酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是葡萄酒生产过程中的重要微生物,使用优良的酿酒酵母菌株是提升和改善葡萄酒质量的关键之一。在葡萄酒酿造中,商业酵母的应用虽确保了发酵过程的可预测性与稳定性,却也使得酿出的葡萄酒在口感层次与香气特征上缺乏鲜明个性。为了改善葡萄酒的同质化问题,打破过度依赖商业酵母的现状,酿造出体现“风土”特色的葡萄酒[1-2],筛选具备优良生理特性的本土酿酒酵母菌株,已成为提升葡萄酒品质的重要途径之一。
酿酒酵母的生理特性主要包括嗜杀性、产泡性、絮凝性和自溶性[3-5]。嗜杀酵母能够有效抑制杂菌,净化发酵体系,对葡萄酒的风味形成和品质具有很重要的影响[6]。周文亚[7]从贵州水晶葡萄中分离出238株野生酿酒酵母,成功筛选出26株具有嗜杀活性的菌株。闫兴敏等[8]从14株不同来源的本土酿酒酵母中获得7株嗜杀性菌株。产泡性即菌株在发酵中形成气泡的生理特性,低产泡性菌株可有效抑制发酵过程中的“爆管”现象,提高葡萄酒酿造可控性。杨惠婷[9]在浙江地区从10株本土酵母中筛选出6株低产泡性菌株,并鉴定出一株具有优良生理特性的酿酒酵母HF2,发酵的葡萄酒在感官品质上优于商业酵母。絮凝性表现为菌株聚集形成团块并沉淀的现象,对葡萄酒澄清度及后续加工处理至关重要。其中,高絮凝性菌株可在发酵结束后快速沉降,简化了澄清工序[10]。李芮芮[11]从13株本土酿酒酵母中筛选出3株高絮凝性菌株(NXU21-24、NXU21-81和NXU21-102)。酵母自溶过程中释放的风味物质及发泡成分对葡萄酒的感官特性具有积极贡献,王玉霞[12]从62株本土酵母中筛选出30株自溶能力较强的菌株。酿酒酵母作为重要的微生物发酵剂,其生理特性影响葡萄酒的发酵过程、风味特征、口感体验及整体品质。贺兰山东麓产区蕴藏丰富的本土酿酒酵母资源,仍有大量具有优良生理特性的本土酿酒酵母菌株有待挖掘。
课题组前期已筛选出12株综合耐受性强的本土酿酒酵母菌株[13],本研究对这12株本土酿酒酵母与5株商业酵母的生理特性进行了比较分析,包括嗜杀性、产泡性、絮凝性及自溶性,旨在筛选出具有优良生理特性的本土酿酒酵母,为贺兰山东麓葡萄酒产区提供具有地域特色和潜在应用价值的优质酿酒酵母资源。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 试验所用菌株
菌株来源:12株本土酿酒酵母YC-D2、YC-E8、QTX-C8、QTX-D4、QTX-D7、QTX-D16、QTX-D17、QTX-D20、QTX-E5、QTX-E10、YQY-D7、YQY-E18,分离自贺兰山东麓葡萄酒产区;5株商业酵母:F33,LAFFORT公司;XR,诺盟公司;CECA,安琪酵母股份有限公司;CEC01,安琪酵母股份有限公司;SP,安琪酵母股份有限公司;敏感菌株:UCD522为本实验室保存。所有菌株均为甘油保藏,保存于-80 ℃冰箱。
1.1.2 培养基
YPD液体培养基:培养基粉50.0 g,溶于1 L的蒸馏水中,121 ℃灭菌15 min待用;
YEPD-MB培养基:在YPD培养基的基础上,使用0.1 mol/L、pH 2.2的柠檬酸磷酸盐缓冲液,将培养基的pH值调整至4.6,并加入20 g/L的琼脂和0.03 g/L的次甲基蓝。
1.1.3 主要试剂
模式酒(model wine)(g/L):4酒石酸,3苹果酸,0.1醋酸,0.1硫酸钾,0.025硫酸镁,100 mL无水乙醇,pH 3.0,用1 000 mL容量瓶定容;
1 000 μg/mL牛血清白蛋白溶液的制备:取100 mg牛血清白蛋白用蒸馏水溶解后,于100 mL容量瓶中定容;
考马斯亮蓝G250蛋白溶液:称取100 mg考马斯亮蓝G250,溶于45 mL无水乙醇中,加入100 mL磷酸,蒸馏水定容至1 000 mL,过滤后备用;
氨基酸含量测定试剂盒,苏州科铭生物技术有限公司;
柠檬酸磷酸盐缓冲液:0.1 mol/L柠檬酸9.6 mL,0.2 mol/L Na2HPO4 0.4 mL;
去絮凝缓冲溶液:50 mmol/L柠檬酸钠,5 mmol/L乙二胺四乙酸,pH 3.0;
