随着经济发展水平日益提高,我国渔业生产持续、高速增长,近年来水产品产量不断增长,水产品加工逐步成为中国渔业的支柱产业。鱼类加工业产生的副产物超过总产量的60%～70%。然而,全世界每年有超过2 000万t的鱼类加工副产品被丢弃,约占鱼总质量的70%,包括鱼皮、鱼鳞、鱼头、鱼尾和内脏等,导致了食物浪费、环境恶化等问题[1]。鳕鱼是目前世界上捕捞量较大的鱼种之一,具有极高的经济价值,其加工过程中的副产物鳕鱼皮富含优质胶原蛋白,产量约占鳕鱼的10%。然而,鳕鱼皮存在的严重腥味问题影响了市场接受度,成为制约该类产品开发的关键技术瓶颈。
槲皮素是一种具有较强抗氧化能力的天然化合物,其通过多种机制清除自由基、调节抗氧化酶体系以及抑制氧化酶活性来发挥作用。根据联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives,JECFA)的功能类别,槲皮素可以用作着色剂,改善食品色泽。对于槲皮素如何改善食品的营养品质及风味,具有重要的研究价值[2]。FAN等[3]研究发现槲皮素可显著降低大豆油中释放的醛类物质进而改善大豆油的风味特征。2次油炸作为一种常用的热加工方式,通常使食物外皮酥脆、内部嫩滑,通过第1次中低温度油炸(约130～160 ℃)使食物内部熟透、定型,同时避免外皮焦糊;第2次高温复炸,达到改善风味特征的效果。然而目前对槲皮素水溶液浸泡结合2次油炸的复合加工方式研究较少。
溶剂辅助蒸发(solvent-assisted flavor evaporation,SAFE)是一种可以高效萃取和分离挥发性化合物的萃取技术,通过在高真空条件下用适当的溶剂在低温下富集食品挥发性成分,提高分离效率,防止某些化合物在高温下分解,具有对挥发性成分提取更全面的优点,提取物的感官特性接近天然样品[4]。气相色谱-嗅闻-质谱(gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry,GC-O-MS)是将嗅闻仪和气相色谱-质谱检测结合起来的分析技术,可以同时明确待测物质的化学组成以及感官特征[5]。因此,本研究以鳕鱼皮作为研究对象,采用槲皮素水溶液浸泡结合2次油炸的复合加工方式,通过定量描述分析(quantitative description analysis,QDA)、SAFE、GC-O-MS、气味活性值(odor activity value,OAV)、正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA)等方法系统鉴定其不良风味物质组成,探究风味形成与调控机制,旨在为水产品风味特征提升提供理论依据和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
生鲜鳕鱼皮,漳州市台旺食品有限公司;棕榈油,天益佳工厂;槲皮素,河南豫万邦化工科技有限公司。
色谱级试剂:癸酸乙酯、正构烷烃(C8～C20)、乙醇、二氯甲烷、己醛、2-环戊烯酮、庚醛、(E)-2-庚烯醛、1-辛烯-3-醇、辛醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反-2-辛烯醛、2-壬酮、顺-6-壬烯醛、壬醛、3-壬烯-2-酮、反-2-壬烯醛、二羟二乙丁醚、癸醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、β-环柠檬醛、十一醛、反,反-2,4-癸二烯醛、α-紫罗兰酮、香叶基丙酮、1-十五烯、2,4-二叔丁基苯酚、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯、十四醛、1-十八烯、十六醛、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯,Sigma Aldrich公司;十九酸甲酯,上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
QP-2020 Plus GC-MS、Rtx-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)、QP-2010 Plus GC-MS、Rtx-5MS色谱柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm),日本岛津公司;SAFE溶剂辅助蒸发装置,德国Glasblaserei Bahr公司;HH-1数显恒温水浴锅,国华电器有限公司;XB-CPJ高速多功能粉碎机,永康市久品工贸有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品制备
将在-20 ℃冻藏的鳕鱼皮于4 ℃冷藏冰箱自然解冻12 h。分别将鱼皮在40 ℃下纯水和0.8 g/L槲皮素水溶液浸泡40 min后,用厨房纸吸去鱼皮表面的水分,用4 L棕榈油进行2次油炸,第1次150 ℃ 油炸5 min,第2次180 ℃油炸1 min,炸完后迅速用离心机脱油30 s,将所得样品充氮密封低温保存。
1.3.2 QDA
