WP负电量大于BT。BT-WP复合物Zeta电位的绝对值随着BT质量浓度的增大而显著增大(P<0.05)。当BT添加量为2.5 mg/mL时,复合物Zeta电位的绝对值达到最大值,这意味着此时复合物粒子间的排斥力较大,溶液较稳定。
a-粒径;b-Zeta电位
图6 BT-WP复合物的粒径和Zeta电位
Fig.6 Particle size and zeta-potential of BT-WP complexes
注:不同大写字母表示BT样品间差异显著(P<0.05),不同小写字母表示BT-WP样品间差异显著(P<0.05)。
2.2.6 表面形貌分析
游离BT、WP及其复合物的微观形貌见图7。由图可知,冻干BT为大块片状结构,表面平滑。喷干WP呈现球状结构,表面粗糙且皱褶,是典型的喷干乳蛋白结构。与BT结合后,复合物粒径迅速减小,说明WP与BT发生相互作用后形成了结构更紧密的复合物,与粒径分析结果一致(图6)。随着BT添加量的增加,复合物粒径进一步减小,表面褶皱减少,说明BT的结合改变了WP的结构。当BT添加量为1.5 mg/mL时,复合物粒子间出现了轻微黏连,其黏连程度在BT质量浓度为2.5 mg/mL时变得十分明显。
a-BT;b-WP;c-BT-WP-0.5;d-BT-WP-1.0;e-BT-WP-1.5;f-BT-WP-2.0;g-BT-WP-2.5
图7 BT-WP复合物的表面形貌
Fig.7 Morphology of BT-WP complexes
注:放大倍数,左:10 000倍,右:20 000倍。
WP因大分子结构而在喷干时难以迅速扩散,因此形成了表面皱缩的球形结构。BT与WP以氢键和范德华力结合,改变了WP结构,形成了粒径较小且稳定的粒子,因此添加BT后喷干复合物粒径显著低于WP。在喷干过程中,BT因小分子结构而迅速扩散,填充了复合物表面的褶皱,使其表面逐渐变得饱满而平滑。当BT添加量较大时,扩散到表面的BT与邻近复合物上的BT、WP形成新的相互作用,从而致使复合物粒子间出现黏连现象,这可能有助于更好地保护BT结构稳定。
2.3 BT-WP复合物的稳定性
2.3.1 热稳定性
不同温度(50、65、85、95 ℃)处理下BT-WP复合物中BT的保留率见图8,以游离BT(2.5 mg/mL)为对照。由图8可知,游离BT受热后降解十分迅速,与吕亚文等[22]的报道一致。随着温度的升高,游离BT的保留率显著下降,且温度越高、加热时间越长,BT保留率越低。在不同温度和不同处理时间下,复合物中的BT保留率均明显高于游离BT。相同处理条件下,BT质量浓度为2.5 mg/mL时的复合物中BT保留率最高,这是因为高质量浓度的BT中,BT分子数量较多,分子间相互作用较强,有利于提高其稳定性。另外,高质量浓度的BT复合物粒子间形成了相互作用,出现黏连现象(图7),不仅有利于降低粒子的热运动,而且保护了BT基团不暴露于表面,从而提高了保留率。然而,高温长时间热处理(95 ℃,80 min),BT-WP-2.5中BT的保留率与BT-WP-2.0差异不显著(P>0.05)。
a-50 ℃;b-65 ℃;c-85 ℃;d-95 ℃
图8 不同温度处理下BT保留率
Fig.8 Retention rate of BT after heat treatment at different temperature
注:图中不同大写字母表示同一样品不同处理时间下差异显著(P<0.05),不同小写字母表示不同样品同一处理时间下差异显著(P<0.05)(下图同)。
在4种不同温度下处理80 min后,BT-2.5的保留率分别为(82.55±1.40)%(50 ℃)、(56.09±0.32)%(65 ℃)、(16.74±0.67)%(85 ℃)、(11.21±0.44)%(95 ℃);而复合物BT-WP-2.5中BT的保留率分别为(90.68±0.67)%(50 ℃)、(80.01±0.74)%(65 ℃)、(54.42±0.89)%(85 ℃)、(47.93±0.82)%(95 ℃)。随着热处理时间的延长,复合物中BT保留率呈现下降趋势,这可能是由于加热过程中,因快速扩散而位于复合物表面的BT首先受热降解,导致保留率下降;当复合物持续受热时,部分WP因热变性而结构展开,导致BT从复合物中逸出,从而降低了保留率。可见,WP负载显著提升了BT的稳定性,特别是高温处理下的稳定性。综上所述,BT-WP-2.5具有较高的热稳定性。
2.3.2 pH稳定性