絮凝缓冲液:50 mmol/L柠檬酸钠,20 mmol/L CaCl2,0.1 mol/L pH 2.2柠檬酸。
1.2 仪器与设备
LDZX-50FBS立式高压蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂;JNX-26离心机,贝克曼库尔特股份有限公司;SW-CJ-2FD超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;PHS-3C pH计雷磁,上海仪电科学仪器股份有限公司;SHP-150B恒温培养箱,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;Multiskan FC酶标仪,赛默飞世尔仪器有限公司;TU-1901双光束紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌株活化
将保藏的本土酿酒酵母和商业酵母从-80 ℃冰箱中取出,静置30 min解冻后摇匀,划线于YPD固体培养基上,在28 ℃条件下培养2～3 d,挑取单菌落于5 mL YPD液体培养基中,在28 ℃、180 r/min条件下培养12 h后获得种子液。将100 μL敏感菌株UCD522接种到5 mL YPD液体培养基中,在28 ℃、180 r/min条件下培养24 h后获得种子液。
1.3.2 酿酒酵母的嗜杀性
酿酒酵母的嗜杀性测定参考DE ULLIVARRI等[14]的方法。用无菌水将UCD522种子液稀释至107 CFU/mL,并均匀涂布于YEPD-MB培养基表面,静置2 min。取直径为5 mm的滤纸片平放于YEPD-MB培养基上,取100 μL本土酵母和商业酵母种子液点样于滤纸片上,每个菌株点样3次,并在28 ℃条件下培养48 h后观察结果。若菌落周围出现蓝色的抑菌圈,则表明该菌株为嗜杀菌株。抑菌圈和菌落的直径差表示抑菌圈的大小[15]。
1.3.3 酿酒酵母的产泡性
参考李玉花[16]的方法。取200 μL本土酵母和商业酵母种子液接种于10 mL YPD液体培养基,以未接菌的YPD液体培养基为空白对照组,设置3次平行重复,在28 ℃条件下静置培养24 h,每隔4 h测量一次试管中的泡沫高度,记录24 h内的最高泡沫高度[17]。
1.3.4 酿酒酵母的絮凝性
参考郑海武等[18]的方法。将5 mL本土酵母和商业酵母种子液于5 000 r/min离心5 min,倒去上清液。加入去絮凝缓冲液重悬菌体,重复离心操作,倒去上清液。再加入无菌水洗涤菌体,重复离心操作,倒去上清液。重复上述做法洗涤2次,再向菌体中加入絮凝缓冲液,置于50 mL的三角瓶中,在30 ℃、100 r/min条件下培养2 h,以无菌体的絮凝缓冲液为空白对照组,吸取200 μL测波长600 nm吸光度(A)。再从中吸取5 mL菌液至10 mL试管中,静置30 min,从液体表面最低处吸取样品200 μL,用紫外分光光度计测量其在波长为600 nm下的吸光度(B),2次吸光度测定均重复3次。絮凝值(flocculation value,Flo)的计算如公式(1)所示:
(1)
式中:Flo,絮凝值;A,培养结束悬浮于絮凝缓冲液中的细胞吸光度;B,细胞絮凝沉降30 min后的吸光度。当Flo为0%～30%时,属于高絮凝性;当Flo为30%～70%时,属于中絮凝性;当Flo为70%～100%时,属于低絮凝性。
1.3.5 酿酒酵母的自溶性
参考王玉霞[12]的方法,绘制蛋白质标准溶液曲线时,取6支试管按表1数据配制0～1 000 μg/mL牛血清蛋白溶液。
表1 牛血清蛋白溶液配制(0～1 000 μg/mL)
Table 1 Preparation of bovine serum protein solution (0-1 000 μg/mL)
管号1234561 000 μg/mL牛血清蛋白溶液/mL00.20.40.60.81.0蒸馏水/mL1.00.80.60.40.20各管蛋白质含量/(μg/mL)02004006008001 000