根据相关文献[6]及GB/T 10220—2012《感官分析 方法学 总论》和ISO8589《感官分析-试验室设计的一般指南》设计感官评价实验。感官评价小组由10名评委组成,3名男性和7名女性组成(年龄为20～25岁),小组成员经过讨论确定腥味、花香、果香、油脂味、青草味为油炸鳕鱼皮样品的感官轮廓,气味强度采用5分制(0分无气味,5分气味最强)。准确称取1 g样品进行感官评价。
1.3.3 挥发性化合物的提取和检测
将油炸后的鳕鱼皮粉碎,进行挥发性化合物的提取。参照LIU等[7]的方法,取7 g于250 mL锥形瓶中,其次将100 mL二氯甲烷溶液和2.5 μL 1 000 mg/L内标物癸酸乙酯溶液放入250 mL锥形瓶中混合,在200 r/min的磁力搅拌器下搅拌12 h,收集提取液后,定容体积为100 mL;将提取液转移至SAFE装置中,恒温水浴温度为40 ℃,通过给装置添加液氮使压力达到5×10-3 Pa,进样后液封30 min完成SAFE萃取。经无水硫酸钠除水及氮吹浓缩至1 mL后通过GC-O-MS进行定性定量分析。
色谱条件:载气为高纯度氦气(纯度为99.999%),柱流量2 mL/min,不分流进样。升温程序:进样口温度为250 ℃,以10 ℃/min的速度升温至270 ℃保持5 min。
质谱条件:离子源温度230 ℃,接口温度150 ℃,扫描方式设置为SCAN模式进行定性分析,离子碎片的扫描范围为35～500 m/z。溶剂延迟时间为3 min。定量分析时质谱扫描方式设为SIM模式。
1.3.4 挥发性化合物的定性定量分析
挥发性化合物的定性分析:对比质谱数据库并计算待测化合物的保留指数(retention index, RI)并与文献中报道的RI对比定性。RI的计算参照VANDEN DOOL等[8]的方法,如公式(1)所示:
(1)
式中:RIx,目标化合物的保留指数;RTx,目标化合物的保留时间,min;RTn+1、RTn,目标化合物出峰前后相邻2个正构烷烃的出峰时间,min。
挥发性化合物的定量分析:配制加入等量内标的9种不同浓度梯度的混合挥发性化合物标准品,建立SIM模式方法,根据上述GC-MS条件进行挥发性化合物鉴定,确定各挥发性化合物的标准曲线。其余无标准品进行定量分析的挥发性风味物质选择癸酸乙酯作为内标物,采用内标法进行定量。采用内标法进行定量分析,根据癸酸乙酯的浓度计算待测物的含量,计算如公式(2)所示:
待测物浓度
(2)
1.3.5 气味活性化合物的OAV分析
通过OAV确定油炸鳕鱼皮关键挥发性化合物:用OAV对油炸鳕鱼皮的关键挥发性化合物进行分析,当OAV≥1时,该挥发性化合物可能对样品整体气味影响较大,当OAV<1时,该挥发性化合物对样品整体气味特征影响较小。计算如公式(3)所示:
(3)
式中:c,目标化合物的含量,μg/kg;OT,目标化合物在水中的嗅觉阈值,μg/kg。
1.3.6 挥发性化合物的GC-O鉴定
GC-O条件与上述GC-MS条件保持一致。分离柱洗脱(分流比设置为1∶1),挥发性化合物在MS和GC-O检测器之间平均分配。GC-O嗅闻仪的温度保持在200 ℃。评估人员感知香气化合物,记录描述词和保留时间,确定香气特征。
邀请由9名感官评价人员(5名男性和4名女性)参加GC-O分析实验。每位小组成员都每周参加2次感官培训,至少持续1个月。小组成员识别和记录他们闻到的每种气味,感知分数范围为1～5(1:弱;2:较弱;3:中等;4:强;5:非常强)。
1.3.7 游离脂肪酸的检测
参照HUANG等[9]的方法并作适当修改。
1)游离脂肪酸的提取:精确称取2 mg十九酸甲酯和0.5 g油炸鳕鱼皮于2 mL离心管中,加入1 mL CHCl3-CH3OH溶液(体积比2∶1),超声波提取30 min(26 ℃,60 Hz)后12 000 r/min离心5 min(4 ℃),收集有机相,氮吹至恒重得到脂肪酸,放于冰箱4 ℃冷藏备用。
2)脂肪酸甲酯化:将脂肪酸移入15 mL离心管中,加入1 mL 0.5 mol/L KOH-CH3OH溶液,涡旋混匀后置于65 ℃水浴中皂化10 min直至油滴完全溶解;加入1 mL 体积分数10% H2SO4-CH3OH 溶液,置于65 ℃水浴中甲酯化30 min;取出冷却至室温,加入1.2 mL正己烷,0.6 mL甲基叔丁基醚,2 mL饱和NaCl溶液,涡旋振荡充分混匀3 min;放置分层后,收集上清液正己烷相,加入过量无水硫酸钠静置除水12 h;用0.22 μm孔径有机滤膜过滤,置于4 ℃冷藏备用;用色谱级正己烷稀释100倍进行GC-MS测定。
3)游离脂肪酸的GC-MS检测条件:进样口温度250 ℃,不分流进样,压力为191.3 kPa,总流量15.0 mL/min,柱流量3.83 mL/min,线速度51.5 cm/s,吹扫流量5.0 mL/min。升温程序为柱箱初始温度100 ℃,保持7 min:以10 ℃/min 速率升温到180 ℃,保持6 min;以1 ℃/min速率升温到200 ℃后以4 ℃/min升温到230 ℃,保持6 min,总程序时间54.50 min。MS条件为离子源温度230 ℃,接口温度250 ℃,溶剂延迟时间5.2 min,采集方式设定为Scan模式,扫描范围为35～500 m/z。以十九酸甲酯进行内标法定量计算。
1.4 统计分析