BT在酸性环境中较稳定,但在碱性条件下容易降解[2]。因此,选择pH 7.0、9.0、11.0、13.0,研究BT-WP复合物中BT保留率变化规律,如图9所示。由图9可以看出,pH 7.0时游离BT保留率较高,略低于复合物中BT的保留率;随着pH值的升高,BT保留率迅速降低。4种不同pH条件下,复合物中BT的保留率均显著高于游离BT(P<0.05)。4种pH下处理120 min后BT-2.5的保留率分别为(91.61±0.87)%(pH 7.0)、(71.81±0.44)%(pH 9.0)、(33.82±1.21)%(pH 11.0)、(10.37±0.21)%(pH 13.0),而复合物BT-WP-2.5中BT的保留率分别为(95.09±0.48)%(pH 7.0)、(87.21±0.85)%(pH 9.0)、(54.95±0.40)%(pH 11.0)、(26.16±0.26)%(pH 13.0),显著高于游离BT的保留率(P<0.05)。可见,BT与WP非共价结合减少了其与强碱的接触,从而提高了保留率。pH值越高,BT保留率随处理时间的变化幅度越小,说明强碱性条件下游离BT降解速率较快,30 min内已基本降解完全。另外,弱碱性(pH 9.0～11.0)环境下BT-WP-2.5具有较高的稳定性,而强碱性(pH 13.0)环境下BT-WP-0.5稳定性更高。这是因为弱碱性条件下WP与BT间的非共价作用、BT分子间的非共价作用均有利于提高BT的稳定性;而强碱性条件下,WP溶解性较高,复合物溶解较为彻底,此时WP与BT间可能形成新的相互作用,而WP能够结合的BT分子数量有限,致使大量BT游离在溶液里而迅速降解。因此低质量浓度BT形成的复合物反而具有较高的保留率。另外,建议BT加工环境pH低于9.0。
a-pH 7.0;b-pH 9.0;c-pH 11.0;d-pH 13.0
图9 不同pH处理下BT保留率
Fig.9 Retention rate of BT at different pH
2.3.3 金属离子稳定性
已有研究发现Fe3+、Cu2+对BT稳定性影响较大;MC负载反而降低了BT在Fe3+和Zn2+环境中的稳定性[3]。因此,本研究选择了Fe3+、Zn2+、Cu2+来探究WP负载对BT的金属离子稳定性的影响。由图10可知,游离BT的保留率随金属离子处理时间的延长而降低,这是由于金属离子与BT分子通过配位键形成络合物,导致BT降解。经WP负载后,BT保留率增加,且其保留率随其质量浓度的增加而增大。
a-Fe3+;b-Zn2+;c-Cu2+
图10 Fe3+、Zn2+和Cu2+处理下BT保留率
Fig.10 Retention rate of BT in Fe3+, Zn2+, and Cu2+ solution
与Fe3+混合120 min后,游离BT-2.5的保留率为(54.76±0.54)%,而同质量浓度复合物中BT保留率为(70.71±0.35)%。同样,与Zn2+混合120 min后,BT-2.5的保留率为(57.52±0.71)%,而复合物中BT保留率为(85.90±0.46)%;Cu2+中BT-2.5的保留率为(38.97±0.55)%,而复合物中BT保留率为(64.79±0.26)%。也就是说,经WP负载后,BT的稳定性显著提升。另外,在实验条件下,游离BT对Cu2+最敏感,而WP在Zn2+环境中对BT的保护作用最好。这是由于复合物中WP表面的氨基酸残基通过配位键、静电作用等与金属离子结合,或通过吸附作用将金属离子吸附于表面,阻止了金属离子与BT的结合,从而发挥了保护作用[23]。YANG等[24]评估了在Fe3+和Cu2+条件下BT与酵母蛋白复合物的稳定性,发现复合后BT的保留率(52.2%)显著高于未处理的BT(45.2%),证明了复合物的形成对保护BT免受金属离子的破坏至关重要。
2.3.4 H2O2稳定性
图11为不同体积分数下H2O2对BT稳定性的影响。由图11可知,随着H2O2体积分数的增加,游离BT保留率下降;随着处理时间的延长,BT保留率显著降低(P<0.05)。由于H2O2是强氧化剂,致使BT发生氧化降解,保留率降低。经WP负载后,BT的保留率显著增大,这是因为WP将BT包封在分子内部,有效阻止了BT与氧化剂的接触,从而提高了BT的氧化稳定性。另外,随着BT质量浓度的增加,复合物中BT的保留率增加(12～36 h);可见,BT质量分子间的相互作用也有利于改善其稳定性。长时间(48 h)氧化处理下,BT-WP-2.5与BT-WP-2.0中BT的保留率差异不显著(P>0.05)。综上所述,BT-WP-2.5具有较高的氧化稳定性。王楠等[25]报道称,与原花青素形成非共价复合物后,MC能有效屏蔽原花青素以避免其接触H2O2,从而显著提升其稳定性,与本研究结果类似。
a-0.5% H2O2;b-1.0% H2O2;c-2.0% H2O2
图11 不同体积分数H2O2处理下BT保留率
Fig.11 Retention rate of BT at different volume fraction of H2O2