分别吸取表中溶液0.1 mL加入6支10 mL离心管,再加入5 mL考马斯亮蓝G250蛋白试剂混匀,放置2 min后,在分光光度计595 nm波长下测其吸光度,绘制标准曲线。
将本土酿酒酵母和商业酵母种子液于5 000 r/min,离心5 min,除去上清液,用生理盐水重悬洗涤菌体,相同条件离心,去除上清液,重复3次。向菌体中加入5 mL模式酒,在28 ℃、180 r/min培养24 h,以无菌体的模式酒为空白对照组。测定蛋白质含量时,在试管中加入0.1 mL预先培养好的模式酒,再加入5 mL考马斯亮蓝G250蛋白试剂,摇晃均匀,静置3 min后,在紫外分光光度计595 nm波长下重复测量3次吸光度并记录,最后通过对比标准曲线得出所测样品的蛋白质含量(μg/mL)。测定氨基酸含量时,取1 mL培养好的模式酒,使用氨基酸含量测定试剂盒进行测定,氨基酸的α-氨基与水合茚三酮反应,通过测定570 nm吸光度计算氨基酸的含量。
1.4 数据分析
利用Excel表格开展数据统计,借助OriginPro 2024软件完成作图,通过 SPSS 27.0软件的单因素方差分析(analysis of variance,ANOVA)进行显著性差异检验。
2 结果与分析
2.1 酿酒酵母的嗜杀性
酿酒酵母的嗜杀特性是基本生理特性之一,葡萄酒的酿造过程中,嗜杀酵母能够有效抑制杂菌,净化发酵体系,对葡萄酒的风味形成和酒质具有很重要的影响[19]。在酵母嗜杀性检测中,判断标准为:若菌株在培养基周围形成蓝色死菌带(即抑菌圈),则表明其具有嗜杀性,且抑菌圈直径大小可反映嗜杀性强弱;若无抑菌圈形成,则该菌株无嗜杀性[20]。如图1所示,QTX-E5、QTX-E10、QTX-D20、QTX-D4、CECA及F33均未形成抑菌圈,说明上述菌株均无嗜杀性;其余菌株均有抑菌圈形成,故具有嗜杀性。由图2可知,在本土酿酒酵母中,菌株YC-D2、YC-E8、QTX-C8、QTX-D7、QTX-D16、QTX-D17、YQY-D7、YQY-E18均形成抑菌圈,其直径为0.5～1.5 mm,表现出明显嗜杀性,其中QTX-C8的嗜杀性最强,抑菌圈直径为1.5 mm。在商业酵母中,菌株SP、CEC01、XR均形成抑菌圈,其直径为0.2～2.0 mm,具有明显嗜杀性,其中SP的嗜杀性较强,抑菌圈直径达2.0 mm。
图1 不同酿酒酵母菌株嗜杀性检测试验结果
Fig.1 Killer activity assessment of different S.cerevisiae strains
图2 不同酿酒酵母菌株产生的抑菌圈大小
Fig.2 Size of inhibition zones produced by different S.cerevisiae strains
注:不同小写字母表示不同菌株之间的显著性差异(P<0.05)(下同)。
2.2 酿酒酵母的产泡性
产泡性表示在葡萄酒发酵过程酿酒酵母产生气泡的能力,如果产生大量气泡,容易导致发酵罐“冒罐”的现象,因此在选择发酵菌株时,选择产泡沫性较低的酿酒酵母有利于发酵的进行,根据3组重复试验中泡沫的平均高度,将酿酒酵母菌分为4种:不产泡、低产泡(泡沫的平均高度<2 mm)、中产泡(泡沫的平均高度2～4 mm)和高产泡(泡沫的平均高度>4 mm)[21]。由图3可知菌株QTX-D4和菌株CEC01的产泡高度为2～4 mm,属于中产泡菌株,且与其余菌株存在显著性差异,不符合优良酿酒酵母的生理特性条件,在发酵过程中可以用低温、压帽等方法控制,以达到最佳酿造效果。本土酿酒酵母菌株YC-D2、YC-E8、QTX-C8、QTX-D7、QTX-D16、QTX-D17、QTX-D20、QTX-E5、QTX-E10、YQY-D7和YQY-E18的产泡高度均低于2 mm,为低产泡性菌株。其中,菌株QTX-E5和YQY-E18的泡沫高度最低,分别为0.14 mm和0.17 mm,较其他菌株在防冒罐方面有一定优势。
图3 不同酿酒酵母菌株的产泡性
Fig.3 Foaming properties of different S.cerevisiae strains
2.3 酿酒酵母的絮凝性