通过Microsoft Office Excel 2010软件计算试验数据的平均值和标准偏差,并绘制图表;使用SPSS 27执行单因素方差分析;使用Rstudio2024绘制热图,使用Simca 14.0用于变量投影重要性(variable importance in projection,VIP)分析。
2 结果与分析
2.1 感官评价
风味特征在水产品中具有重要作用,是评价其感官品质的重要指标。本研究对对照组和槲皮素处理组进行定量描述性感官评价。如图1所示,油炸鳕鱼皮的风味特征主要为“油脂味”、“果香”、“青草味”、“花香”、“腥味”。相对于对照组,槲皮素处理组的腥味、油脂味有所降低,花香、果香有所增加。LIU等[10]研究了迷迭香提取物浸渍液对鲣鱼肉挥发性化合物的影响,发现迷迭香提取物浸渍液通过吸附鱼腥物质和减少脂质氧化的双重作用机制,有效减弱鱼腥味。槲皮素水溶液与迷迭香提取物浸渍液消减腥味的机制相似,均可通过抗氧化作用减少醛类物质生成进而降低腥味,进而减弱不良风味[11]。因此,槲皮素处理能够减弱油炸鳕鱼皮的“油脂味”、“腥味”等不良风味,改善油炸鳕鱼皮的风味特征。对于槲皮素对油炸鳕鱼皮风味特征的影响需要更进一步的研究。
图1 油炸鳕鱼皮感官评价雷达图
Fig.1 Radar map for organoleptic evaluation of fried cod skin
2.2 挥发性化合物定性定量分析
通过SAFE、GC-MS检测和分析油炸鳕鱼皮挥发性化合物,确定具体的挥发性成分的种类和含量如表1所示。
表1 油炸鳕鱼皮挥发性化合物鉴定结果
Table 1 Identification of volatile compounds extracted from fried cod skin
序号分类编号挥发性化合物名称保留时间/minRIaRIb特征离子碎片定性方法对照组槲皮素处理组1A1己醛7.48 802.85 803.00 56,72,83MS RI Std31.95±4.4a29.67±4.57a2A2庚醛11.26 900.47 901.00 41,70,86MS RI Std11.84±1.13a8.27±0.54b3A3(E)-2-庚烯醛13.56 955.18 956.00 41,70,83MS RI Std37.67±3.65a18.40±5.16b4A4辛醛15.48 1 000.71 1 001.00 41,69,84MS RI Std57.96±8.62a56.63±7.54a5A5反,反-2,4-庚二烯醛15.84 1 009.35 995.00 39,81, 110MS RI Std4.30±0.3a4.30±0.51a6A6反-2-辛烯醛17.75 1 056.13 1 056.00 41,70,83MS RI Std19.41±1.59a7.50±1.91b7A7顺-6-壬烯醛19.28 1 093.61 1 101.00 41,67,98MS RI Std2.89±0.31a2.77±0.69a8A8壬醛19.64 1 102.61 1 103.00 41,70,98MS RI Std299.27±72.29a164.79±53.51a9A9反-2-壬烯醛21.78 1 158.26 1 158.00 43,70,83MS RI Std17.01±1.29a11.96±1.94b10A10癸醛23.51 1 203.98 1 204.00 57,70, 112MS RI Std33.78±12.68a36.42±2.78a11A11(E,E)-2,4-壬二烯醛23.88 1 215.37 1 215.00 41,81, 138MS RI Std2.53±0.26a2.20±0.16a12A12β-环柠檬醛24.05 1 220.29 1 220.00 41, 123, 137MS RI Std2.59±0.42a1.38±0.34b13A13反式-2-癸烯醛25.45 1 262.85 1 263.00 55,70,83MS RI15.78±2.52a6.78±1.68b14A14十一醛26.83 1 305.92 1 305.00 57,82,96MS RI Std115.91±20.83a102.75±12.6a15A15反,反-2,4-癸二烯醛27.23 1 320.86 1 320.00 41,81,83MS RI Std159.72±11.42a41.29±7.28b16A162-十一烯醛28.41 1 364.35 1 368.00 41,70,34MS RI16.94±0.89a6.43±0.97b17A17反式4,5-环氧基-2-癸烯醛28.83 1 379.77 1 380.00 39,68,99MS RI4.23±0.5a2.67±0.39b18A18十二烷醛29.55 1 407.34 1 407.00 41,82,96MS RI1.11±0.33a1.09±0.18a19A19十四醛34.05 1 611.53 1 611.00 57,82,96MS RI Std7.06±0.64a7.57±0.55a20A20十六醛37.85 1 815.57 1 818.00 57, 68, 82MS RI Std7.79±1.48b15.10±1.62a21A21十八醛41.20 2 017.09 2 017.00 43, 82, 96MS