2.3.5 光稳定性
光照对BT稳定性的影响如图12所示。由图12可知,光照条件下游离BT保留率随光照时间的延长而迅速下降(P<0.05)。由于光照使分子的发色基团电子被激发至高能态,分子反应活性增强,进而加快降解[26]。经WP负载后,BT在光照条件下的保留率显著提升(P<0.05),因为其被结合和包埋在WP内部。复合物中BT质量浓度为1.5～2.5 mg/mL时,不同光照时间下BT的保留率差异不显著(P>0.05)。另外,与游离BT相比,复合物中BT保留率随光照时间的延长变化幅度不大。黑暗条件下,游离BT保留率和复合物中BT的保留率均随光照时间的延长而出现轻微下降,且下降幅度差异不大。也就是说,光照仅作用于游离BT颗粒表面和复合物表面,而被包埋于内部的BT基本不受光照影响。赵楠等[27]研究发现与β-乳球蛋白非共价结合后,红曲色素的光稳定性显著提升,与本研究结果类似。
a-光照;b-黑暗
图12 光照和黑暗处理下BT保留率
Fig.12 Retention rate of BT after light or dark treatment
2.4 BT-WP复合物的抗氧化性
对游离BT及BT-WP复合物的DPPH和ABTS阳离子自由基清除力如图13-a和图13-b所示,以维生素C(0.5 mg/mL)作为阳性对照。由图13可知,复合物DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率与BT的添加量呈正相关。与WP复合后,BT的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力增强,这是因为WP具有一定的抗氧化作用。也说明了WP负载没有对BT的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力产生拮抗作用。另外,BT质量浓度为2.5 mg/mL时复合物的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力均接近维生素C,表明BT具有较好的抗氧化性。
a-DPPH自由基清除率;b-ABTS阳离子自由基清除率;c-·OH清除率;d-超氧阴离子自由基清除率;e-还原力
图13 BT和BT-WP复合物的自由基清除力及还原力
Fig.13 The free radical scavenging capacities and reducing power of BT and BT-WP complexes
注:图中不同大写字母表示组间差异显著(P<0.05)。
对BT及BT-WP复合物质量的·OH清除率测定结果如图13-c所示;随BT质量浓度的增加,复合物对·OH的清除率呈逐步上升趋势。与WP复合后,BT的·OH清除率显著高于复合前两者清除率之和,说明BT与WP的复合在提高BT的·OH清除力上具有协同作用。一方面,BT与WP的结合促进了WP表面具有抗氧化能力的氨基酸残基的暴露,从而增强了复合物的·OH清除能力[14]。另一方面,WP负载提高了BT的稳定性,从而有利于其发挥抗氧化活性。
由图13-d可知,BT-WP复合物对超氧阴离子自由基和·OH的清除率呈现出相似的变化规律,且表现出协同抗氧化作用。BT-2.5与BT-WP-1.0具有相似的自由基清除能力(P>0.05),说明WP负载显著提高了BT的超氧阴离子自由基清除力。
BT及BT-WP复合物的还原力测定结果见图13-e。由图13-e可知,BT-2.5与BT-WP-1.0的吸光度值分别为(0.87±0.04)、(0.92±0.01),二者差异不显著(P>0.05),说明BT与WP的复合显著提高了BT的还原力。此外,BT-WP-2.5的吸光度值为(1.38±0.04),大于BT与WP吸光度值之和,说明BT与WP复合具有协同还原Fe3+的能力,与Fe3+稳定性分析结果一致。
3 结论
以WP为载体,制备了BT-WP非共价复合物。荧光光谱分析结果表明,WP对BT具有较高的亲和性,二者通过范德华力和氢键自发结合形成复合物,结合过程为放热过程。WP负载有效减缓了BT在高温、碱性pH下的降解,显著改善了BT的金属离子稳定性,同时也提高了其在H2O2及光照条件下的保留率。其中,BT-WP-2.5的热稳定性、金属离子稳定性和氧化稳定性较好。此外,WP负载对BT产生协同抗氧化作用。综上所述,WP可作为载体用于BT的负载,以改善其加工稳定性,扩大其在食品工业中的应用范围。未来可针对BT-WP复合物在体内的抗氧化作用进行深入分析,以期为功能食品开发提供新原料。
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