由图4可知,在本土酿酒酵母中,菌株YC-D2、QTX-D4、QTX-D16、QTX-E5、QTX-E10、YQY-E18、YQY-D7絮凝值为35%～70%,属于中絮凝性菌株,可以通过增加后期处理的澄清次数达到酿酒标准要求。菌株YC-E8、QTX-C8、QTX-D7、QTX-D17、QTX-D20絮凝值为70%～100%,属于低絮凝性菌株,需要通过更多的澄清方式达到酿酒标准要求。在商业酵母中菌株CECA、XR、F33絮凝值为28%～30%,属于高絮凝性菌株,符合酿酒酵母酿酒标准。菌株CEC01絮凝值为35%～70%,属于中絮凝性。
图4 不同酿酒酵母菌株的絮凝性
Fig.4 Flocculation properties of different S.cerevisiae strains
2.4 酿酒酵母的自溶性
通过绘制牛血清蛋白溶液标准溶液曲线,得出吸光度与蛋白质之间的关系方程如公式(2)所示:
y=0.863 7x+0.471 8(R2=0.991 34)
(2)
式中:y为试验测得的吸光度;x为计算所得的蛋白质质量浓度。其标准曲线如图5所示。
图5 0～1 000 μg/mL牛血清蛋白溶液标准曲线
Fig.5 Standard curve of 0-1 000 μg/mL bovine serum protein solution
本试验以5株商业酵母为参照,对参试菌株的自溶性进行比较性测试。将菌株置于模式酒中培养一段时间后,通过测定模式酒中可溶性蛋白质含量和氨基酸的含量,得出酿酒酵母的自溶性高低。由图6可知在酵母自溶性能试验中,可溶性蛋白质的含量有明显差异。可溶性蛋白质的含量最多的是商业酵母XR,含量达289.684 μg/mL;可溶性蛋白质的含量最低的是本土酿酒酵母YQY-D7,为1.389 μg/mL。在本土酿酒酵母中,可溶性蛋白质含量最高的是QTX-D20,与商业酵母CECA中可溶性蛋白的含量相当;菌株QTX-D16、QTX-C8、QTX-D7、YQY-E18、QTX-D17中可溶性蛋白质含量均高于110 μg/mL,均显著高于商业酿酒酵母菌株F33和SP。
图6 不同酿酒酵母菌株自溶后可溶性蛋白质含量
Fig.6 Contents of soluble proteins in different S.cerevisiae strains after autolysis
由图7可知,商业酿酒酵母XR释放出游离氨基酸的含量最高,为31.63 μg/mL。在本土酿酒酵母中,除YC-E8、QTX-D4、YQY-D7外,其他菌株培养的模式酒中氨基酸的含量均显著高于商业酿酒酵母SP,其中,QTX-D16、QTX-D20培养的模式酒中游离氨基酸的含量显著高于商业酿酒酵母CEC01。本土酿酒醇母中,游离氨基酸含量最高的是QTX-D20,与商业酿酒酵母CECA中游离氨基酸的含量无显著性差异;YQY-E18、QTX-D17与商业酿酒酵母F33无显著性差异。
图7 不同酿酒酵母菌株自溶后游离氨基酸含量
Fig.7 Contents of free amino acids in different S.cerevisiae strains after autolysis
高自溶能力的菌株在24 h内可释放大量游离氨基酸与可溶性蛋白质[17]。由图6和图7可知,在本土酿酒酵母中,自溶性最高的菌株是QTX-D20,菌株QTX-D16、QTX-C8、QTX-D7、YQY-E18、QTX-D17均显示出良好的自溶性。
3 结论与讨论
本研究评估了12株贺兰山东麓葡萄酒产区优选本土酿酒酵母的生理特性,对菌株的嗜杀性、产泡性、絮凝性及自溶性进行综合分析。张春芝等[22]以贺兰山东麓皇冠酒庄的酿酒葡萄中分离出本土酵母具有嗜杀性,适合葡萄酒的酿造环境。EL DANA等[23]从黎巴嫩12棵葡萄树上筛选出96株本土酿酒酵母,发现只有NL28595具有明显的嗜杀性。在马尔贝克葡萄酒发酵中,嗜杀性强的本土酿酒酵母Cf8作为发酵剂,可有效调控潜在腐败非酿酒酵母的生长,从而在低二氧化硫条件下提升葡萄酒的感官品质和复杂性[24]。EL DANA等[25]研究发现从黎巴嫩产区分离的酿酒酵母Sc54菌株产生的嗜杀毒素在模拟酿酒条件下能有效抑制腐败酵母的生长,证明了其作为生物保护剂的潜力,并揭示了嗜杀毒素是酿酒酵母发挥拮抗作用的关键机制。