RI0.00±0b1.57±0.34a22B11-辛烯-3-醇14.55 978.57 979.00 57, 72, 85MS RI Std0.00±0b4.79±0.49a23B2异辛醇16.63 1 028.74 1 029.00 41, 68, 93MS RI0.00±0b21.54±3.28a24B31-十三醇33.36 1 577.70 1 575.00 55, 69, 83MS RI0.58±0.08a0.43±0.06b25C12-环戊烯酮8.51 829.50 834.90 39, 82, 83MS RI Std44.47±5.3a48.02±2.86a26C22-壬酮19.05 1 088.03 1 088.00 58, 71, 142MS RI Std0.82±0.26a0.86±0.14a27C33-壬烯-2-酮20.93 1 136.19 1 136.00 55, 97, 125MS RI Std2.88±0.51a1.47±0.12b28C42-癸酮22.97 1 189.50 1 191.00 43, 58, 98MS RI0.00±0b3.89±1.24a29C52-十一酮26.38 1 291.07 1 291.00 43, 58, 85MS RI0.63±0.32a0.93±0.19a30C6α-紫罗兰酮29.92 1 423.34 1 424.00 43, 93, 121MS RI Std1.63±0.12a1.37±0.25a31C7香叶基丙酮30.46 1 446.46 1 451.00 43, 69, 107MS RI Std6.01±1.21a4.55±0.27b32C83,4-脱氢-β-紫罗兰酮31.20 1 477.99 1 485.30 43, 175, 190MS RI2.86±0.49a1.60±0.59b33D1二氢猕猴桃内酯32.47 1 535.48 1 535.00 67, 111, 137MS RI4.58±0.53a3.51±0.55b34D22,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯33.54 1 586.24 1 587.50 43, 71, 111MS RI Std10.13±1.38a9.76±1.12a35D3十五氟辛酸十八烷基酯37.43 1 791.52 1 817.90 57, 69, 97MS RI1.20±0.21a1.48±0.34a36D4邻苯二甲酸二异丁酯38.59 1 858.48 1 865.00 57, 76, 149MS RI Std3.07±0.38a3.13±1.36a37D53,5-二(1,1-二甲基乙基)-4-羟基苯丙酸甲酯39.76 1 928.50 1 943.30 147, 219, 277MS RI1.51±0.36b3.21±1.16a38D6邻苯二甲酸二丁酯40.18 1 953.76 1 957.00 41, 76, 149MS RI Std4.87±0.85a5.00±1.72a39D74,8,12,16-四甲基十七烷基-4-内酯46.09 2 338.55 2 364.20 43, 69, 99MS RI3.30±0.69a3.36±0.62a40E1长叶烯29.74 1 415.66 1 415.70 41, 79, 91MS RI0.74±0.32a0.77±0.23a41E2(E)-β-金合欢烯30.59 1 451.79 1 452.00 41, 69, 93MS RI2.77±0.34a2.48±0.31a42E31-十五烯31.37 1 485.11 1 488.00 55, 69, 83MS RI Std12.69±1.56a10.62±1.64b43E48-十七烷烯35.30 1 676.00 1 677.00 55, 69, 83MS RI3.22±0.36a2.47±0.54b44E51-十八烯37.23 1 780.33 1 788.00 57, 69, 83MS RI Std1.69±0.09a1.39±0.09b45E6新植二烯38.17 1 834.23 1 836.00 57, 68, 95MS RI3.13±0.34a2.82±0.43a46F1十一烷19.46 1 097.94 57, 71, 85MS Std1.49±0.46a1.50±0.15a47F2十二烷23.31 1 198.28 57, 71, 85MS Std2.61±0.99a2.55±0.45a48F33-甲基十三烷28.56 1 369.86 1 371.00 57, 71, 85MS RI2.27±0.75a1.91±0.54a49F4十四烷29.33 1 398.34 57, 71, 85MS Std5.52±0.48b6.72±0.81a50F54-甲基十四烷30.69 1 455.97 1 460.00 57, 71, 85MS RI0.46±0.05a0.53±0.1a51F62,6,10-三甲基十三烷30.74 1 458.32 1 465.10 57, 71, 85MS RI0.35±0.07b0.57±0.11a
续表1
序号分类编号挥发性化合物名称保留时间/minRIaRIb特征离子碎片定性方法对照组槲皮素处理组52F73-甲基十四烷31.00 1 469.20 1 470.00 57, 71, 85MS Std1.57±0.33a1.80±0.32a53F8十五烷31.67 1 498.08 57, 71, 85MS Std10.55±1.49a10.18±1.27a54F93-甲基十五烷33.18 1 569.35 1 570.00 57, 71, 85MS RI1.35±0.19a1.49±0.07a55F10十六烷33.78 1 597.96 57, 71, 85MS Std9.21±1.66a10.01±1.03a56F11十七烷35.74 1 698.71 57, 71, 85MS Std8.90±1.82a8.51±1.57a57F122,6,10,14-四甲基十五烷35.81 1 702.53 1 707.00 57, 71, 85MS RI3.40±0.49b5.51±0.88a58F133-甲基十七烷37.03 1 769.31 1 771.00 57, 71, 85MS RI1.19±0.2a0.64±0.1b59F14正十八烷37.54 1 797.74 57, 71, 85MS Std5.19±1.2b6.69±1.3a60F152,6,10,14-四甲基十六烷37.65 1 804.14 1 808.00 57, 71, 85MS RI3.07±0.45a3.72±0.69b61F16正十九烷39.25 1 897.43 57, 71, 85MS Std3.72±1.34a5.84±1.24a62F173-甲基十九烷40.42 1 968.81 1 968.00 57, 71, 85MS RI1.60±0.7a5.35±2.66b63F183-甲基二十一烷43.50 2 165.87 2 173.00 57, 71, 85MS RI0.89±0.09a0.94±0.32a64F19二十四烷46.89 2 388.11 57, 71, 85MS Std3.25±1.67a2.59±1.54a65F20二十五烷48.74 2 486.87 57, 71, 85MS Std6.03±3.47a4.90±1.86a66G1麦芽酚19.80 1 106.70 1 106.00 57, 75, 87MS RI0.00±0b2.85±0.44a67G2二羟二乙丁醚22.78 1 184.42 1 188.00 57, 75, 87MS RI Std66.13±10.39a115.76±25.4b68G3己内酰胺25.37 1 260.48 1 266.00 55, 85, 113MS RI12.10±1.85b43.80±23.14a69G42,3-二氢-1,1,4,5-四甲基-1H-茚28.28 1 359.69 1 355.00 128, 144, 159MS RI13.71±1.23a11.18±2.01b70G52,6-二甲基萘29.60 1 409.81 1 409.00 115, 156, 157MS RI1.30±0.45a1.20±0.09a71G62,4-二叔丁基苯酚31.91 1 508.92 1 509.00 57, 191, 206MS RI Std9.96±1.23b17.71±4.74a72G7棕榈酸40.29 1 960.73 1 963.00 43, 73, 256MS RI5.43±1.28a7.34±2.61a73G8[3R-(3α,4aβ,6aα,10aβ,10bα)]-3-乙烯基-3,4a,7,7,10a-五甲基十二氢-1H-萘并[2,1-b]吡喃41.09 2 010.23 2 011.00 81, 257, 279MS RI1.69±0.44a1.70±0.46a74G9十六碳酰胺43.66 2 176.19 2 182.00 43, 59, 97MS RI52.00±14.77b98.45±38.1a75G10(S)-3-甲基-5-[(1R,4aR,8aR)-5,5,8a-三甲基-2-亚甲基十氢萘-1-基]戊酸45.28 2 286.70 2 297.40 81, 95, 137MS RI26.47±5.2a22.60±5.31a76G11十八酰胺46.70 2 376.66 2 398.00 59, 72, 86MS RI6.42±1.84a7.75±2.91a
注:不同小写字母表示显著性差异(P<0.05)(下同);RIa表示根据正构烷烃计算出的保留指数,RIb表示查询到的保留指数;Std表示标准品定性。
通过对挥发性化合物进行定性定量研究(表1),绘制油炸鳕鱼皮挥发性化合物种类极坐标条状图(图2-a)和环状聚类分析热图(图2-b)。对照组中鉴定出71种化合物,包括醛类(20种)、烷烃(20种)、酮类(7种)、酯类(7种)、烯烃(6种)、醇类(1种)及其他物质(10种);槲皮素处理组中鉴定出76种化合物,包括醛类(21种)、烷烃(20种)、酮类(8种)、酯类(7种)、烯烃(6种)、醇类(3种)及其他物质(11种)。
a-油炸鳕鱼皮挥发性化合物种类极坐标条状图;b-油炸鳕鱼皮挥发性化合物标准化聚类分析热图
图2 油炸鳕鱼皮挥发性化合物鉴定
Fig.2 Identification of volatile compounds in fried codfish skin