在本研究中,本土酿酒酵母菌株YC-D2、YC-E8、QTX-C8、QTX-D7、QTX-D16、QTX-D17、YQY-D7和YQY-E18均表现出显著的嗜杀活性,其中QTX-C8的嗜杀能力最强,与商业酿酒酵母XR的嗜杀能力相当。这一特性使其在发酵过程中可能具有竞争优势,能够抑制野生酵母或其他杂菌的生长,从而提高发酵的纯度和稳定性。不同产区关于本土酵母嗜杀特性的研究结果存在差异,反映了不同环境条件对酵母的嗜杀性有显著影响[26]。赵昱等[27]研究发现不同产区酿酒葡萄的优势微生物存在差异,主要与当地气候等因素有关。EL DANA等[23]从黎巴嫩产区96株本土酿酒酵母中只筛选出一株具有明显嗜杀性的菌株,主要是因为黎巴嫩产区气候较为温和湿润,微生物竞争压力可能较小,嗜杀菌株的出现频率偏低[28-29]。本研究筛选的菌株中嗜杀活性普遍存在,且强度较高(抑菌圈直径0.5～1.5 mm),产生上述差异的原因可能与贺兰山东麓产区特有的地理气候条件密切相关。贺兰山东麓属大陆性干旱气候,日照充足、昼夜温差大、降水稀少[30],这种逆境环境可能促使部分酵母演化出嗜杀性状以增强生存竞争力。郑海武等[18]研究发现筛选的本土酿酒酵母WJ1、Q12、S12为低产泡性(泡沫高度<2 mm),与商业酵母相当。王晗[31]在研究4株商业酵母(XR、DS、CECA、CEC01)和4株本土酵母(S12、S21、Q12、WJ1)的产泡性时发现4株商业酿酒酵母均为低产泡沫性菌株,并成功筛选出3株本土低产泡沫性菌株。在本研究中,也筛选到了低产泡本土酿酒酵母菌株,除QTX-D4属中产泡型外,其余菌株均为低产泡型(<2 mm),符合优质酿酒酵母的标准。其中,QTX-E5的泡沫高度仅为0.14 mm,表现出极低的起泡倾向。这在发酵中可有效降低冒罐风险,提高发酵安全性。本研究中,本土酿酒酵母YC-D2、QTX-D4、QTX-D16、QTX-E5、QTX-E10、YQY-E18、YQY-D7与商业酿酒酵母CEC01的絮凝值为35%～70%,达到中絮凝性标准,有利于发酵后期的固液分离,而其余本土酿酒酵母菌株和商业酿酒酵母菌株SP的絮凝值相对较低,可能更适合需要延长酒泥接触的酿造工艺。CHEN等[32]筛选出4株本土酿酒酵母,均属于中絮凝性。张仟伟[33]从土壤中分离出的8株本土酿酒酵母,菌株SCX002、SCP007具有高絮凝性。胡江南等[34]筛选得到的本土酿酒酵母J-1和J-3絮凝值分别为29.7%和24.9%,均属于高絮凝性菌株,显著优于商业酵母F15(57.9%,中絮凝性),更有利于葡萄酒的快速澄清和后期管理,此研究结果的絮凝值比本试验的略低,后续可通过分子手段改良或培养条件优化进一步降低本试验酿酒酵母的絮凝值,以达到高絮凝性[35]。在自溶性方面,本研究中的QTX-D20表现出最优异的自溶特性,其表现与商业酵母CECA相当,表明该菌株在陈酿过程中可能更易释放风味物质,从而提升葡萄酒的感官品质。此外,QTX-D16、QTX-C8、QTX-D7、YQY-E18和QTX-D17显示出良好的自溶性。苑伟[36]从楼兰酒厂自然发酵的葡萄汁中分离得到的11株酿酒酵母菌株,其中10株都有良好的自溶能力。郭晶晶[37]对分离自山西戎子酒庄5个主栽品种的14株酿酒酵母进行自溶性研究,所有的酿酒酵母均具有良好的自溶性。分离自意大利北部的高自溶菌株F6789,能显著提高葡萄酒中酯类和醇类物质含量,提升了香气复杂度[38]。因此,筛选具有自溶潜力的菌株是提高葡萄酒中酵母自溶效率、调控葡萄酒感官特征的有效策略,为本土酵母在葡萄酒生产中的应用提供理论支持[39]。
综上所述,本研究通过对贺兰山东麓优选本土酿酒酵母的生理特性进行综合分析,筛选出了具有嗜杀性强、低产泡、中絮凝性、高自溶性的2株本土酿酒酵母菌株QTX-D16和YQY-E18,为贺兰山东麓葡萄酒产区提供了具有地域特色的优质酵母资源,具有应用于实际葡萄酒生产发酵过程的潜力,可为开发特色葡萄酒产品提供新的微生物资源选择。
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