注:图中:A:醛类;B:醇类;C:酮类;D:酯类;E:烯烃;F:烷烃;G:其他。
2组油炸鳕鱼皮中,醛类和烷烃是种类和含量最多的化合物。槲皮素处理能够减少反,反-2,4-癸二烯醛、反-2-辛烯醛等醛类物质的生成。其中,醛的阈值低,通常是油脂氧化分解的产物[12]。有研究表明,己烯醛、辛烯醛、庚二烯醛、4-庚烯醛和2,4-己二烯醛等醛类物质被认为是气味恶化的特征挥发性标志物[13]。油炸过程中高温会加速油脂的氧化,尤其是多不饱和脂肪酸的氧化,生成如己醛、壬醛等醛类化合物,这些醛类物质不仅影响食品的风味,还可能与美拉德反应相互作用,进一步生成其他风味物质[14]。2组样品中烷烃种类和含量较多,烷烃的来源可能包括原料中脂肪的高温分解、食品加工过程中的热解反应(如蛋白质或碳水化合物的高温降解),以及可能与提取方法有关[15];此外,饱和脂肪酸(如棕榈酸)热解生成烷烃类物质也可能样品中烷烃的来源;然而,烷烃的阈值通常很高,对风味的贡献很小[16]。相较于对照组,槲皮素处理组中3-壬烯-2酮、3,4-脱氢-β-紫罗兰酮、香叶基丙酮含量减小,2-癸酮含量增加。酮在含量较低时有一种令人愉悦的香味,但在含量较高时,会有一种刺激性的气味[17]。其中,紫罗兰酮具有花香、果香、木香的气味特征;香叶基丙酮具有令人愉悦的香气;有研究发现煎煮和油炸样品中2-壬酮含量较为突出对风味有积极作用[18]。相较于对照组,槲皮素处理组中二氢猕猴桃内酯含量减小。酯类化合物也具有令人愉悦的气味特征。其中,二氢猕猴桃内酯具有香豆素和麝香的香气。相较于对照组,槲皮素处理组中1-十五烯、8-十七烷烯和1-十八烯含量减小。(E)-β-金合欢烯是一种萜烯类化合物,具有较高的化学反应活性,能够参与加成反应、氧化反应和还原反应,也具有香气。2组样品中醇类化合物的种类最少,相较于对照组,槲皮素处理组中醇类含量增加。其中,1-辛烯-3-醇的阈值较低,具有“蘑菇味”、“泥土味”[19]。2组油炸鳕鱼皮中酯类化合物含量较多,也可能来源于样品中酸和醇的转化[20]。吡嗪类物质通常由美拉德反应或热解反应生成,其形成依赖于氨基酸(尤其是含氮化合物)与还原糖在高温下的相互作用。有研究表明,在鱼类加工中,美拉德反应常被脂质氧化反应掩盖,导致风味化合物以醛类为主,而非吡嗪类[21]。
因此,槲皮素处理主要减少了反,反-2,4-癸二烯醛、反-2-辛烯醛等醛类物质的生成,增加了1-辛烯-3-醇、异辛醇等醇类物质的产生,为明确槲皮素对关键挥发性物质对整体气味特征的影响,还需结合GC-O进一步分析。
2.3 挥发性化合物OAV和GC-O分析
挥发性化合物对整体气味的影响不仅取决于浓度,还取决于气味阈值。OAV≥1的化合物可能是对样品有重要贡献的风味化合物,OAV越高,对整体气味的贡献就越大。结合OAV(即水中浓度与气味阈值的比值)和GC-O分析评估挥发性化合物对整体气味的贡献程度(表2)。
表2 油炸鳕鱼皮挥发性化合物OAV和GC-O分析
Table 2 Volatile compound OAV and GC-O analysis of fried cod skin
序号保留时间/min中文名称阈值/(μg/kg)OAV对照组槲皮素处理组气味类型17.48 己醛5.00 6.390 5 5.934 3 —211.26 庚醛2.80 4.227 3 2.955 2 青草味*313.56 (E)-2-庚烯醛40.00 <1<1—414.55 1-辛烯-3-醇1.50 —3.193 9 金属味515.48 辛醛0.59 98.747 8 96.478 3 —615.84 反,反-2,4-庚二烯醛3.00 1.434 6 1.433 7 —716.63 异辛醇25 482.20 —<1—817.75 反-2-辛烯醛3.00 6.4703 2.501 0 油脂味919.05 2-壬酮41.00 <1<1—1019.28 (Z)-6-壬烯醛0.005 0 2.891 4 2.768 3 花香味1119.46 十一烷10 000<1<1—1219.64 壬醛1.10 272.065 3 149.807 9 脂肪味、青草味1319.80 麦芽酚1 240.00 —<1—1420.93 3-壬烯-2-酮800.00 <1<1酸臭味1521.78 反-2-壬烯醛0.19 89.546 0 62.956 5 霉味、皮革味1622.78 二羟二乙丁醚800.00 <1<1—1722.97 2-癸酮8.30 —<1青草味、薄荷味1823.31 十二烷10 000.00 <1<1—1923.51 癸醛3.00 11.260 6 12.138 7 —2023.88 (E,E)-2,4-壬二烯醛0.10 25.346 4 21.964 2 油脂味、蘑菇味2124.05 β-环柠檬醛3.00 <1<1—2225.37 己内酰胺59 700.00 <1<1—2325.45 反式-2-癸烯醛17.00 <1<1酸臭味2426.38 2-十一酮5.50 <1<1—2526.83 十一醛12.50 9.272 4 8.220 0 —2627.23 反,反-2,4-癸二烯醛0.03 5 915.715 6 1 529.139 5 油脂味2728.41 2-十一烯醛0.78 21.722 6 8.248 6 —2828.83 反式4,5-环氧基-2-癸烯醛0.22 19.219 2 12.125 4 金属味、铁锈味2929.33 十四烷10 000<1<1—3029.55 十二烷醛0.13 8.504 3 8.364 5 甜香、奶香3129.60 2,6-二甲基萘10.00 <1<1—3229.92 α-紫罗兰酮3.78 <1<1—3330.46 香叶基丙酮60.00 <1<1—3430.59 (E)-β-金合欢烯87.00 <1<1—3531.37 1-十五烯3 600.00 <1<1花香、甜香3631.91 2,4-二叔丁基苯酚500.00 <1<1—3733.54 2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯14.00 <1<1—3834.05 十四醛110.00 <1<1—
注:*表示未嗅闻到但文献报道的气味特征;“—”表示GC-O未嗅闻到气味。
OAV和GC-O分析结果表明,对照组中共有15种挥发性化合物的OAV>1,均为醛类物质;槲皮素处理组中共有16种挥发性化合物的OAV>1,其中15种为醛类物质,1种为醇类物质。相较于对照组,通过槲皮素处理后,呈现“青草味”、“薄荷味”的庚醛、2-癸酮OAV有所增加;呈现“油脂味”的反-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛等物质的OAV有所减小;呈现“金属味”、“酸臭味”、“霉味”等气味特征的反式4,5-环氧基-2-癸烯醛、3-壬烯-2-酮、反-2-癸烯醛、反-2-壬烯醛等物质的OAV有所减小;呈现“花香味”的(Z)-6-壬烯醛的OAV有所减小。此外,1-辛烯-3-醇(金属味)OAV虽增加,然而由于样品中其他风味物质的贡献和影响,使得1-辛烯-3-醇对整体的风味改变并不显著。
有研究表明,短链醛通常具有“青草味”,随着碳原子的积累,长链醛通常具有“油脂味”[22]。其中,己醛、庚醛、辛醛和壬醛等在鲢鱼和金枪鱼中被认为是由亚油酸或亚麻酸的热氧化或降解产生的,通常具有“青草味”[23],(E,E)-2,4-壬二烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛和2-十一烯醛具有“油脂味”[24];反式4,5-环氧基-2-癸烯醛具有腐败的刺激性气味,常被描述为“金属味”、“血腥味”等[25]。(Z)-6-壬烯醛具有“柑橘味”、“甜瓜味”。OAV和GC-O分析明确了槲皮素处理前后的关键挥发性化合物,但其差异性还需进一步分析。
2.4 挥发性化合物的多元统计分析
为了有效分析槲皮素处理前后油炸鳕鱼皮关键挥发性化合物的差异性,对21个关键挥发性化合物进行OPLS-DA,结果如图3-a和图3-b所示,模型自变量的拟合优度
为0.86,因变量的拟合优度
为0.99,预测能力(Q2)为0.94,在200次排列测试之后,Q2回归线截距被确定为负值,这些结果表明模型具有较高的拟合度和预测能力。
a-油炸鳕鱼皮挥发性化合物OPLS-DA图;b-油炸鳕鱼皮挥发性化合物OPLS-DA置换检验图;c-油炸鳕鱼皮挥发性物质VIP值柱形图
图3 油炸鳕鱼皮挥发性化合物的OPLS-DA
Fig.3 OPLS-DA of volatile compounds in fried cod skin
VIP分析可用于评估变量成分对样品的贡献程度,VIP值>1表明上述代谢物对样品有显著贡献[26]。采用VIP值分析21种关键挥发性化合物(图4-c),VIP值>1的化合物有2-十一烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、反-2-辛烯醛、3-壬烯-2-酮、反式4,5-环氧基-2-癸烯醛、反式-2-癸烯醛、反-2-壬烯醛、壬醛和庚醛等,其中,壬醛不具有显著性差异,筛选出VIP值>1且P<0.05的关键差异挥发性化合物。醛类物质作为槲皮素处理组与对照组的主要差异挥发性化合物,可能通过脂质氧化降解影响油炸鳕鱼皮的风味特征,因此,后续对油炸鳕鱼皮中游离脂肪酸进行进一步分析。
a-油炸鳕鱼皮游离脂肪酸的OPLS-DA图;b-油炸鳕鱼皮游离脂肪酸的OPLS-DA置信检验图;C-油炸鳕鱼皮游离脂肪酸VIP值柱形图
图4 油炸鳕鱼皮游离脂肪酸的OPLS-DA
Fig.4 OPLS-DA analysis of free fatty acids in fried cod skin
2.5 游离脂肪酸分析
游离脂肪酸是风味的前体物质,可以氧化生成醛和酮等物质,对食品风味的形成起着关键作用。对照组和槲皮素处理组共鉴定出16种游离脂肪酸,其中饱和脂肪酸8种,单不饱和脂肪酸5种,多不饱和脂肪酸3种,各组的脂肪酸种类并无差异。根据游离脂肪酸定量结果(表3)可知,槲皮素能够抑制油炸鳕鱼皮中除癸酸、月桂酸以外其他游离脂肪酸的氧化。
对16种游离脂肪酸进行OPLS-DA,结果如图4-a和4-b所示,
为0.986,即
为0.982,Q2为0.895,在200次排列测试之后,Q2回归线截距被确定为负值,结果表明模型具有较高的拟合度和预测能力。
表3 油炸鳕鱼皮游离脂肪酸含量分析
Table 3 Analysis of free fatty acid content in fried cod skin
脂肪酸含量/(mg/g)对照组槲皮素处理组癸酸0.06±0.01a0.06±0.01a月桂酸0.77±0.02a0.80±0.09a十四烷酸2.45±0.15a2.97±0.27b十五烷酸0.08±0.01a0.11±0.01b顺-9-十六烯酸0.47±0.05a0.62±0.04b棕榈酸60.66±3.27a73.59±10.42b十七烷酸0.16±0.01a0.21±0.01b亚油酸28.43±1.78a34.91±3.41b顺-9-十八碳烯酸94.29±5.46a114.95±13.64b顺-13-十八烯酸0.32±0.03a0.41±0.03b十八烷酸9.70±0.71a12.27±1.01b二十碳五烯酸0.05±0.01a0.15±0.02b顺-11-二十碳烯酸0.80±0.06a1.04±0.22b二十烷酸0.86±0.07a1.11±0.06b二十二碳六烯酸0.10±0.01a0.20±0.03b二十二烷酸0.15±0.01a0.19±0.00b
如图5-c所示,对照组与槲皮素处理组的差异脂肪酸为二十碳五烯酸、十七烷酸、二十二碳六烯酸、顺-9-十六烯酸、十五烷酸、二十烷酸、十八烷酸、顺-13-十八烯酸、十四烷酸、亚油酸,进一步证实了槲皮素对二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸等n-3多不饱和脂肪酸的氧化具有显著地抑制作用,与HUBER等[27]的研究结果一致。
图5 KEGG通路富集图
Fig.5 Analysis of KEGG pathway enrichment of free fatty acids
2.6 KEGG通路富集分析及游离脂肪酸转化途径分析
为了更好地了解不同组别挥发性化合物和游离脂肪酸之间的关系,将筛选出的关键差异挥发性化合物和差异脂肪酸做进行KEGG通路富集分析(图5)可知,不饱和脂肪酸生物合成、亚油酸代谢和脂肪酸生物合成通路富集,表明这些代谢途径在槲皮素水溶液浸泡处理对油炸鳕鱼皮的风味特征中可能起到关键作用。其中,二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸等长链n-3多不饱和脂肪酸被认为是鱼类中影响风味特征的重要脂肪酸[28]。槲皮素处理可能通过清除自由基和螯合金属离子抑制二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸氧化,进而减少具有“油脂味”的庚醛的生成[29]。槲皮素可能通过抑制脂氧合酶活性或阻断自由基链式反应,进一步抑制亚油酸氧化生成具有“青草味”的庚醛、具有“油脂味”的反式-2-辛烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、具有“霉味”的反式-2-壬烯醛、具有“铁锈味”的反式4,5-环氧基-2-癸烯醛、具有“酸臭味”的反式-2-癸烯醛和3-壬烯-2-酮等挥发性化合物[30]。此外,亚油酸在氧化过程中可以生成多种烯酮类化合物,3-壬烯-2-酮是主要产物之一[31]。
因此,槲皮素通过抑制二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和亚油酸等不饱和脂肪酸的氧化进而减少反式-2-辛烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、反式-2-壬烯醛、反式4,5-环氧基-2-癸烯醛、反式-2-癸烯醛和3-壬烯-2-酮等具有“油脂味”、“霉味”、“铁锈味”和“酸臭味”等具有不良气味特征的物质生成,改善了油炸鳕鱼皮的风味特征(图6)。
图6 槲皮素水溶液浸泡后油炸鳕鱼皮游离脂肪酸潜在代谢途径图
Fig.6 Potential metabolic pathway of free fatty acids in fried cod skin
3 结论
本研究通过QDA、GC-O-MS、OAV等分子感官科学方法,并结合游离脂肪酸分析系统探究了槲皮素处理对油炸鳕鱼皮风味特征的影响。QDA表明,槲皮素处理可有效降低油炸鳕鱼皮的“油脂味”和“腥味”。GC-O和OAV分析表明,槲皮素处理后的油炸鳕鱼皮中,具有“油脂味”的反式-2-辛烯醛和反,反-2,4-癸二烯醛的OAV值降低,具有“腥味”的反式-4,5-环氧基-2-癸烯醛和反-2-壬烯醛等物质的OAV降低。游离脂肪酸分析表明,槲皮素能有效抑制二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和亚油酸等游离脂肪酸的氧化,减少反式-2-辛烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛等“油脂味”物质生成,以及反式-2-壬烯醛、反式4,5-环氧基-2-癸烯醛、反式-2-癸烯醛和3-壬烯-2-酮等“腥味”物质生成。本研究旨在为鳕鱼加工副产物的高值化综合利用提供理论基础。未来可进一步探究与其他天然抗氧化剂的协同作用,以实现更高效的风味改良。此外,也可结合分子对接技术深入解析槲皮素与脂质氧化关键酶的作用机制,为水产品风味定向调控提供新策略。
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